胡祖艷，刀建華，趙 旻

1.西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 景洪 666100

2.四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都 610041

云木香為菊科（Asteraceae）風(fēng)毛菊屬SaussureaDC.植物云木香Saussrurea costus(Falc.) Lipsch.的干燥根，為多年生草本植物，又名青木香、廣木香、興瞿草[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，木香藥用歷史悠久，干燥根入藥，有健脾消食、行氣止痛、止痛、安胎的功效[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，云木香對人體和動物的消化系統(tǒng)[3-6]、呼吸系統(tǒng)[7]、心血管系統(tǒng)[8-9]等方面疾病表現(xiàn)出很好的療效。云木香的化學(xué)成分多樣，目前主要集中在揮發(fā)油成分的研究，為了深入研究云木香的化學(xué)成分，本實(shí)驗(yàn)對云木香干燥根的乙醇提取浸膏石油醚萃取部分進(jìn)行分離純化，從中分離得到1個新的愈創(chuàng)木烷型倍半萜類衍生物，然后運(yùn)用高分辨質(zhì)譜、核磁共振等波譜技術(shù)，并結(jié)合弱堿水解的方法對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，最后鑒定為云木香素A（costusin A，1），它的2個水解產(chǎn)物為3-epizaluzanin C（1a）和正癸酸（1b）。結(jié)構(gòu)見圖1。采用Griess法初步評價(jià)化合物1化合物對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7產(chǎn)生NO的抑制活性。結(jié)果表明，化合物1對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO顯示出中等的抑制作用，半數(shù)抑制濃度（IC50）為21.7 μmol/L。

圖1 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of compound 1

1 儀器與材料

Perkin Elmer Model 341型旋光儀（美國PE公司）；Perkin Elmer one FT-IR型紅外光譜計(jì)（美國PE公司）；Shimadazu UV-2401紫外可見分光光度計(jì)（日本Shimadazu公司）；Bruker Ascend 400型核磁共振儀、Bruker MicrOTOF QII型高分辨率質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）；LC-3000型高效液相色譜儀（北京創(chuàng)新恒通公司）；Kromasil C18反相半制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm）；薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠（中國青島海洋化工廠）；50 μm ODS反相C18填料（日本YMC公司）；50 μm MCI樹脂（日本Mitsubishi Chemical公司）。氘代試劑（美國Sigma Aldrich公司）；色譜純甲醇（天津康科德科技有限公司）；其他分析純化學(xué)試劑（天津富宇精細(xì)化工有限公司）；Griess試劑法NO試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；脂多糖（美國Sigma Aldrich公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）。

云木香藥材為2019年10月購于成都市荷花池中藥市場，由成都中醫(yī)藥大學(xué)郭大樂副教授鑒定為菊科風(fēng)毛菊屬植物云木香S.costus(Falc.) Lipsch.的干燥根，樣本（HX20191002）存放于四川大學(xué)華西醫(yī)院。

2 提取與分離

云木香干燥根4 kg，粉碎后用95%乙醇常溫浸泡提取3次，每次浸提3 d。合并提取液并減壓濃縮至浸膏，得總提取物860 g。將總浸膏分散于5 L熱水中（60 ℃），用等體積的石油醚萃取3次，減壓濃縮得到石油醚浸膏（116 g）。將該石油醚浸膏進(jìn)行MCI柱色譜除色素，以甲醇-水（9∶1）進(jìn)行洗脫，得到浸膏98 g。取該石油醚部位進(jìn)行正相硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（100∶1→50∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢識合并得到6個組分Fr.A～B（6.2 g）采用ODS中低壓柱色譜分離，甲醇∶水（1∶1→3∶2→7∶3→4∶1→9∶1）和甲醇梯度洗脫得到6個組分Fr.B1～B6。Fr.B4（615 mg）經(jīng)半制備HPLC色譜（78%乙腈）等度分離，得到化合物1（13 mg，tR＝31 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末狀固體，[α]20D-45° (c0.2,CHCl3)。HR-ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z:423.250 9 [M＋Na]+（計(jì)算值為423.251 1，C25H36O4Na），由此推測其分子式為C25H36O4。紅外光譜顯示其結(jié)構(gòu)中含有羰基（1 770.97, 1 732.96 cm-1）等基團(tuán)。

1H-NMR譜（表1）顯示36個氫信號，包括6個烯氫信號δH6.26 (1H, d,J= 3.5 Hz), 5.48 (1H, s),5.45 (1H, d,J= 3.1 Hz), 5.33 (1H, s), 4.89 (1H, s) 和4.76 (1H, s)；5個次甲基的氫信號δH5.63 (1H, t,J=6.2 Hz), 3.85 (1H, t,J= 9.1 Hz), 3.01 (2H, m), 2.83(1H, m)；以及11組亞甲基的氫信號δH2.25 (2H, t,J= 7.5 Hz), 2.08 (1H, m)/2.47 (1H, m), 1.86 (1H,m)/2.24 (1H, m), 1.57 (2H, m), 1.34 (1H, m)/2.20 (1H,m) 和1.20～1.28 (12H, m)；另外，高場區(qū)有1個甲基氫信號 [δH0.81 (3H, t,J= 6.8 Hz)]。13C-NMR譜（表1）中有25個碳信號，結(jié)合HMQC譜分析分別歸屬為2個羰基碳信號δC173.4, 169.9；6個烯碳信號δC149.3, 148.1, 139.3, 120.4, 113.3, 115.2；5個次甲基碳信號δC85.0, 75.8, 49.8, 45.2, 44.6，其中存在2個連氧的次甲基碳信號δC85.0, 75.8；11個亞甲基碳信號δC37.3, 36.7, 34.5, 31.8, 31.0, 29.4, 29.3,29.2, 29.0, 24.9, 22.6；以及1個甲基碳信號δC14.0。經(jīng)過文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)其中主要一維譜信號與愈創(chuàng)木烷型倍半萜3-epizaluzanin C[10]的信號非常相似，剩余信號又與正癸酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信號[11]相吻合。因此，初步判斷此化合物的結(jié)構(gòu)特征為愈創(chuàng)木烷型倍半萜母核上連有長鏈飽和脂肪酸。

表1 化合物1的1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 和13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) data for compound 1

然后，通過二維譜對其平面結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定（圖2）。在HMBC譜中，H-1 (δH3.01) 與C-4(δC149.3), C-14 (δC113.3), C-6 (δC85.0), C-3 (δC75.8) 存在遠(yuǎn)程相關(guān)；H-2 (δH1.86, 2.24) 與C-10 (δC148.1), C-5 (δC44.6) 有遠(yuǎn)程相關(guān)；H-5 (δH3.01) 與C-10 (δC148.1), C-7 (δC45.2), C-2 (δC37.3) 存在遠(yuǎn)程相關(guān)；H-6 (δH3.85) 與C-4 (δC149.3), C-1 (δC49.8), C-8 (δC31.0) 有遠(yuǎn)程相關(guān)；另外，結(jié)合1H-1H COSY譜中H-3/H-2/H-1/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9相鄰之間給出的相關(guān)信號；證明了其中五元環(huán)與七元環(huán)是通過1，5位碳進(jìn)行駢合。H-7 (δH2.83) 與C-12 (δC169.9), C-13 (δC120.4), C-5 (δC44.6), C-9 (δC36.7)存在遠(yuǎn)程相關(guān)；H-13 (δH5.45, 6.26) 與C-11 (δC139.3), C-12 (δC169.9), C-7 (δC36.7) 有遠(yuǎn)程相關(guān)，可以推測出異丙烯酸連接在C-7位上并與C-6位羥基形成內(nèi)酯。另外，連在C-4位的雙鍵位置可以根據(jù)H-15 (δH5.33, 5.48) 與C-4 (δC149.3) 和C-3 (δC75.8) 的遠(yuǎn)程相關(guān)信號確定，而連在C-10位的雙鍵位置由H-14 (δH4.76, 4.89) 與C-10 (δC148.1), C-1(δC49.8), C-9 (δC36.7) 的遠(yuǎn)程相關(guān)信號確定。最后，根據(jù)H-3 (δH5.63) 與C-1′ (δC173.4) 的遠(yuǎn)程相關(guān)信號可以確定脂肪酸通過與C-3位羥基形成酯鍵相連。綜上，化合物1的平面結(jié)構(gòu)鑒定為3-epizaluzanin C-3-yl decanoate（圖2）。另外，H-3與H-6的相對構(gòu)型可以通過NOESY譜中H-3 (δH5.63) 與H-6 (δH3.85) 的相關(guān)信號得到判斷（圖3）。

圖2 化合物1的主要HMBC和1H-1H COSY相關(guān)Fig.2 Key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 1

圖3 化合物1的主要NOESY相關(guān)Fig.3 Key NOESY correlations of compound 1

為了對化合物1進(jìn)行完整的結(jié)構(gòu)確證，用0.1 mol/L KOH在常溫中對其進(jìn)行溫和的堿水解，反應(yīng)完成后加酸中和，用CH2Cl2萃取，萃取產(chǎn)物經(jīng)HPLC制備得到水解產(chǎn)物1a和1b。通過與已知化合物3-epizaluzanin C[10]和正癸酸[11]進(jìn)行波譜數(shù)據(jù)及理化性質(zhì)的比對，確定化合物1a和1b分別為3-epizaluzanin C和正癸酸。綜上所述，化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定如圖1所示，經(jīng)Scifinder檢索確定為新的愈創(chuàng)木烷型倍半萜衍生物，命名為云木香素A。

化合物1a：白色粉末狀固體，[α]20D-45° (c0.2,CHCl3)，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z269.115 2[M＋Na]+（計(jì)算值為269.115 4），確定分子式為C15H18O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.18 (1H, d,J= 3.5 Hz, H-13β), 5.47 (1H, d,J= 3.1 Hz, H-13α),5.45 (1H, s, H-15β), 5.32 (1H, s, H-15α), 4.90 (1H, s,H-14β), 5.75 (1H, s, H-14α), 4.65 (1H, t,J= 6.2 Hz,H-3), 3.87 (1H, t,J= 9.2 Hz, H-6), 3.07 (2H, m, H-1,5), 2.83 (1H, m, H-7), 2.49 (1H, m, H-9β), 2.21 (1H,m, H-8β), 2.14 (1H, m, H-2β), 2.08 (1H, m, H-8α),1.84 (1H, m, H-2α), 1.36 (1H, m, H-9α)；13C-NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 49.6 (C-1), 36.9 (C-2), 74.4(C-3), 154.1 (C-4), 45.6 (C-5), 85.2 (C-6), 44.1 (C-7),31.1 (C-8), 39.9 (C-9), 139.5 (C-10), 148.6 (C-11),170.2 (C-12), 120.5 (C-13), 113.2 (C-14), 112.9(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]，故鑒定化合物1a為3-epizaluzanin C。

化合物1b：白色結(jié)晶狀固體，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z172.146 3 [M＋Na]+（計(jì)算值為172.146 3），確定分子式為C10H20O2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 2.34 (2H, t,J= 7.5 Hz, H-2), 1.63(2H, m, H-3), 1.35～1.27 (12H, m, H-4～9), 0.88 (3H,t,J= 6.8 Hz, H-10)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ:180.6 (C-1), 34.3 (C-2), 24.8 (C-3), 29.2 (C-4), 29.4(C-5), 29.5 (C-6), 29.4 (C-7), 32.0 (C-8), 22.8 (C-9),14.2 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，故鑒定化合物1b為正癸酸。

4 NO抑制活性測定

參考文獻(xiàn)采用Griess法[12]評價(jià)化合物1對RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的抑制作用。取處于對數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞，按1×105個/mL濃度進(jìn)行稀釋，稀釋液加如96孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液。隨后，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，每孔再加入LPS（1 μg/mL）及不同濃度（5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L）的測試樣品，然后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后吸取培養(yǎng)液上清液100 μL轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中，在540 nm下測定吸光度（A），結(jié)果以IC50表示。結(jié)果顯示，化合物1對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO顯示出一定的抑制活性，IC50為21.7 μmol/L，而陽性藥吲哚美辛的IC50為15.4 μmol/L。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)采用各種色譜分離技術(shù)與波譜手段，并結(jié)合化學(xué)方法，從云木香中分離鑒定1個新愈創(chuàng)木烷型倍半萜，命名為云木香素A，該化合物對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO顯示出抑制作用，可為云木香的深入開發(fā)與利用提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突