李 軍，周 濤，王崇敏，劉曉清

貴州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥民族藥資源研究院，貴陽 550025

核因子Y(nuclear factor Y，NF-Y)，又稱CBF或亞鐵血紅素激活蛋白HAP，主要由NF-YA，NF-YB及NF-YC 3個亞家族組成[1].NF-Y蛋白家族的不同成員可通過不同途徑進(jìn)入細(xì)胞核，其中NF-YA是由Importin β介導(dǎo)輸入核中，而含有HFM亞基的NF-YB和NF-YC作為異二聚體復(fù)合物則由Importin 13介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核[2].3個亞家族可以單獨(dú)調(diào)控基因表達(dá)，也可形成NF-YB/NF-YC CONSTANS或NF-Y復(fù)合體，進(jìn)一步結(jié)合CCAAT元件參與基因表達(dá)的調(diào)控[3].

在哺乳動物及酵母體內(nèi)，NF-Y的3個亞基均由單基因編碼[4]，但植物中每個亞基均由基因家族編碼[5]，提供了更多的 NF-YA/NF-YB/NF-YC 三聚體組合，增加了核因子Y功能的復(fù)雜性，參與了在種子萌發(fā)、胚胎發(fā)育、開花過程以及植物對氮、磷、脫落酸(ABA)以及鹽分脅迫等的響應(yīng)過程[6].研究表明大豆GmNF-YCa在蔗糖和甘露醇誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)，過表達(dá)可顯著改善甘露醇和蔗糖脅迫下擬南芥種子的發(fā)芽率、根長和側(cè)根伸長明顯等[7].谷子SiNF-YA6主要在根部表達(dá)，同時受低氮、干旱、高鹽和 ABA 等脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，該基因的過表達(dá)顯著提高了擬南芥對低氮脅迫的耐受性[8].由此可見，NF-Y蛋白家族的不同成員不僅參與了植物多種生長發(fā)育進(jìn)程，且在植物抵御逆境脅迫等方面具有重要作用.

太子參為傳統(tǒng)中藥，系石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Paxex Pax et Hoffm的干燥塊根，含有多糖類、皂苷類、磷脂類、環(huán)肽類等活性成分，具有增強(qiáng)免疫力、降血糖、抗疲勞等多種功效[9].隨著近年來太子參需求量的逐年上升，逐步轉(zhuǎn)向人工種植，主要分布于溫暖濕潤的氣候環(huán)境中[10].高溫、干旱等逆境容易引起太子參生長發(fā)育受阻，從而導(dǎo)致減產(chǎn)、病害等問題.因此，研究NF-Y基因家族的表達(dá)模式及對干旱脅迫的響應(yīng)，對于深入理解其在太子參生長發(fā)育過程中的功能和作用，解析NF-Y蛋白在植物抵抗逆境脅迫中的作用機(jī)制具有重要意義.

1 材 料

供試材料為貴州施秉常用種，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序完成.數(shù)據(jù)庫1：采用課題組前期構(gòu)建的太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(葉、莖、根表皮、根木質(zhì)部)[11]；數(shù)據(jù)庫2：參照路丙社等[12]的方法，設(shè)置30%，44%，58%，72%，86%及100%的土壤水分梯度，相對含水量=土壤含水量/田間持水量×100%，取塊根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，de Novo組裝；數(shù)據(jù)庫3：采用0.2 mg/L NAA(萘乙酸)誘導(dǎo)組培苗生根[13]，然后轉(zhuǎn)入MS+45 g/L蔗糖，MS+60 g/L蔗糖及MS+75 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取塊根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，de Novo組裝.

2 方 法

2.1 NF-Y基因家族的鑒定

從NCBI中下載甜菜(BetavulgarisL.)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)等的NF-Y蛋白家族成員.通過BlastP分別比對3個數(shù)據(jù)庫，從中鑒定太子參NF-Y家族同源序列，期望值設(shè)為小于0.001，結(jié)合數(shù)據(jù)庫原有的注釋結(jié)果，剔除注釋錯誤的序列，將3個數(shù)據(jù)庫中鑒定的NF-Y蛋白序列統(tǒng)一編號.

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及蛋白保守序列比對

采用muscle 3.8軟件(http：//www.drive5.com/muscle/)對太子參及甜菜、擬南芥及水稻進(jìn)行多序列比對，分析結(jié)果用MEGA X(https：//www.megasoftware.net/)分析，采用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建NF-Y的系統(tǒng)進(jìn)化樹，檢驗(yàn)參數(shù)Booistrap重復(fù)1 000次.利用MEME在線程序(http：//meme-suite.org/)對NF-Y蛋白家族的保守基序進(jìn)行分析，預(yù)測太子參NF-Y蛋白家族的蛋白質(zhì)保守基序(Motif)，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，并用WebLogo軟件(http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)展示保守基序.

2.3 表達(dá)分析

采用RSEM軟件(http：//deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)進(jìn)行基因表達(dá)分析，采用RPKM值(reads per kb permillion reads)表示基因的相對表達(dá)水平，采用Cluster 3.0軟件對NF-Y基因的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最后采用Heatmap圖展示基因的表達(dá).

2.4 蛋白互作分析

采用美吉生物云平臺(https：//cloud.majorbio.com/)中的STRING數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/)對NF-Y蛋白互作進(jìn)行分析.參考擬南芥的蛋白互作關(guān)系，構(gòu)建太子參NF-Y蛋白的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò).采用confidence score值評價互作關(guān)系的可信度，默認(rèn)值0.4，值越大代表互作關(guān)系越可靠.

3 結(jié) 果

3.1 太子參NF-Y家族基因的鑒定與生物信息學(xué)分析

采用擬南芥、水稻等模式植物的NF-Y蛋白檢索3個太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，結(jié)合注釋信息及手工分析，共鑒定出24個NF-Y基因(表1)，分別歸入3個亞家族，包括9個NF-YA，10個NF-YB及5個NF-YC.其中數(shù)據(jù)庫1中獲得9個NF-YA，6個NF-YB及4個NF-YC；數(shù)據(jù)庫2中獲得8個NF-YA，8個NF-YB及4個NF-YC；數(shù)據(jù)庫3中獲得8個NF-YA，7個NF-YB及4個NF-YC.PhNF-YA8僅在數(shù)據(jù)庫1中檢索到，PhNF-YB5，PhNF-YB6，PhNF-YB7，PhNF-YB9及PhNF-YC5未在數(shù)據(jù)庫1中檢索到，暗示這些基因可能是誘導(dǎo)型基因.

表1 太子參NF-Y基因家族的篩選與鑒定

3.2 太子參NF-Y家族基因蛋白的保守基序及進(jìn)化分析

為了推測24個太子參NF-Y蛋白的功能，分別構(gòu)建了NF-YA，NF-YB及NF-YC氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1).太子參的9個NF-YA蛋白分別歸入3個類群，其中PhNF-YA2，PhNF-YA3，PhNF-YA7，PhNF-YA9與AtNF-YA3，AtNF-YA5，AtNF-YA6，AtNF-YA8歸為第1類群，PhNF-YA1，PhNF-YA4，PhNF-YA5，PhNF-YA8與AtNF-YA1，AtNF-YA9歸為第2類群，PhNF-YA6與AtNF-YA2，AtNF-YA10歸入第3類群.

圖中分支點(diǎn)的數(shù)字表示基于1 000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)的自展支持率；標(biāo)尺代表遺傳距離.

太子參的10個NF-YB蛋白分別歸入4個類群，其中PhNF-YB2，PhNF-YB3，PhNF-YB10與AtNF-YB1，AtNF-YB2等6個擬南芥NF-YB蛋白歸入第1類群，PhNF-YB1，PhNF-YB4，PhNF-YB5與AtNF-YB4，AtNF-YB5歸入第2類群，PhNF-YB6及PhNF-YB9歸入第3類群，PhNF-YB7，PhNF-YB8與AtNF-YB6，AtNF-YB9歸入第4類群.太子參的5個PhNF-YC蛋白歸入同一個類群.

為了解太子參NF-Y蛋白的序列特點(diǎn)，分析了太子參NF-Y蛋白的保守基序(圖2)，發(fā)現(xiàn)PhNF-YA，PhNF-YB及PhNF-YC亞家族中均具有一段高度保守的序列，暗示這些序列與太子參NF-Y蛋白的功能密切相關(guān).

圖2 太子參NF-Y蛋白的保守基序

3.3 不同組織中NF-Y家族基因的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步闡明太子參NF-Y蛋白的功能，分析了這些基因在葉、莖、塊根皮部及塊根木質(zhì)部中的表達(dá)模式(圖3a)，結(jié)果顯示9個PhNF-YA基因中PhNF-YA4，PhNF-YA5，PhNF-YA7，PhNF-YA9僅在葉中有較高表達(dá)，PhNF-YA2，PhNF-YA6在葉及莖中均有較高表達(dá)，PhNF-YA1在塊根木質(zhì)部有較高表達(dá)，PhNF-YA3在塊根皮部有較高表達(dá).6個PhNF-YB基因中PhNF-YB1和PhNF-YB4在塊根皮部及莖中有較高表達(dá)，PhNF-YB10僅在葉中有較高表達(dá)，PhNF-YB3在塊根木質(zhì)部中有較高表達(dá)，PhNF-YB8在塊根木質(zhì)部及葉中有較高表達(dá).4個PhNF-YC基因中PhNF-YC2在葉中有較高表達(dá)，其余基因表達(dá)量較低.19個基因的蛋白互作關(guān)系分析結(jié)果顯示(圖3b)，PhNF-YA4及PhNF-YC2等9個PhNF-Y蛋白的互作關(guān)系在太子參葉片的生長發(fā)育過程中具有重要作用.

圖3 太子參NF-Y基因家族在不同組織中的表達(dá)及蛋白互作

3.4 塊根中NF-Y家族基因?qū)ν寥浪置{迫的響應(yīng)

為了研究太子參NF-Y蛋白對水分脅迫的響應(yīng)機(jī)制，分析了不同土壤水分脅迫下塊根中NF-Y基因的表達(dá)模式(圖4a)，結(jié)果顯示8個PhNF-YA基因中PhNF-YA1，PhNF-YA4，PhNF-YA5，PhNF-YA7，PhNF-YA9在干旱脅迫下(30%)有較高表達(dá)，PhNF-YA1，PhNF-YA2，PhNF-YA3在低度干旱條件下(58%)有較高表達(dá)，PhNF-YA6隨著土壤水分含量的上升表現(xiàn)出上調(diào)的趨勢.10個PhNF-YB基因中PhNF-YB2，PhNF-YB3及PhNF-YB8在干旱脅迫下(30%)有較高表達(dá)，PhNF-YB10在適度干旱脅迫下(44%)有較高表達(dá)，PhNF-YB1在低度干旱條件下(58%)有較高表達(dá).5個PhNF-YC基因中PhNF-YC1，PhNF-YC3，PhNF-YC4在干旱脅迫下(30%)有較高表達(dá)，PhNF-YC2與土壤水分的增加趨勢基本一致，PhNF-YC5僅在澇滯環(huán)境下(100%)有較高表達(dá).23個PhNF-Y蛋白的互作關(guān)系表明(圖4b)，PhNF-YA1，PhNF-YB4，PhNF-YC3及PhNF-YC4等11個PhNF-Y蛋白積極響應(yīng)土壤水分的脅迫，調(diào)控植物的生長發(fā)育.

圖4 太子參塊根中NF-Y基因家族在土壤水分脅迫下的表達(dá)及蛋白互作

3.5 根中NF-Y家族基因?qū)φ崽敲{迫的響應(yīng)

為了研究太子參NF-Y蛋白對蔗糖誘導(dǎo)的響應(yīng)機(jī)制，利用組培苗觀察不同蔗糖濃度培養(yǎng)條件下太子參根部NF-Y蛋白的表達(dá)模式(圖5a)，結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的升高，3個PhNF-YA基因的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，7個PhNF-YB基因中PhNF-YB5的表達(dá)量隨蔗糖濃度的升高而升高，PhNF-YB1，PhNF-YB2的表達(dá)呈先上升后下降的趨勢，PhNF-YB3，PhNF-YB4，PhNF-YB8，PhNF-YB10的表達(dá)呈先下降后上升的趨勢.4個PhNF-YC基因中PhNF-YC3及PhNF-YC4基因的表達(dá)受高濃度蔗糖誘導(dǎo)，PhNF-YC1在高濃度蔗糖條件下表達(dá)受到抑制.19個PhNF-Y蛋白的互作關(guān)系表明(圖5b)，PhNF-YA1，PhNF-YB4，PhNF-YC2等10個PhNF-Y蛋白積極響應(yīng)蔗糖脅迫，協(xié)同調(diào)控植物的生長發(fā)育.

圖5 太子參根中NF-Y基因家族在蔗糖誘導(dǎo)下的表達(dá)及蛋白互作

4 討 論

已有證據(jù)表明NF-Y蛋白在葉綠體形成及光合作用中具有重要作用.擬南芥AtNF-YA5，AtNF-YB9和AtNF-YC9形成的復(fù)合體可與GCR1，GPA1和Pirin1組成信號傳遞鏈，參與調(diào)控植株中葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因的表達(dá)[14].過量表達(dá)小麥TaNF-YB3后顯著提高葉綠素含量、光合速率及早期生長率[15].水稻Os-NF-YB2/3/4可影響多個核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧合酶小亞基和葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因的表達(dá)[16].本研究發(fā)現(xiàn)太子參PhNF-YA4，PhNF-YA5等6個基因，PhNF-YB8，PhNF-YB10及PhNF-YC2在葉中高量表達(dá)，且可能具有復(fù)雜的相互作用關(guān)系，暗示這些基因在協(xié)同調(diào)控葉的生長發(fā)育及光合作用中具有重要作用，但具體機(jī)制尚不明確.擬南芥NF-YA1/5/6/9共同調(diào)控雄配子發(fā)育、胚胎發(fā)育、種子形態(tài)及萌發(fā)等[17-18]，單個基因或兩個基因的突變并不能發(fā)生表型的改變，但過表達(dá)其中任一基因均能影響種子的發(fā)育，暗示了太子參PhNF-YA亞家族也有功能冗余的可能性.此外，PhNF-YA1及PhNF-YB3，PhNF-YB8在塊根木質(zhì)部中有較高表達(dá)，且進(jìn)化分析結(jié)果顯示PhNF-YA1，PhNF-YA4，PhNF-YA5，PhNF-YA8與AtNF-YA1，AtNF-YA9聚為一類，暗示了這些太子參NF-Y基因可能與太子參塊根的發(fā)育有一定關(guān)系.

NF-Y蛋白在水分脅迫過程中具有重要作用.研究表明擬南芥大部分NF-YA基因呈上調(diào)表達(dá)，而小麥中NF-YA則相反[19-20].過表達(dá)AtNF-YB1和ZmNF-YB2可顯著減少轉(zhuǎn)基因植株的葉片水分流失及提高抗旱能力[21].部分NF-Y基因的轉(zhuǎn)錄受ABA途徑調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后受到miR169的調(diào)控[22].本研究中太子參PhNF-YA1，PhNF-YA4，PhNF-YA5，PhNF-YA7，PhNF-YA9，PhNF-YB2，PhNF-YB3，PhNF-YB8及PhNF-YC1，PhNF-YC3，PhNF-YC4在干旱脅迫下均顯著上調(diào)，且進(jìn)化分析結(jié)果顯示PhNF-YB2，PhNF-YB3，PhNF-YB10與AtNF-YB1，AtNF-YB2等6個擬南芥NF-YB蛋白歸入一類，暗示了這些太子參NF-YB蛋白與抗旱有密切聯(lián)系.此外，蛋白間互作關(guān)系暗示PhNF-YC3，PhNF-YC4在干旱脅迫響應(yīng)過程中可能具有核心調(diào)控作用.值得注意的是，PhNF-YA6及PhNF-YC2的表達(dá)隨土壤水分的增加而增加，揭示了這些基因在太子參感知土壤水分變化的過程中具有重要作用.

蔗糖及其衍生物不僅是光合同化物與能量的運(yùn)輸和貯藏形式，也是植物中一種重要的信號分子，調(diào)控基因表達(dá)及影響器官的生長發(fā)育[23-24].本研究分析了太子參NF-Y蛋白對蔗糖脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了大部分基因能夠響應(yīng)蔗糖濃度的變化，暗示了環(huán)境因子可通過影響組織中蔗糖的分布來調(diào)控NF-Y蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響器官的形態(tài)建成.