鄭凌歆 王金丹 何超翔 鄭蘭芝

特發(fā)性肺纖維化是一種以肺成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過度聚集及肺泡上皮損傷為特征的間質(zhì)性肺疾病[1-2]，發(fā)病機(jī)制未明，愈后差，缺乏有效的預(yù)防和治療方法。目前認(rèn)為成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化在纖維化進(jìn)程中起至關(guān)重要的作用，其分化的標(biāo)志是α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的大量表達(dá)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化[4]，并可通過Smads信號(hào)通路調(diào)控纖維化進(jìn)程[5]。因此，藥物若能干預(yù)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的進(jìn)程，則可為特發(fā)性肺纖維化的治療提供新思路。麥冬具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效。麥冬多糖（Ophiopogon japonicus polysaccharides，OJP）是其主要化學(xué)活性成分，主要藥理作用為免疫調(diào)節(jié)、抗炎及降血糖等[6]。研究表明，麥冬注射液可有效抑制腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1 及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）的過度表達(dá)，從而阻止或延緩腹膜纖維化的發(fā)生[7]，具有一定的抗纖維化作用。本研究觀察OJP 對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎肺成纖維（HEL）細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響及初步機(jī)制進(jìn)行探討，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì) 胞 HEL 細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫（KCB 86019）。

1.2 主要試劑及儀器 OJP（純度98%，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司），TGF-β1（購自艾美捷科技有限公司，4342-5），α-SMA（購自Abcam 公司，ab5694），膠原蛋白Ⅰ（COLⅠ）抗體（購自戴格公司，db517），Smad2、p-Smad2 抗體（購自Cell signaling technology 公司，5678S，3101S），胎牛血清（購自Gibco 公司，1903220），CCK-8（購自碧云天生物技術(shù)公司，C0037），CFX 96 Touch 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國伯樂），TS-1000 脫色搖床（海門其林貝爾儀器公司），Bio-RadMINI-P 垂直電泳系統(tǒng)（美國伯樂），S-3000N 掃描電鏡（日本日立），AIR 激光共聚焦顯微鏡（浙江賽因）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞分組及給藥方法 將對(duì)數(shù)生長期的HEL細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和OJP 干預(yù)組。模型組于TGF-β1 6ng/mL 處理2h 后繼續(xù)培養(yǎng)24h。OJP 干預(yù)組于TGF-β1 6ng/mL 處理2h 后，再加入25、50、100μg/mL OJP 繼續(xù)培養(yǎng)24h。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將1×105/L 各處理組細(xì)胞懸液100μL 加置96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板里，每組設(shè)5 個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白孔。每孔加入CCK-8 溶液培養(yǎng)2h后，用酶標(biāo)儀于450nm 處測定吸光度值。

2.3 電鏡觀察 根據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果收集各處理組細(xì)胞懸液和爬片，分別加入2.5%戊二醛前固定，再以1%四氧化鋨后固定2h，丙酮梯度脫水，618 環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，采用掃描電鏡和透射電鏡進(jìn)行觀察并拍照。

2.4 免疫熒光檢測α-SMA 蛋白 將各處理組細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定15min，0.3% TritonX-100室溫通透15min，4%牛奶封閉2h，一抗4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC 綠色熒光二抗37℃避光孵育1h，滴加DAPI避光作用5min，50%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中α-SMA 蛋白的分布定位。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測 收集各處理組細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列為：α-SMA 正義5′-AGCGTGGCTATTCCTTCGTT-3′，反義5′-TCAGGCAACTCGTAACTCTTCT-3′；COLⅠ正義5′-TTCCTGCGCCTGATGTCC-3′，反義5′-GGTTCAGTTTGGGTTGCTTGT-3′。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s；60℃退火30s 后采集熒光信號(hào)，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用所得Ct 值計(jì)算出相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 Western blot 檢測 收集各處理組細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取蛋白并測定濃度，變性后進(jìn)行SDSPAGE 電泳，300mA 電流轉(zhuǎn)膜80min，5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗4℃孵育過夜，然后加入二抗孵育1h，Odyssey 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描、拍照成像，分析相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，方差齊性則采用Bonferroni 法，方差不齊者用Dunnet's T3 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同濃度OJP 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的HEL 細(xì)胞增殖的影響 25、50、100μg/mL 的OJP 可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HEL 細(xì)胞增殖，且隨著OJP 濃度的增加而增強(qiáng)（P<0.05），呈劑量依賴趨勢(shì)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取100μg/mL 的OJP 進(jìn)行干預(yù)。見表1。

表1 不同OJP 濃度對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的HEL 細(xì)胞增殖的影響（%，）

表1 不同OJP 濃度對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的HEL 細(xì)胞增殖的影響（%，）

注：OJP 為麥冬多糖；TGF-β1 為轉(zhuǎn)化生長因子-β1；HEL 為人胚胎肺成纖維；與0μg/mL 比較，aP<0.05

3.2 OJP 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的HEL 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 通過掃描電鏡（圖1A）和透射電鏡（圖1B）分別觀察TGF-β1 誘導(dǎo)的HEL 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，100μg/mL OJP 干預(yù)組細(xì)胞表面微絨毛減少、微絲變短，胞漿內(nèi)線粒體數(shù)目下降，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少。

圖1 OJP 對(duì)HEL 細(xì)胞表面微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器的影響

3.3 OJP 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的HEL 細(xì)胞α-SMA 蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組α-SMA 多不表達(dá)或很少表達(dá)，模型組α-SMA 在細(xì)胞核與胞漿內(nèi)均表達(dá)且表達(dá)量增加，而100μg/mL OJP 干預(yù)組α-SMA 蛋白表達(dá)量明顯降低，見圖2。

圖2 OJP 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的HEL 細(xì)胞中α-SMA 表達(dá)的影響（免疫熒光×200）

3.4 OJP 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的HEL 細(xì)胞α-SMA 和COLⅠmRNA 表達(dá)的影響 模型組α-SMA 和COLⅠ mRNA 相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均明顯增加（P<0.05），100μg/mL OJP 干 預(yù) 組α-SMA 和COL ⅠmRNA 相對(duì)表達(dá)量較模型組均明顯下降（P<0.05），見表2。

表2 各組細(xì)胞α-SMA 和COLⅠmRNA 表達(dá)比較（）

表2 各組細(xì)胞α-SMA 和COLⅠmRNA 表達(dá)比較（）

注：對(duì)照組為HEL 細(xì)胞未經(jīng)處理；模型組為HEL 細(xì)胞經(jīng)TGF-β1 6ng/mL 處理2h 后繼續(xù)培養(yǎng)24h；OJP 干預(yù)組為HEL 細(xì)胞經(jīng)TGF-β1 6ng/mL 處理2h 后再加入100μg/mL 的OJP 繼續(xù)培養(yǎng)24h；OJP 為麥冬多糖；TGF-β1 為轉(zhuǎn)化生長因子-β1；HEL 為人胚胎肺成纖維；α-SMA 為α 平滑肌肌動(dòng)蛋白；COLⅠ為Ⅰ型膠原蛋白；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3.5 OJP 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的HEL 細(xì)胞α-SMA、COLⅠ、Smad2、p-Smad2 表達(dá)的影響 模型組α-SMA、COLⅠ、Smad2 和p-Smad2 蛋白表達(dá)較對(duì)照組均顯著增加（P＜0.01），而100μg/mL 的OJP 干預(yù)組α-SMA、COLⅠ、Smad2 和p-Smad2 蛋白表達(dá)較模型組均顯著下降（P＜0.01），見表3，圖3。

圖3 Western blot 檢測OJP 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)HEL 細(xì)胞α-SMA、COLⅠ、Smad2、p-Smad2 蛋白表達(dá)

表3 各組細(xì)胞α-SMA、COLⅠ、Smad2、p-Smad2 蛋白表達(dá)比較（）

表3 各組細(xì)胞α-SMA、COLⅠ、Smad2、p-Smad2 蛋白表達(dá)比較（）

注：對(duì)照組為HEL 細(xì)胞未經(jīng)處理；模型組為HEL 細(xì)胞經(jīng)TGF-β1 6ng/mL 處理2h 后繼續(xù)培養(yǎng)24h；OJP 干預(yù)組為HEL 細(xì)胞經(jīng)TGF-β1 6ng/mL處理2h 后再加入100μg/mL 的OJP 繼續(xù)培養(yǎng)24h；OJP 為麥冬多糖；TGF-β1 為轉(zhuǎn)化生長因子-β1；HEL 為人胚胎肺成纖維；α-SMA 為α 平滑肌肌動(dòng)蛋白；COLⅠ為Ⅰ型膠原蛋白；Smad2 為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白；p-Smad2 為磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白；與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

4 討論

肺纖維化病因目前尚未明確，HEL 的活化被認(rèn)為是其發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。HEL 已被證實(shí)可造成細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，促進(jìn)上皮細(xì)胞損傷并誘導(dǎo)其凋亡，加重炎癥反應(yīng)，降低肺的順應(yīng)性[8]。肌成纖維細(xì)胞的遷移和分化可能是肺纖維化起始和進(jìn)展中關(guān)鍵步驟之一[9]。TGF-β1 可通過Smads 蛋白通路使正常的成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，α-SMA 和膠原蛋白的表達(dá)增強(qiáng)且抑制降解，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積[10]。若能抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化這一過程，則有望成為治療纖維化疾病的新靶點(diǎn)。

研究表明，OJP 對(duì)某些纖維化疾病、糖尿病、心血管疾病及增強(qiáng)機(jī)體免疫力上有一定防治作用[7]。OJP 可干預(yù)氧自由基的損傷，改善細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）代謝，從而對(duì)肺間質(zhì)纖維化的治療起一定作用[7，11]。寧萌等[12]發(fā)現(xiàn)，OJP 能促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用，在治療2 型糖尿病大鼠過程中能降低其空腹血糖和改善胰島素抵抗作用。Fan 等[13]研究表明，經(jīng)OJP 對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠具有心臟保護(hù)作用，同時(shí)還能降低ET-1 的水平并增加NO 的水平，重建血管舒張和收縮的平衡。此外OJP 及其脂質(zhì)體已被證實(shí)可以顯著改善巨噬細(xì)胞的吞噬活性，在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[14]。本實(shí)驗(yàn)選用TGF-β1進(jìn)行誘導(dǎo)造模，方便快速可控。結(jié)果表明，一定濃度的OJP 可抑制HEL 細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

TGF-β 主要通過Smads 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)功能，其與細(xì)胞膜上的TGF-β 受體（TβRⅡ）結(jié)合，誘發(fā)其磷酸化，繼而與Ⅰ型受體（TβRⅠ）結(jié)合形成三聚體，誘導(dǎo)Smad2/3 的絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化形成p-Smad2/3，離開TβRⅠ受體后與Smad4 結(jié)合形成復(fù)合體，入核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致正常的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分α-SMA、COLⅠ等，從而加強(qiáng)TGF-β 的誘導(dǎo)效果[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HEL 細(xì)胞受TGF-β1 刺激后Smad2 和p-Smad2 蛋白表達(dá)量增加；不同濃度的OJP 干預(yù)后，Smad2 和p-Smad2 蛋白的表達(dá)量減少，提示OJP 可能是通過TGF-β/Smads 信號(hào)通路，下調(diào)HEL 細(xì)胞中Smad2 和p-Smad2 蛋白的表達(dá)，從而抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OJP 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的HEL 細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的進(jìn)程有一定的抑制作用，并與TGF-β/Smads 信號(hào)通路相關(guān)。