陸 健，張佳佳，周國勤，王佩佩，慶 輝

( 南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，江蘇 南京 210036 )

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，又名加州鱸，屬鱸形目、太陽魚科，是一種優(yōu)質(zhì)淡水魚類[1]。原產(chǎn)于北美洲的淡水河流和湖泊中，20世紀(jì)70年代被引入我國臺(tái)灣，1983年引入我國大陸，并于1985年在廣東省人工繁殖成功，目前已在廣東、江蘇、浙江等地大規(guī)模養(yǎng)殖，成為中國南方地區(qū)淡水人工養(yǎng)殖的主養(yǎng)高檔品種之一，2017年產(chǎn)量超過4.5×105t[2]。大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”(GS-01-001-2018)是2019年經(jīng)全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會(huì)審定通過的新品種之一，是以“優(yōu)鱸1號(hào)”(GS01-004-2010)和自美國新引進(jìn)的北方亞種為基礎(chǔ)選育種群，經(jīng)連續(xù)4代選育而獲得。相比“優(yōu)鱸1號(hào)”和未選育群體，其幼魚和成魚的生長速度較快，養(yǎng)殖5～7個(gè)月即可達(dá)到上市規(guī)格，適合在我國淡水水域進(jìn)行人工配合飼料養(yǎng)殖[3]。大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”作為水產(chǎn)領(lǐng)域的新星，將會(huì)迎來廣闊的養(yǎng)殖前景，因此有必要加強(qiáng)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”的相關(guān)生物學(xué)研究。同時(shí)，溫度作為一個(gè)重要的環(huán)境因子，在生物的生長、發(fā)育、形態(tài)、行為、數(shù)量和分布等方面起著極其重要的作用[4-5]。面對(duì)環(huán)境溫度的變化，魚類通常會(huì)對(duì)自身代謝進(jìn)行調(diào)整，以適應(yīng)環(huán)境溫度的變化[6]，然而短時(shí)間急劇的溫度變化會(huì)引起魚類的代謝紊亂、組織受損等，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致魚體的死亡。而熱應(yīng)激蛋白(HSPs)是機(jī)體細(xì)胞受環(huán)境刺激誘導(dǎo)而產(chǎn)生的具有高度保守性的一組重要的非特異性細(xì)胞保護(hù)性蛋白，常作為機(jī)體應(yīng)對(duì)外界環(huán)境刺激時(shí)反映其細(xì)胞功能狀態(tài)和抗應(yīng)激能力的指標(biāo)之一[7-8]。在全球氣候日益惡化、夏季連續(xù)高溫的大背景下，探究大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”應(yīng)對(duì)熱脅迫的生理機(jī)制是非常有必要的。筆者以大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”為試驗(yàn)對(duì)象，探究其在急性高溫脅迫下的組織損傷及HSPs基因表達(dá)，旨在為了解大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”應(yīng)對(duì)高溫脅迫的機(jī)制及其健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)用大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”幼魚[體質(zhì)量(9.87±1.20) g，體長(7.9±0.4) cm]均來自江蘇南京帥豐飼料有限公司，將試驗(yàn)用魚暫養(yǎng)于有生物過濾水再循環(huán)系統(tǒng)(配備有冷卻和加熱功能，流速為5 L/min，光照時(shí)間為14 h)的水族箱中。日投喂2次(8：00—9：00和20：00—21：00)大口黑鱸配合飼料(江蘇南京帥豐飼料有限公司)。暫養(yǎng)和試驗(yàn)期間水中溶解氧高于5 mg/L，氨氮與亞硝態(tài)氮低于0.01 mg/L，試驗(yàn)前禁食24 h，試驗(yàn)期間不投喂。

將各組幼魚在25 ℃水溫下暫養(yǎng)15 d后，對(duì)照組水溫保持在該溫度下恒定。將試驗(yàn)組的幼魚迅速轉(zhuǎn)入事先預(yù)調(diào)好水溫的水循環(huán)缸中(28、31、34、37 ℃)，每個(gè)溫度包括3個(gè)平行組，每組含有20尾幼魚，在相應(yīng)的試驗(yàn)水溫下保持至試驗(yàn)結(jié)束，并于0、6、48 h取6尾幼魚的肝臟和鰓組織于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃中保存。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(48 h)取肝臟和鰓組織放置于4%的組織固定液中用于蘇木精—伊紅染色切片。

1.2 石蠟組織切片觀察

肝臟、鰓組織經(jīng)過波恩氏液固定24 h后，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋后切片，切片厚度為5 μm，蘇木精—伊紅染色，中性樹脂封片，晾干。置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 組織RNA的提取與 cDNA的合成

組織RNA的提取采用高純總RNA快速抽提試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司，RP1202)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量(電壓120 V，電流165 mA，時(shí)間25 min)，用Nanodrop檢測(cè)RNA的純度(D260/260)和濃度。根據(jù)HiScript?Reverse Transcriptase的說明(Vazyme，R123-01)進(jìn)行第1鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄。

1.4 熒光定量PCR

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心大口黑鱸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號(hào)：FJ751227.1)得到HSP70基因的序列，參考斑馬魚(Daniorerio，登錄號(hào)：NC_007126.7)、虹鱒(Oncorhynchusmyliss，登錄號(hào)：XM_021624823.1)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus，登錄號(hào)：XM_003448890.5)、南方鲇(Silurusmeridionalis，登錄號(hào)：EF406131.1)、斑點(diǎn)叉尾(Ietaluruspunctatus，登錄號(hào)：NC_030432.1)、大西洋鯛(Sparusaurata，登錄號(hào)：NC_044203.1)、尖吻鱸(Latescalcarifer，登錄號(hào)：GCF_001640805.1)的HSC70 cDNA序列，在同源保守區(qū)內(nèi)用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性上下游引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。參考文獻(xiàn)[9]以18S基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列見表1。用SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)試劑盒(Vazyme，Q341-02/03)在ABI熒光定量PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2 μL cDNA模板(5 ng/μL)，4 μL上、下游引物(10 μmol/L)，10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)。擴(kuò)增條件為95 ℃ 10 min； 40個(gè)循環(huán)的條件是95 ℃ 10 s，58 ℃ 60 s；熔解曲線60 ℃→95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

表1 引物信息

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析后的試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用單因素方差分析和LSD多重比較檢驗(yàn)對(duì)同一時(shí)間不同溫度組間進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和檢驗(yàn)分析，用Origin 8.6繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性高溫脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組肝臟組織中肝細(xì)胞為多邊形，排列整齊有序，細(xì)胞間界限清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核明顯呈圓形(圖1a)；28 ℃和31 ℃試驗(yàn)組損傷并不明顯，無明顯的組織結(jié)構(gòu)變化，肝細(xì)胞排列整齊有序，細(xì)胞核明顯呈圓形，細(xì)胞間界限清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻(圖1b、圖1c)；34 ℃試驗(yàn)組出現(xiàn)紅細(xì)胞沉積和輕微的細(xì)胞水腫(圖1d)；37 ℃高溫脅迫組肝臟損傷較明顯，肝細(xì)胞排列無序，較多肝細(xì)胞均出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞間界限雜亂模糊，細(xì)胞核萎縮，嚴(yán)重的甚至出現(xiàn)溶解(圖1e、圖1f)。

圖1 不同溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟組織學(xué)變化(比例尺=20 μm)Fig.1 The histological structure of liver in largemouth bass M. salmoides “Youlu No.3” exposed to different acute temperature stress (bar=20 μm)a.25 ℃肝臟(對(duì)照組)； b.28 ℃肝臟； c.31 ℃肝臟； d.34 ℃肝臟； e.37 ℃肝臟； f.37 ℃肝臟； LC.肝細(xì)胞； BC.血細(xì)胞； S.空泡； AB.血細(xì)胞聚集； Oe.水腫； Pn.細(xì)胞核固縮.a.liver at 25 ℃ (control group); b.liver at 28 ℃; c.liver at 31 ℃; d.liver at 34 ℃; e.liver at 37 ℃; f.liver at 37 ℃; LC.liver cells; BC.blood cells; S.vacuoles; AB.blood cell aggregation; Oe.edema; Pn.nuclear shrinkage.

2.2 急性高溫脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”幼魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組的鰓絲中間有一條延鰓絲方向分布的血管，鰓絲兩側(cè)對(duì)稱分布著鰓小片，鰓小片基部分布著一定數(shù)目的線粒體豐富細(xì)胞(圖2a)；與對(duì)照組相比，28 ℃和31 ℃組無異常(圖2b、圖2c)；34 ℃組鰓小片末端出現(xiàn)輕微的細(xì)胞水腫(圖2d)；37 ℃組鰓小片末端出現(xiàn)膨大，出現(xiàn)大量的細(xì)胞水腫導(dǎo)致鰓小片彎曲，部分鰓小片因紅細(xì)胞過多而漲破，且表皮脫落，大量紅細(xì)胞流出(圖2e、圖2f)。

圖2 不同溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”鰓組織學(xué)變化(比例尺=50 μm)Fig.2 The histological structure of gills in largemouth bass M. salmoides “Youlu No.3” exposed to different acute temperature stress (bar=50 μm)a.25 ℃鰓(對(duì)照組)； b.28 ℃鰓； c.31 ℃鰓； d.34 ℃鰓； e.37 ℃鰓； f.37 ℃鰓； GC.鰓血細(xì)胞； GL.鰓小片； Hp.增生； Ct.頂部棒狀結(jié)構(gòu)； Ms.黏液細(xì)胞腫脹.a.gill at 25 ℃ (control group); b.gill at 28 ℃; c.gill at 31 ℃; d.gill at 34 ℃; e.gill at 37 ℃; f.gill at 37 ℃; GC.gill blood cells; GL.gill lamella; Hp.hyperplasia; Ct.top rod-like structure; Ms.swollen mucus cells.

2.3 急性高溫脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”HSP70基因表達(dá)的影響

在肝臟組織中，6 h時(shí)，隨著脅迫溫度的升高HSP70 mRNA表達(dá)量逐漸升高，在37 ℃時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照組的20.54倍，且顯著高于其他脅迫組(P<0.05)；同時(shí)，28 ℃和31 ℃組HSP70 mRNA表達(dá)量顯著高于0 h(P<0.05)，34 ℃和37 ℃組表達(dá)量極顯著高于0 h(P<0.01)(圖3)。脅迫時(shí)間延長至48 h時(shí)，不同脅迫組HSP70 mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的下降，28 ℃和31 ℃組與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)，34 ℃組HSP70 mRNA的表達(dá)最高，且顯著高于其他脅迫組(P<0.05)，也極顯著高于0 h(P<0.01)，37 ℃組HSP70 mRNA的表達(dá)最低，且顯著低于其他脅迫組(P<0.05)，也極顯著低于0 h(P<0.01)。

圖3 溫度脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟HSP70 mRNA表達(dá)量的影響Fig.3 The effects of acute temperature stress on relative expression levels of liver HSP70 mRNA of largemouth bass M. salmoides “Youlu No.3”*表示與對(duì)照組(0 h)有顯著性差異(P<0.05)，**表示與對(duì)照組(0 h)有極顯著性差異(P<0.01)；不同小寫字母表示同一時(shí)間不同溫度間的顯著性差異(P<0.05);下同.* shows significant differences from that in the control group (P<0.05)，**shows very significant difference (P<0.01) (0 h); means with different letters(a, b and c) are significant difference in the gene at mRNA level among different temperature at the same sampling time (P<0.05); et sequentia.

在鰓組織中，6 h時(shí)，隨著脅迫溫度的升高HSP70 mRNA表達(dá)量逐漸升高，在37 ℃時(shí)表達(dá)量最高，極顯著高于0 h(P<0.01)，且顯著高于其他脅迫組(P<0.05)；脅迫時(shí)間延長至48 h時(shí)，28 ℃和31 ℃組HSP70 mRNA表達(dá)量出現(xiàn)上升，34 ℃和37 ℃組HSP70 mRNA表達(dá)量出現(xiàn)下降，28 ℃組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，31 ℃和34 ℃組HSP70 mRNA的表達(dá)顯著高于0 h(P<0.05)且顯著高于其他脅迫組(P<0.05)，37 ℃組HSP70 mRNA的表達(dá)最低，且極顯著低于0 h(P<0.01)(圖4)。

圖4 溫度脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”鰓HSP70 mRNA表達(dá)量的影響Fig.4 The effects of acute temperature stress on relative expression level of gill HSP70 mRNA in largemouth bass M. salmoides “Youlu No.3”

2.4 急性高溫脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”HSC70基因表達(dá)的影響

不同溫度下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟HSC70基因表達(dá)見圖5，6 h時(shí)，肝臟組織中HSC70 mRNA表達(dá)量隨著脅迫溫度的增加逐漸升高，在37 ℃時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照組的77.66倍，且顯著高于其他脅迫組(P<0.05)；同時(shí)所有脅迫組HSC70 mRNA表達(dá)量均極顯著高于0 h(P<0.01)。脅迫時(shí)間延長至48 h時(shí)，不同脅迫組HSC70 mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的下降，但整體呈先升后降的趨勢(shì)，28 ℃組HSC70 mRNA的表達(dá)最高，且28、31 ℃和34 ℃組顯著高于0 h(P<0.05)，37 ℃顯著低于0 h(P<0.05)。

圖5 溫度脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟HSC70 mRNA表達(dá)量的影響Fig.5 The effects of acute temperature stress on relative expression levels of liver HSC70 mRNA of largemouth bass M. salmoides “Youlu No.3”

不同溫度下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”鰓HSC70基因表達(dá)見圖6，6 h時(shí)，鰓組織中HSC70 mRNA表達(dá)量隨著脅迫溫度的升高逐漸升高，在37 ℃時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照組的51.94倍，且顯著高于其他脅迫組(P<0.05)；同時(shí)所有試驗(yàn)組HSC70 mRNA表達(dá)量均極顯著高于0 h(P<0.01)。脅迫時(shí)間延長至48 h時(shí)，不同脅迫組HSC70 mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的下降，但整體呈先升后降的趨勢(shì)，31 ℃組HSC70 mRNA的表達(dá)最高，且31 ℃和34 ℃組極顯著高于0 h(P<0.01)，28 ℃和37 ℃與對(duì)照組差異不顯著。

圖6 溫度脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”鰓組織HSC70 mRNA表達(dá)量的影響Fig.6 The effects of acute temperature stress on relative expression levels of gill HSC70 mRNA of largemouth bass M. salmoides “Youlu No.3”

3 討 論

3.1 急性高溫脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”幼魚組織結(jié)構(gòu)的影響

魚類生活在水中極易受到鹽度、溫度、pH等水體環(huán)境因子的影響，其中溫度作為重要的環(huán)境因素之一，時(shí)刻影響著魚類的生命活動(dòng)，主要影響魚類的呼吸和循環(huán)系統(tǒng)，從而對(duì)代謝反應(yīng)起控制作用，進(jìn)而影響魚類的生理健康[10-12]。有研究表明，15 ℃會(huì)導(dǎo)致四指馬鲅(Eleutheronematetradactylum)的肝臟細(xì)胞出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)、肌纖維出現(xiàn)彎曲、鰓小片整體水腫且嚴(yán)重彎曲[13]。34 ℃和36 ℃會(huì)引起白梭吻鱸(Sanderlucioperca)肝臟抗氧化酶活性發(fā)生嚴(yán)重變化并且導(dǎo)致肝臟組織損傷，同時(shí)HSC70基因的表達(dá)量顯著增加[14]。劉曉菲等[15]研究表明，高溫刺激會(huì)導(dǎo)致大菱鲆(Scophthalmusmaximus) p53、UBE2H、ZNF469和MAGl2基因的顯著變化，它們與機(jī)體的DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)修飾有關(guān)。由此可見，急性溫度脅迫下會(huì)威脅魚體健康，從而帶來經(jīng)濟(jì)損失，因此探究急性高溫下魚類生理變化機(jī)制對(duì)于魚類的健康養(yǎng)殖具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

肝臟是維持生命活動(dòng)和物質(zhì)代謝的重要器官，參與魚類體內(nèi)多種物質(zhì)的合成、貯存、代謝、轉(zhuǎn)化和分解[16]。本試驗(yàn)中，28 ℃和31 ℃試驗(yàn)組肝臟組織無明顯的組織結(jié)構(gòu)變化，肝細(xì)胞排列整齊有序，細(xì)胞核明顯呈圓形，細(xì)胞間界限清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻，說明31 ℃以下的溫度條件不會(huì)對(duì)肝臟組織形成明顯影響。同樣，大口黑鱸的最適生長溫度為20～30 ℃[17]，也印證了這一點(diǎn)。已有的研究表明，面對(duì)長時(shí)間的應(yīng)激脅迫，魚類機(jī)體主要通過分解肝糖原來維持能量供給[13,18]，37 ℃高溫脅迫組肝臟損傷較為明顯，肝細(xì)胞排列無序、較多肝細(xì)胞均出現(xiàn)空泡化，原因可能是高溫刺激致使大口黑鱸呼吸頻率加快，耗氧量增加，肝糖原或脂肪被大量氧化分解，甚至使肝臟失去自我調(diào)節(jié)能力，從而造成肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，甚至細(xì)胞核萎縮，最后導(dǎo)致魚體死亡。已有的研究[17]表明，大口黑鱸在高于36 ℃的水環(huán)境中無法生存，這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。這與34 ℃和36 ℃處理的白梭吻鱸[14]、29 ℃處理的大蓋巨脂鯉(Colossomamacropomum)[19]、27 ℃處理的許氏平鲉(Sebastodsschlegelii)[16]肝臟組織結(jié)構(gòu)變化相似。

鰓是魚類最主要的呼吸器官，主要參與滲透壓調(diào)節(jié)、呼吸代謝等功能[20]。對(duì)四指馬鲅[13]和赤鯛(Pagruspagrus)[21]的研究表明，水環(huán)境(鹽度、溫度等)可以影響魚類的滲透壓調(diào)節(jié)、腺苷三磷酸酶活性及細(xì)胞膜的通透性[22]。34 ℃組鰓小片末端出現(xiàn)輕微的細(xì)胞水腫。而水腫被認(rèn)為是一種機(jī)體自我保護(hù)的機(jī)制，通過擴(kuò)大外界水體與鰓絲毛細(xì)血管的有效距離，減少不利環(huán)境因素的影響[23]。37 ℃組鰓小片末端出現(xiàn)膨大，末端卷曲充血，大量紅細(xì)胞流出，表明37 ℃會(huì)導(dǎo)致大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”幼魚呼吸功能的喪失，進(jìn)而導(dǎo)致個(gè)體死亡。同樣，南亞野鯪(Labeorohita)在40 ℃脅迫30 d后出現(xiàn)鰓絲水腫、增生和壞死現(xiàn)象[24]。試驗(yàn)結(jié)果表明，37 ℃對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”幼魚的生理健康已經(jīng)構(gòu)成威脅，這與預(yù)試驗(yàn)存活率結(jié)果一致(37 ℃組的成活率低于50%)。因此，在大規(guī)模健康養(yǎng)殖中應(yīng)做好相應(yīng)的防護(hù)措施，避免因高溫脅迫造成的魚類死亡事件發(fā)生。

3.2 急性高溫脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”幼魚HSPs基因表達(dá)的影響

熱應(yīng)激蛋白(HSPs)是機(jī)體細(xì)胞受環(huán)境刺激誘導(dǎo)而產(chǎn)生的具有高度保守性的一組重要的非特異性細(xì)胞保護(hù)性蛋白，主要包括HSP100家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族及小分子量smHSP家族[11,24]。其中，HSP70家族被認(rèn)為是在進(jìn)化上最保守和最重要的熱應(yīng)激蛋白家族，主要分為兩類：組成型熱應(yīng)激蛋白70(HSC70)和誘導(dǎo)型熱應(yīng)激蛋白70(HSP70)[26]。大量的研究表明，HSP70家族基因廣泛參與魚類應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，被作為魚類養(yǎng)殖中應(yīng)激程度、應(yīng)激能力、健康狀況檢測(cè)的分子標(biāo)記[27-29]。本試驗(yàn)不同溫度和時(shí)間脅迫下，大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”不同組織均表現(xiàn)出差異變化，這暗示著在高溫脅迫下HSPs參與了保護(hù)機(jī)體免受傷害的防護(hù)機(jī)制。隨著溫度的升高，大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟和鰓組織中HSP70和HSC70基因表達(dá)量在6 h時(shí)均顯著升高(P<0.05)，這與溫度脅迫下虹鱒[30]、印度鯪 (Cirrhinusmrigala)[31]和達(dá)氏鰉(Husodauricus)[26]HSP70 mRNA表達(dá)量，銀海鯛(Sparussarba)[32]、北美南部底鳉(Fundulusparvipinnis)[33]和白梭吻鱸[14]HSC70 mRNA表達(dá)量結(jié)果相似，原因可能是面對(duì)短時(shí)間的應(yīng)激，大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”可以通過誘導(dǎo)產(chǎn)生合成HSPs蛋白來提高機(jī)體耐受性，從而適應(yīng)環(huán)境應(yīng)激，這是魚體對(duì)外界環(huán)境進(jìn)行自主適應(yīng)的生理表現(xiàn)。同時(shí)，HSP70和HSC70表達(dá)量在不同組織均在37 ℃達(dá)到最大值，這與36 ℃脅迫白梭吻鱸2 h后腦中HSC70 mRNA表達(dá)量最高[14]的結(jié)果一致，推測(cè)可能是因?yàn)槊{迫時(shí)間較短，臟器損傷未達(dá)到能使其組織中HSC70 mRNA表達(dá)量下降的程度。

隨著脅迫時(shí)間延長至48 h，28 ℃組肝臟和鰓組織中HSP70 mRNA表達(dá)量降至對(duì)照組水平，表明大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”在28 ℃溫度下可以適應(yīng)，并且在受到刺激后建立新的平衡。但是31 ℃組鰓組織中 HSP70 mRNA表達(dá)量依舊顯著高于對(duì)照組，推測(cè)可能是由不同組織面對(duì)高溫脅迫的敏感度不同所致[34]。同樣的，在高溫脅迫條件下，褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)脾、肝、鰓和腎組織HSP70基因表達(dá)量約在2 h時(shí)達(dá)到峰值，而腸、胃、肌、心和腦則是6 h達(dá)到峰值[35]。37 ℃組的肝臟和鰓組織中HSP70和HSC70 mRNA表達(dá)量表達(dá)水平急劇下降，均低于對(duì)照組，可能是HSPs蛋白對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用只能在一定范圍內(nèi)，如果應(yīng)激強(qiáng)度過高，會(huì)引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組成的異常，體內(nèi)平衡被打破，最終導(dǎo)致HSPs基因表達(dá)量降低。肝臟組織出現(xiàn)的大量空泡和鰓組織出現(xiàn)末端卷曲充血也表明37 ℃高溫會(huì)使魚體組織受損，同時(shí)48 h時(shí)37 ℃組的存活率僅為50%也印證了這一點(diǎn)。另外，孫永旭等[36]研究認(rèn)為，大口黑鱸肝臟中HSP70蛋白含量隨溫度升高而先升后降，29 ℃組最高，但組間無顯著性差異；鰓組織中HSP70蛋白含量隨溫度升高變化不大，認(rèn)為這可能是因?yàn)闄C(jī)體對(duì)無法抵抗過高程度應(yīng)激所造成的脅迫損傷，進(jìn)而表現(xiàn)為HSP70蛋白表達(dá)水平的降低，這說明33 ℃可能對(duì)于普通大口黑鱸屬于高程度應(yīng)激。而本試驗(yàn)的結(jié)果表明，高于37 ℃的溫度對(duì)于大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”才可能屬于高程度應(yīng)激，可以猜想是否大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”相較于普通大口黑鱸具有較高的耐高溫脅迫性，這還可能跟脅迫時(shí)間長短有關(guān)，另外可能mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)屬于轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)不同過程的調(diào)控，存在時(shí)間差異，還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果初步表明，高溫脅迫會(huì)對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟和鰓造成一定應(yīng)激損傷，當(dāng)面對(duì)低于34 ℃的應(yīng)激時(shí)，魚體會(huì)進(jìn)行自我保護(hù)和自我調(diào)節(jié)，從而建新的平衡來適應(yīng)環(huán)境；當(dāng)水溫高于37 ℃時(shí)，會(huì)造成魚體組織受損，自我調(diào)節(jié)能力喪失，體內(nèi)平衡被打破，進(jìn)而導(dǎo)致個(gè)體死亡。