姜曉東，成永旭，楊雨虹，吳旭干

( 1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306； 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036； 4.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306 )

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)與日本絨螯蟹(E.japonicus)同屬甲殼綱、方蟹科、絨螯蟹屬，是我國(guó)經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的蟹類(lèi)[1]。中華絨螯蟹在中國(guó)的分布范圍較廣，于福建閩江及其以北的長(zhǎng)江、黃河、遼河、甌江和圖們江等流域的沿海河流湖泊中均有分布，其中長(zhǎng)江流域中華絨螯蟹在池塘養(yǎng)殖條件下具有生長(zhǎng)快、成蟹規(guī)格大和品質(zhì)高等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)最主要的養(yǎng)殖群體[2-3]。此外，20世紀(jì)初被偶然帶入德國(guó)的中華絨螯蟹在海外大量繁殖并形成了數(shù)量龐大的種群，隨著分布范圍不斷擴(kuò)大，目前歐洲大陸和北美洲大陸各水域也存在中華絨螯蟹的分布[4-5]。日本絨螯蟹在我國(guó)的分布范圍有限，僅分布于我國(guó)廣西、廣東、福建和臺(tái)灣等沿海省份，但日本絨螯蟹在朝鮮西岸及日本沿岸的各大河流及淺海中分布量較大，在日本本土擁有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6-7]。

綏芬河是流經(jīng)中國(guó)東北地區(qū)和俄羅斯濱海邊疆區(qū)的一條跨界河流，發(fā)源于中國(guó)吉林省東部，流經(jīng)黑龍江省東寧市，最后于俄羅斯濱海邊疆區(qū)南部(符拉迪沃斯托克)注入日本海的阿穆?tīng)枮?。?jù)報(bào)道，綏芬河自古便擁有豐富的絨螯蟹野生資源，人們普遍認(rèn)為綏芬河流域野生絨螯蟹為從日本海溯游至中國(guó)境內(nèi)的日本絨螯蟹，但有關(guān)該流域絨螯蟹屬何種絨螯蟹的相關(guān)研究較少[8]。王武等[9]曾比較長(zhǎng)江、合浦、綏芬河和遼河4水系絨螯蟹的形態(tài)特征差異，但所用綏芬河個(gè)體為取自俄羅斯符拉迪沃斯托克并移至遼寧省盤(pán)錦市的人工繁殖后代，并非是中國(guó)境內(nèi)綏芬河絨螯蟹的野生原代，故參考價(jià)值有限。為充分利用綏芬河流域的絨螯蟹野生資源，當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶(hù)在政府的支持下將綏芬河野生絨螯蟹親本運(yùn)輸至人工土池生態(tài)育苗技術(shù)較為成熟的遼河流域用于交配繁殖，且已取得較好的效果[10-11]。但潛在危險(xiǎn)不容忽視，如果綏芬河流域絨螯蟹的確為日本絨螯蟹，其所產(chǎn)子代逃逸至遼河流域無(wú)疑將會(huì)導(dǎo)致遼河水系中華絨螯蟹的種質(zhì)混雜，從而導(dǎo)致1齡早熟率升高、商品蟹規(guī)格變小和抗病力下降等現(xiàn)象發(fā)生[12]。因此，通過(guò)簡(jiǎn)捷有效的方法確認(rèn)綏芬河絨螯蟹與其他地理種群絨螯蟹的親緣關(guān)系顯得尤為重要。

地標(biāo)點(diǎn)幾何形態(tài)測(cè)量法是指先選取具有明顯特征且容易辨識(shí)的點(diǎn)并采集信息，后用軟件分析組間差異，具有同源性、易于采集數(shù)據(jù)和易于分析等優(yōu)點(diǎn)[13]。近些年來(lái)，地標(biāo)點(diǎn)法在水生動(dòng)物形態(tài)的研究中得到普遍應(yīng)用，其中以甲殼類(lèi)和軟體動(dòng)物為代表的無(wú)脊椎動(dòng)物和以魚(yú)類(lèi)為代表的脊椎動(dòng)物的研究最為廣泛[14]。就絨螯蟹而言，地標(biāo)點(diǎn)法已成功用于長(zhǎng)江水系不同產(chǎn)地中華絨螯蟹以及不同水系中華絨螯蟹的種群鑒別[15-16]。鑒于此，筆者以絨螯蟹頭胸甲作為研究對(duì)象，以地標(biāo)點(diǎn)幾何形態(tài)測(cè)量法作為形態(tài)特征分析方法，探討綏芬河絨螯蟹與以長(zhǎng)江水系絨螯蟹為代表的中華絨螯蟹以及與以我國(guó)合浦和日本本土絨螯蟹為代表的日本絨螯蟹的形態(tài)特征差異，以期為綏芬河絨螯蟹的資源利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

2017年9—11月于黑龍江省牡丹江市、江蘇省鎮(zhèn)江市、廣西省北海市和日本兵庫(kù)縣的天然水域中采集野生絨螯蟹，每一地理種群隨機(jī)采集性成熟且四肢健全的雌、雄樣本各15只。各水系絨螯蟹的采集時(shí)間、采集地點(diǎn)以及平均體質(zhì)量等信息見(jiàn)表1。

表1 不同種群絨螯蟹樣品采集信息表

1.2 幾何形態(tài)測(cè)量分析

1.2.1 地標(biāo)點(diǎn)的建立與提取

將處理好的頭胸甲放置于翻拍架上，用Nikon D300單反相機(jī)進(jìn)行拍攝。相機(jī)固定于翻拍架防止抖動(dòng)，在相機(jī)和翻拍架上均放置水平儀，以保證鏡頭和拍攝面完全垂直。拍攝時(shí)鏡頭與樣品間的距離保持約30 cm，頭胸甲放置于成像區(qū)域的正中位置，使鏡頭同樣與頭胸甲垂直。在相同目鏡物鏡倍數(shù)下拍攝取得頭胸甲形態(tài)的二維影像后，利用tpsDig2軟件對(duì)頭胸甲進(jìn)行數(shù)字化標(biāo)點(diǎn)(圖1)，并建立地標(biāo)點(diǎn)數(shù)據(jù)文件。

1.2.2 平均形與薄板樣條分析

用tpsRelw軟件疊印出地標(biāo)點(diǎn)分布情況, 對(duì)每個(gè)樣本的地標(biāo)點(diǎn)進(jìn)行平移置中、旋轉(zhuǎn)和縮放，計(jì)算所有樣本地標(biāo)點(diǎn)的平均坐標(biāo)，得到平均形。根據(jù)平均形進(jìn)行局部扭曲和相對(duì)扭曲主成分分析，并保存軟件生成的相對(duì)扭曲得分(RW)矩陣和分析報(bào)告用于后續(xù)分析。利用tpsRegr軟件進(jìn)行薄板樣條分析，解析地標(biāo)點(diǎn)差異，以可視化圖例的方式來(lái)展示頭胸甲的變異部位。

1.2.3 判別分析與聚類(lèi)分析

利用各樣本的相對(duì)扭曲得分，采用歐氏距離的未加權(quán)組內(nèi)平均法進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，采用Bayes方法進(jìn)行逐步判別分析，分析軟件為SPSS 24.0。

圖1 絨螯蟹頭胸甲的地標(biāo)點(diǎn)位置[16]Fig.1 Landmark locations on the carapace of mitten crab

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析

相對(duì)扭曲主成分分析共提取了12個(gè)主成分，其中雌、雄個(gè)體第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的累積貢獻(xiàn)率均超過(guò)50.00%(分別為54.17%和59.39%)，說(shuō)明第1和第2主成分可以概括不同水系之間主要的形態(tài)特征差異(表2)。從第1和第2主成分繪制的散點(diǎn)圖可以看出，無(wú)論雌體還是雄體，長(zhǎng)江群體與綏芬河群體部分重疊并形成較為集中的一塊區(qū)域，說(shuō)明這兩群體形態(tài)特征較為接近。此外，日本群體與合浦群體無(wú)散點(diǎn)重疊且形成另外一塊較為集中的區(qū)域，這說(shuō)明相對(duì)于長(zhǎng)江群體與綏芬河群體而言，日本群體與合浦群體形態(tài)特征更為接近(圖2)。

2.2 差異可視化分析

利用tpsRelw軟件根據(jù)地標(biāo)點(diǎn)數(shù)據(jù)文件計(jì)算的平均形和重疊后的效果見(jiàn)圖3，通過(guò)tpsRegr軟件進(jìn)行扭曲、回歸分析和置換檢驗(yàn)后的網(wǎng)格圖見(jiàn)圖4。通過(guò)比較平均形與各水系網(wǎng)格圖可以發(fā)現(xiàn)，各水系之間存在差異的形態(tài)特征主要為頭胸甲額刺和側(cè)刺的位置。

表2 相對(duì)扭曲得分主成分的特征值和累積貢獻(xiàn)率 %

圖2 不同地理種群絨螯蟹形態(tài)特征的第1和第2主成分散點(diǎn)示意Fig.2 Scatter plots of PC1 and PC2 of wild mitten crab from different populationsSF.綏芬河；YZ.長(zhǎng)江；HP.合浦；JP.日本；下同.SF.Suifen River; YZ.Changjiang River; HP.Hepu; JP.Japan; et sequentia.

圖3 不同群體絨螯蟹頭胸甲的平均形和疊加示意Fig.3 Mean shape and vectorization of landmarks on carapace of wild mitten crab from different populations

2.3 判別分析

用SPSS進(jìn)行逐步判別分析時(shí)，分別從雌雄個(gè)體的相對(duì)扭曲得分中篩選出對(duì)判別貢獻(xiàn)率較大的4個(gè)變量建立判別方程，用于各水系絨螯蟹的初步判別，判別方程系數(shù)見(jiàn)表3。建立判別方程后，將事先測(cè)量的指標(biāo)代入上述判別公式判斷所屬群體，逐步判別分析的結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，綏芬河、長(zhǎng)江、合浦和日本的各30只絨螯蟹樣本中，僅個(gè)別綏芬河和長(zhǎng)江群體絨螯蟹受到誤判，判別準(zhǔn)確率為87%～93%，而合浦和日本絨螯蟹雌、雄個(gè)體未發(fā)生誤判，判別準(zhǔn)確率均為100%。

2.4 聚類(lèi)分析

采用歐式距離系數(shù)、最短距離法構(gòu)建的聚類(lèi)圖見(jiàn)圖5。無(wú)論雌體還是雄體，該聚類(lèi)分析將試驗(yàn)樣本分為兩大組，其中長(zhǎng)江群體和綏芬河群體最先聚為一支，而合浦群體和日本群體被聚為另外一支。

3 討 論

3.1 綏芬河絨螯蟹與日本絨螯蟹形態(tài)特征差異

利用基于地標(biāo)點(diǎn)的幾何形態(tài)測(cè)量法量化形態(tài)特征差異并用于不同物種或不同地理種群之間的鑒別正受到越來(lái)越多的關(guān)注。由于絨螯蟹具有堅(jiān)硬的甲殼和近足類(lèi)動(dòng)物的足部，它們可以為形態(tài)特征分析提供豐富而準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。如鄭朝臣等[15]通過(guò)地標(biāo)點(diǎn)法區(qū)分長(zhǎng)江水系不同產(chǎn)地的池塘養(yǎng)殖絨螯蟹，姜曉東等[16]利用地標(biāo)點(diǎn)法考察幾大水系野生中華絨螯蟹的形態(tài)特征差異。本研究中，相對(duì)于日本本土與合浦流域的日本絨螯蟹，聚類(lèi)分析將長(zhǎng)江群體和綏芬河群體最先聚為一支，主成分分析中長(zhǎng)江群體與綏芬河群體部分重疊并形成較為集中的一塊區(qū)域，此外判別分析中長(zhǎng)江群體與綏芬河群體之間存在一定的誤判風(fēng)險(xiǎn)，這些結(jié)果均清晰地表明，綏芬河流域絨螯蟹與長(zhǎng)江水系絨螯蟹形態(tài)特征更為接近，因此它們應(yīng)該均屬于中華絨螯蟹。而王武等[9]研究表明，綏芬河絨螯蟹的形態(tài)特征與日本絨螯蟹更為接近，這可能是由于其綏芬河絨螯蟹采集于綏芬河與日本海交匯的俄羅斯符拉迪沃斯托克，而本研究中綏芬河絨螯蟹采集于綏芬河在中國(guó)境內(nèi)的河段，從而造成兩者結(jié)果迥異。此外，遼河水系扣蟹常被銷(xiāo)往黑龍江地區(qū)供成蟹養(yǎng)殖，綏芬河流域野生個(gè)體受到了逃逸至自然水體中遼河水系中華絨螯蟹的基因干擾，其外形特征也逐漸趨同于中華絨螯蟹。

表4 不同地理種群絨螯蟹判別結(jié)果

圖5 不同地理種群絨螯蟹聚類(lèi)Fig.5 Dendrogram of cluster analysis among different geographic populations of wild mitten crab

3.2 綏芬河絨螯蟹與中華絨螯蟹形態(tài)特征差異

雖然主成分分析中長(zhǎng)江群體和綏芬河群體中部分散點(diǎn)相互重疊，但兩群體大體上相對(duì)集中，此外，雖然判別分析中長(zhǎng)江群體和綏芬河群體個(gè)體之間存在誤判風(fēng)險(xiǎn)，但整體判別準(zhǔn)確率較高(87%～93%)，這些結(jié)果均說(shuō)明，長(zhǎng)江群體和綏芬河群體絨螯蟹之間仍存在一定的形態(tài)特征差異。已有研究表明，不同地理?xiàng)l件下水生動(dòng)物的形態(tài)差異與其棲息環(huán)境相適應(yīng)，底質(zhì)、水流、溫度和食物等環(huán)境因素均能產(chǎn)生如體型和行為等方面的形態(tài)差異[17]。本研究中，兩群體中華絨螯蟹所生存的長(zhǎng)江與綏芬河環(huán)境條件各具特點(diǎn)，兩群體形態(tài)特征在生長(zhǎng)過(guò)程中均產(chǎn)生了適應(yīng)性變化，加之長(zhǎng)期的地理隔離，從而形成明顯的形態(tài)特征差異[18]。在之前形態(tài)可塑性的研究中，美洲藍(lán)蟹(Callinectessapidus)在含有敵害生物的環(huán)境中蛻殼數(shù)次后側(cè)刺長(zhǎng)度顯著增加[19]，此外，不同水系野生絨螯蟹移至池塘并人工養(yǎng)殖一代后形態(tài)特征趨于一致[20]，均體現(xiàn)出甲殼動(dòng)物側(cè)刺在野外環(huán)境中抵御敵害的功能，因此本研究中兩群體間的形態(tài)差異還可能與其所屬水域的生物資源特性有關(guān)。但表型特征的地理差異也可能是遺傳物質(zhì)長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，因此很難判斷觀察到的這些形態(tài)差異哪些直接受到環(huán)境的誘導(dǎo)，哪些由基因控制[21]。與頭胸甲上額刺、側(cè)刺、疣突和凹槽等形態(tài)結(jié)構(gòu)相比，四肢作為絨螯蟹直接接觸自然環(huán)境的部位，應(yīng)當(dāng)可以更充分地反映環(huán)境差異所導(dǎo)致的形態(tài)特征差異，但如何突破硬組織的限制而采集絨螯蟹附肢等結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差部位的形態(tài)信息，仍需進(jìn)一步嘗試。

3.3 中華絨螯蟹與日本絨螯蟹形態(tài)特征差異

中華絨螯蟹與日本絨螯蟹是分布于我國(guó)大陸沿海最主要的兩種絨螯蟹，基于傳統(tǒng)形態(tài)測(cè)量法對(duì)主要流域中野生中華絨螯蟹和日本絨螯蟹形態(tài)特征進(jìn)行多變量分析的研究已有充分報(bào)道。李晨虹等[22]通過(guò)聚類(lèi)分析將長(zhǎng)江、甌江、遼河和黃河水系的中華絨螯蟹聚為一支，將珠江和合浦的日本絨螯蟹聚為另外一支；高天翔等[6]在對(duì)10個(gè)日本絨螯蟹群體與中華絨螯蟹形態(tài)特征的主成分分析中，日本絨螯蟹與中華絨螯蟹被完全分為兩大支；王武等[23]在對(duì)歐洲萊茵河、長(zhǎng)江和合浦水域絨螯蟹形態(tài)特征的聚類(lèi)分析中，長(zhǎng)江和歐洲萊茵河野生中華絨螯蟹先聚為一類(lèi)，然后再與合浦流域的日本絨螯蟹相聚；王茜等[24]通過(guò)聚類(lèi)分析將海河、甌江、遼河和長(zhǎng)江水系的中華絨螯蟹聚為一大支，將合浦和俄羅斯的日本絨螯蟹聚為另外一大支。本研究基于地標(biāo)點(diǎn)法對(duì)長(zhǎng)江、黃河、遼河和甌江水系野生中華絨螯蟹的聚類(lèi)分析結(jié)果與之類(lèi)似，主成分分析中綏芬河群體與長(zhǎng)江群體形成較為集中的一塊區(qū)域，而日本群體與合浦群體形成另外一塊較為集中的區(qū)域，此外，聚類(lèi)分析中長(zhǎng)江群體和綏芬河群體最先聚為一支，而合浦群體和日本群體被聚為另外一支，這些結(jié)果均驗(yàn)證了中華絨螯蟹與日本絨螯蟹之間的形態(tài)特征差異。在絨螯蟹屬的種類(lèi)區(qū)分和種群識(shí)別中，頭胸甲上額刺、側(cè)刺、疣突和凹槽等形態(tài)結(jié)構(gòu)均為重要的分類(lèi)依據(jù)[25-26]。本研究形態(tài)差異可視化分析中，額刺和側(cè)刺的形態(tài)特征同樣差異較大，主要表現(xiàn)為長(zhǎng)江群體和綏芬河群體絨螯蟹的額刺和側(cè)刺長(zhǎng)度稍長(zhǎng)于日本群體與合浦群體絨螯蟹，而疣突和凹槽位點(diǎn)差異較小，這與之前研究中日本絨螯蟹與不同水系中華絨螯蟹形態(tài)特征比較的結(jié)果相一致[7]。

4 結(jié) 論

綜上，地標(biāo)點(diǎn)幾何形態(tài)測(cè)量法的結(jié)果表明，相對(duì)于日本本土和合浦流域的日本絨螯蟹，綏芬河流域野生絨螯蟹的形態(tài)特征更接近于長(zhǎng)江水系的中華絨螯蟹，這說(shuō)明綏芬河絨螯蟹應(yīng)屬中華絨螯蟹，同時(shí)也驗(yàn)證了中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的形態(tài)特征差異。綏芬河流域絨螯蟹與我國(guó)其他各水系絨螯蟹的親緣關(guān)系有待通過(guò)分子生物學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。