趙艷芳，寧勁松，康緒明，丁海燕，翟毓秀，尚德榮，盛曉風

( 中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室，山東 青島 266071 )

砷是世界范圍內(nèi)危害最大的環(huán)境污染物之一，2017年被美國有毒物質(zhì)與疾病登記署和環(huán)境保護署列為“優(yōu)先污染物列表”的首位[1]。自然界中不同來源的砷元素通過陸地徑流、廢水排放等途徑進入海洋生態(tài)系統(tǒng)，砷污染已成為我國近海區(qū)域嚴重的環(huán)境問題之一[2]。有研究表明，砷在許多海洋食物鏈(網(wǎng))中被生物放大，能造成高營養(yǎng)級生物中砷的富集，可對生物與人類健康產(chǎn)生潛在危害[3]。海洋生物普遍具有較高的砷累積，導致海產(chǎn)品攝入成為人體暴露砷元素的主要途徑之一。研究表明,人們?nèi)粘ｏ嬍持屑s90%的砷來自于海產(chǎn)品[4]。

砷在海水和沉積物中主要以無機砷形式存在，轉(zhuǎn)移到生物體內(nèi)的砷可能會轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N價態(tài)的砷化合物。研究表明，無機砷形式的三價無機砷[As(Ⅲ)]和五價無機砷[As(Ⅴ)]具有較高的毒性和致癌性，有機砷包括低毒的一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)，微毒的砷糖(AsS)、砷甜菜堿(AsB)等[3-4]。海洋生物對砷的富集及形態(tài)轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究表明，不同海洋生物對無機砷的富集能力不同，如貽貝對無機砷富集能力較弱，而牡蠣對無機砷有較強的富集和轉(zhuǎn)化能力[5]，菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)對三價砷的生物利用度高于五價砷，且砷更易于在肝胰腺中積累，無機砷在菲律賓蛤仔鰓組織中主要轉(zhuǎn)化為二甲基砷酸，肝胰腺中主要轉(zhuǎn)化為砷甜菜堿[6-7]。

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是我國海水養(yǎng)殖和增殖的重要經(jīng)濟蟹類[8-10]，因其味道鮮美且營養(yǎng)價值高，深受消費者喜愛。同時作為一種營養(yǎng)級別較高的甲殼類海產(chǎn)生物，海蟹類對砷元素具有較強的富集能力[11]。水相暴露和食物相暴露是海洋生物累積痕量元素的主要途徑[12]。研究證明，通過食物相暴露的砷主要是有機砷，而無機砷很少，因為砷在海洋生物體內(nèi)主要以砷甜菜堿形態(tài)存在，使得砷甜菜堿成為通過食物鏈傳遞和儲存的砷的最終形態(tài)[13-15]。而海水中的砷元素主要以無機砷形態(tài)存在，因此研究生物體對水相中無機砷的富集轉(zhuǎn)化規(guī)律對于揭示砷的毒性和健康風險具有重要意義。筆者研究海水中不同質(zhì)量濃度的三價無機砷和五價無機砷在三疣梭子蟹3種可食組織中的富集與轉(zhuǎn)化情況，旨在闡明三疣梭子蟹對不同價態(tài)無機砷的積累和轉(zhuǎn)化規(guī)律，同時為三疣梭子蟹安全養(yǎng)殖和食用安全提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

成熟雌性三疣梭子蟹于2018年10月購自青島市西海岸新區(qū)蟹類養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖用海水中無機砷本底值為(1.11±0.21) μg/L。選取健康、活力強、規(guī)格基本一致的三疣梭子蟹[全甲寬(140.02±15.14) mm]于實驗室暫養(yǎng)96 h，暫養(yǎng)結(jié)束后隨機分組用于試驗。暫養(yǎng)和正式試驗期間，保持室溫和自然光照，海水平均溫度(16.5±1.7) ℃，pH 8.1±0.02，24 h持續(xù)充氧。

1.2 試驗方法

試驗在5個500 L的聚乙烯水族箱中進行，養(yǎng)殖水體300 L，各放入30只經(jīng)暫養(yǎng)凈化的成熟雌性三疣梭子蟹。稱取適量的砷酸鈉和三氧化二砷固體，溶解稀釋后分別配成10 mg/mL的三價無機砷和五價無機砷儲備液。根據(jù)養(yǎng)殖用海水中無機砷的含量，并參考文獻[6]，設定三價無機砷和五價無機砷的暴露質(zhì)量濃度分別為0.01 mg/L和0.10 mg/L，共4個暴露組。對照組為干凈過濾的新鮮海水，不添加無機砷，且對照海水中無機砷本底值為(1.18±0.16) μg/L。暴露時間為7 d，采用半靜態(tài)試驗方法，每隔24 h完全換水1次，并分別添加準確質(zhì)量濃度的三價和五價無機砷含量，分別于暴露的第1、3、5、7天隨機取梭子蟹3只，立即解剖分離出肝胰腺、性腺和肌肉3種可食組織，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。釋放試驗為28 d，將各試驗箱中換成300 L自然海水，每隔24 h完全換水1次，分別于釋放階段的第7、14、21、28天隨機取梭子蟹3只，立即解剖分離出3種可食組織，并低溫保存?zhèn)溆谩Ｕ麄€試驗期間，各處理組的三疣梭子蟹均無死亡現(xiàn)象發(fā)生。

1.3 砷形態(tài)分析

取均質(zhì)后的梭子蟹3種可食組織約1.0 g于50 mL離心管中，加入20 mL超純水，渦旋混勻后，超聲提取40 min，4 ℃，8000 r/min離心10 min后，吸取上清液過0.45 μm濾膜，濾液注入高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-ICP-MS)對砷甜菜堿、三價無機砷、五價無機砷、一甲基砷酸和二甲基砷酸5種形態(tài)的砷進行定性和定量分析。

高效液相色譜HPLC(Series 200，Perkin-Elmer)，分離條件：陰離子保護柱IonPac AG 19 (50 mm×4 mm)，陰離子分析柱IonPac AS 19(250 mm×4 mm)；流動相，A相組成(10 mmol/L無水乙酸鈉，3 mmol/L硝酸鉀，2 mmol/L磷酸二氫鈉，0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，pH 10.7)，B相組成(無水乙醇)，V(A)∶V(B)=99∶1；流速1.0 mL/min；進樣量30 μL。儀器自動積分，以峰面積計算所含各形態(tài)砷的量。三價無機砷的方法檢出限為0.002 mg/kg，五價無機砷的方法檢出限為0.004 mg/kg。電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS(DRC Ⅱ，Perkin-Elmer)，工作參數(shù)：射頻功率1150 W，等離子體氣流速15 L/min，輔助氣流速1.2 L/min。

1.4 總砷含量分析

準確稱取三疣梭子蟹3種可食組織1.0 g于聚四氟乙烯微波消解罐中，每個樣品中加入8.0 mL濃硝酸(優(yōu)級純)，搖勻后加蓋放置過夜，將樣品進行預消解后，將樣品放入微波消解系統(tǒng)中，設置適宜的微波消解程序，進行消解。消解完畢后，趕酸至1～2 mL，冷卻至室溫后用超純水定容至50 mL，ICP-MS上機測定。微波消解和趕酸程序見表1。同時做試劑空白試驗，采用扇貝粉(GBW10024)作為質(zhì)控樣進行結(jié)果質(zhì)量控制，對質(zhì)控樣品總砷含量的5次測定結(jié)果表明，測定值為(3.52±0.23) mg/kg，在標準值3.0～4.2 mg/kg內(nèi)，說明該測定方法的準確度高。

表1 微波消解程序

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對不同組織對砷的富集能力進行比較分析，對不同組織中砷的含量在暴露與釋放過程中的變化進行單因子方差分析，采用Sigma plot 12.5作圖，Excel軟件進行測定數(shù)據(jù)平均值與標準偏差的分析處理，試驗數(shù)據(jù)為3次測定的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹可食組織中總砷含量變化

受三價和五價無機砷暴露后，三疣梭子蟹可食組織中總砷的含量隨著暴露劑量的升高和暴露時間延長以及在釋放過程中的變化見圖1、圖2。為比較不同組織對砷的富集能力，對不同組織富集三價和五價無機砷過程中的總砷含量進行t檢驗，分析發(fā)現(xiàn)，肌肉組織對砷的富集能力均顯著低于性腺和肝胰腺，而性腺和肝胰腺對砷的富集能力之間無顯著差異。

圖1 三價無機砷富集與釋放過程中三疣梭子蟹可食組織中總砷含量Fig.1 Total As content in the edible tissues of swimming crab P. trituberculatus during As (Ⅲ) accumulation and releaseA.富集； E.釋放； 不同字母表示相同處理組砷含量隨不同暴露/釋放時間變化呈顯著性差異(P<0.05)；下同.A.accumulation; E.release; means with different letters are significant differences with the changes in exposure/release periods (P<0.05); et sequentia.

圖2 五價無機砷富集與釋放過程中三疣梭子蟹可食組織中總砷含量Fig.2 Total As content in the edible tissues of swimming crab P. trituberculatus during As (Ⅴ) accumulation and release

在對三價無機砷的富集與釋放的過程中，不同組織中總砷含量的變化不同。對于肌肉組織，總砷含量隨三價無機砷質(zhì)量濃度的升高和試驗時間的延長沒有顯著的變化規(guī)律。對于性腺組織，在富集試驗期間，總砷含量的升高趨勢不明顯，但高質(zhì)量濃度暴露組中總砷含量高于低質(zhì)量濃度暴露組。在釋放試驗期間，0.01 mg/L和0.10 mg/L三價無機砷處理組性腺組織中的總砷含量呈顯著下降趨勢。對于肝胰腺組織，高質(zhì)量濃度暴露組中總砷含量高于低質(zhì)量濃度暴露組，另外在暴露試驗和釋放試驗初期，高質(zhì)量濃度暴露組中總砷含量均呈現(xiàn)先顯著升高后逐漸下降趨勢，低質(zhì)量濃度暴露組的總砷含量在暴露期間無明顯變化規(guī)律，但在釋放試驗過程中的變化規(guī)律與高質(zhì)量濃度暴露組相同。釋放28 d后，2種暴露質(zhì)量濃度組性腺與肝胰腺組織中的砷含量均顯著低于空白對照組(P<0.05)。

三疣梭子蟹3種可食組織對五價無機砷的富集能力較弱，在富集與釋放過程中，肌肉組織中總砷含量無明顯的變化規(guī)律(圖2)。對于性腺組織，在富集過程中總砷含量變化規(guī)律不明顯，但在釋放28 d后，含量均下降。對于肝胰腺組織，總砷含量在暴露試驗期間也呈現(xiàn)出先顯著升高后下降的趨勢，且在釋放試驗過程中呈不斷下降的趨勢。同三價無機砷處理組相同，至釋放試驗結(jié)束后，性腺和肝胰腺組織中總砷含量下降至顯著低于對照組水平(P<0.05)。

2.2 三疣梭子蟹可食組織中砷形態(tài)變化

2.2.1 三價無機砷暴露

空白對照組三疣梭子蟹肌肉、性腺及肝胰腺3種組織中砷的主要賦存形態(tài)見圖3，三疣梭子蟹3種可食組織中砷的主要存在形態(tài)略有不同，主要表現(xiàn)在肌肉與性腺組織中砷主要以砷甜菜堿和二甲基砷酸形態(tài)存在，肝胰腺組織中主要以砷甜菜堿形態(tài)存在。

暴露于0.01 mg/L三價無機砷水環(huán)境中，3種可食組織中砷的賦存形態(tài)與對照組相同，其中肌肉組織中砷甜菜堿的含量低于性腺和肝胰腺組織，而不同組織之間二甲基砷酸含量無明顯區(qū)別，且各組織中的砷甜菜堿和二甲基砷酸含量在富集三價無機砷的過程中沒有明顯的變化規(guī)律(表2)。暴露在0.10 mg/L三價無機砷環(huán)境中，三疣梭子蟹可食組織中砷的存在形態(tài)發(fā)生變化。在富集的第1、3、5、7天中，肝胰腺組織中均檢測到低質(zhì)量濃度的三價無機砷(0.03～0.07 mg/kg)，且砷甜菜堿是主要存在形態(tài)，未檢測到二甲基砷酸；肌肉組織中砷主要以砷甜菜堿和二甲基砷酸形態(tài)存在，未檢測到無機砷；性腺組織中砷主要以砷甜菜堿和二甲基砷酸形態(tài)存在，在富集的第7天，檢測到低質(zhì)量濃度的三價無機砷。

圖3 三疣梭子蟹3種可食組織中砷形態(tài)譜圖Fig.3 Type analysis of As in three edible tissues of swimming crab P. trituberculatus

表2 三價無機砷暴露和釋放過程中三疣梭子蟹不同可食組織中不同砷形態(tài)含量 mg/kg

釋放過程中，低質(zhì)量濃度暴露組中三疣梭子蟹3種可食組織中砷的主要形態(tài)于暴露期間無變化，且各形態(tài)砷含量無顯著變化。高質(zhì)量濃度暴露組中肝胰腺組織在排出砷的7、14、21 d后均檢測到三價無機砷，含量為0.03～0.04 mg/kg，排出試驗28 d后，三價無機砷未檢出。而肌肉與性腺組織中，砷的主要形態(tài)仍以砷甜菜堿和二甲基砷酸為主。

2.2.2 五價無機砷暴露

0.01 mg/L五價無機砷富集和釋放過程中，三疣梭子蟹3種可食組織中砷的主要賦存形態(tài)與低質(zhì)量濃度三價無機砷處理組相同，即肌肉與性腺組織中的砷主要以砷甜菜堿和二甲基砷酸形態(tài)存在，肝胰腺組織中主要以砷甜菜堿形態(tài)存在(表3)。

由表3可見，對高質(zhì)量濃度五價無機砷(0.10 mg/L)富集過程中，第1天，在肝胰腺組織中AsB是主要砷形態(tài)，此外還檢測到0.03 mg/kg三價無機砷和0.04 mg/kg五價無機砷，而在肌肉與性腺組織中未有無機砷積累。第3天時，肝胰腺組織中有砷甜菜堿和0.02 mg/kg三價無機砷檢出，肌肉與性腺組織中均未有無機砷積累。余下的富集和釋放試驗中，3種可食組織中均未檢出無機砷，并且肌肉與性腺組織中砷的主要賦存形態(tài)及其含量變化規(guī)律與三價無機砷處理組相同。

表3 五價無機砷暴露和釋放過程中三疣梭子蟹不同可食組織中不同砷形態(tài)含量 mg/kg

3 討 論

3.1 三疣梭子蟹可食組織對無機砷的富集代謝

海洋動物富集的砷含量普遍較高，如多毛類和腹足類等底棲生物[16]。嚴國等[11]對包括青蟹(Scyllaserrata)、三疣梭子蟹、日本蟳(Charybdisjaponica)和細點圓趾蟹(Ovalipespunctatus)等158個海蟹類樣品中總砷含量分析發(fā)現(xiàn)，海蟹類是砷高富集產(chǎn)品，總砷含量達0.37～35.81 mg/kg。本試驗也發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)暴露三疣梭子蟹肌肉、性腺和肝胰腺組織中總砷含量分別為2.19，4.00、3.32 mg/kg。海蟹對金屬元素的富集要包括兩種途徑，一是通過鰓富集水相中的金屬離子，二是通過攝食途徑。已有試驗表明，許多海洋生物對海水中無機砷的富集能力較低，如紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)暴露在100 μg/L 的三價和五價無機砷10 d后，組織中總砷含量沒有顯著變化[17]。褐蝦(Crangoncrangon)在100 μg/L 的五價無機砷暴露24 d后組織中總砷含量與對照組無顯著變化[18]?；ㄉ?Teraponjarbua)幼魚在100 μg/L 三價和五價無機砷暴露10 d后體內(nèi)積累的總砷含量也很少[19]。對菲律賓蛤仔進行30 d 無機砷暴露后發(fā)現(xiàn)，鰓部累積的砷顯著高于消化腺，蛤體內(nèi)砷的主要形態(tài)為砷甜菜堿和二甲基砷酸[6-7]。無機砷在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)體內(nèi)的富集系數(shù)較小[20]，紫貽貝在質(zhì)量濃度100 μg/L的砷暴露下，生物富集系數(shù)為15.41，遠低于對汞、鉛、鎘等元素的富集能力[21]。牡蠣對砷的富集能力也遠低于汞、鎘、鉛等元素[22]。本試驗也表明，0.01和0.10 mg/L無機砷暴露7 d，與對照組相比，三疣梭子蟹肌肉組織中總砷含量變化未達到顯著性差異。且肌肉組織對砷的富集低于性腺和肝胰腺組織，而性腺和肝胰腺組織之間對砷的富集無顯著差異。釋放試驗28 d后，性腺和肝胰腺組織中總砷的含量顯著下降，說明這2種可食組織對砷的代謝能力較強。試驗同時發(fā)現(xiàn)在富集無機砷的過程中，尤其是高質(zhì)量濃度暴露組，肝胰腺組織中總砷含量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，這種現(xiàn)象可能是三疣梭子蟹對無機砷暴露的一種抵御機制。生物體吸收富集有害元素的過程中，有害元素在各組織之間會重新分配或轉(zhuǎn)移[12]，因此在三疣梭子蟹富集無機砷的過程中，各組織之間的砷可能會重新分配，肝胰腺組織中的砷轉(zhuǎn)移到鰓、血淋巴液等其他組織中，從而呈現(xiàn)先升后降的趨勢。

3.2 三疣梭子蟹可食組織中砷的形態(tài)轉(zhuǎn)化

海洋生物普遍具有將從環(huán)境中吸收的無機砷通過生物轉(zhuǎn)化合成砷甜菜堿的能力，這種生物轉(zhuǎn)化過程包括五價無機砷還原為三價無機砷，三價無機砷甲基化至一甲基砷酸和二甲基砷酸，以及經(jīng)過后續(xù)未知的過程合成砷甜菜堿[13-15]。在菲律賓蛤仔體內(nèi)不僅存在無機砷的還原甲基化過程，而且還存在三價無機砷氧化為五價無機砷的情況[6]。Zhang 等[5]發(fā)現(xiàn)僧帽牡蠣(Saccostreacucullata)在1 mg/L 三價無機砷暴露30 d后，組織中五價無機砷含量增加20倍。而在三疣梭子蟹組織中，三價和五價無機砷暴露處理后，肌肉、性腺和肝胰腺組織中砷的主要存在形式為砷甜菜堿和二甲基砷，無機砷非常少，主要以三價無機砷形式存在，說明存在砷酸鹽的還原，并不存在三價無機砷氧化為五價無機砷的情況。生物體將三價無機砷氧化為五價無機砷儲存在體內(nèi)可能是動物的一種解毒方式，將過多的三價無機砷轉(zhuǎn)化成毒性較低的五價無機砷貯存或隔離[6]。本試驗現(xiàn)象也可能說明，三疣梭子蟹對無機砷的耐性較高，或是本試驗設定的無機砷質(zhì)量濃度尚不能對三疣梭子蟹的3種可食組織產(chǎn)生毒性。

另外本試驗結(jié)果表明，暴露于相同質(zhì)量濃度的三價和五價無機砷，三疣梭子蟹肝胰腺組織對三價無機砷的積累能力較高，從暴露試驗第1天開始，至釋放試驗21 d后，均能檢出三價無機砷(表2)，而對于五價無機砷的積累能力較低，僅在暴露試驗1 d后，肝胰腺組織中檢出三價無機砷和五價無機砷，而在暴露試驗3 d后，僅能檢出三價無機砷(表3)。因此，三疣梭子蟹對三價無機砷的吸收利用高于五價無機砷，同樣的結(jié)果出現(xiàn)在菲律賓蛤仔[6]、僧帽牡蠣[5]的相關研究中，表明三價砷比五價砷可能更易于被生物體吸收代謝。

由于砷甜菜堿結(jié)構類似甜菜堿，其半致死質(zhì)量濃度大于10 000 mg/kg，被視為無毒的有機砷形態(tài)[23]，因此海洋生物體內(nèi)砷甜菜堿的合成，也是生物體的一項重要解毒機制[24]。本試驗結(jié)果表明，三疣梭子蟹肝胰腺組織中的砷主要以砷甜菜堿形態(tài)存在，并且在三價無機砷高質(zhì)量濃度暴露與釋放期間，體內(nèi)積累的三價無機砷主要儲存在肝胰腺組織，而肌肉與性腺組織中的砷以砷甜菜堿和二甲基砷酸兩種形態(tài)存在，且?guī)缀醪桓患療o機砷。試驗結(jié)果同時表明，在釋放試驗后期，肝胰腺組織中檢測到少量的砷的二甲基化產(chǎn)物，說明肝胰腺組織是梭子蟹無機砷甲基化的主要場所。肝胰腺也是菲律賓蛤仔無機砷轉(zhuǎn)化為砷甜菜堿的主要組織，這可能與參與無機砷轉(zhuǎn)化相關的蛋白在肝組織中表達量更高有關，還需要進一步試驗驗證。

海水蟹作為砷高富集品種[9]，但有關其高富集砷的特性機制及其主要的富集代謝途徑尚不清楚。本研究的富集代謝試驗表明，三疣梭子蟹對水相中三價無機砷的富集能力高于五價無機砷，而海水中五價無機砷是最主要的砷形態(tài)，其三價無機砷約占五價無機砷含量的13%[23]，因此，三疣梭子蟹雖然作為砷元素高富集生物，但是通過水相富集無機砷的作用較小。研究表明，砷在海洋食物鏈中能夠被生物放大，造成高營養(yǎng)級生物中的砷富集，并且有機砷比無機砷具有更高的食物鏈傳遞能力，可能導致海洋生物富集更高含量的砷[3]。因此，亟需開展三疣梭子蟹通過食物相對砷的富集和傳遞研究，探討砷的不同形態(tài)在食物鏈傳遞過程中的變化規(guī)律及其對砷生物富集放大的影響機制，以揭示三疣梭子蟹高富集砷的特性機制。

4 結(jié) 論

三疣梭子蟹肌肉組織對三價和五價無機砷的富集能力顯著低于性腺和肝胰腺，而性腺和肝胰腺兩種組織之間無顯著差異。三疣梭子蟹可食組織對三價無機砷的生物利用度高于五價無機砷，無機砷主要積累在肝胰腺組織中，而肌肉與性腺組織中無無機砷累積。肝胰腺組織中的砷主要以砷甜菜堿形態(tài)存在，而肌肉與性腺組織中的砷以砷甜菜堿和二甲基砷酸兩種形態(tài)存在。