劉敬 楊紫怡 閆偉華 劉鴻飛 楊學成

摘要： ?針對傳統(tǒng)熒光染料存在合成成本高、工藝復雜、毒副作用強等問題，本文基于一步水熱法，以間苯二酚和磷酸為原料，經(jīng)真空干燥箱中加熱，合成了具有成本低廉、生物相容性良好的納米級熒光染料碳量子點（carbon quantum dots，CQDs）。同時，對CQD的形貌、粒徑及光學特性進行表征，并對CQD的元素、官能團及其在不同pH環(huán)境下的熒光強度進行分析，將CQDs應用于癌細胞的熒光成像。研究結果表明，制備得到的CQDs具有尺寸均一，分散性良好等特點;該量子點的熒光強度可隨pH值的變化而改變，且在一定的pH值區(qū)間內，CQDs的熒光強度與pH值存在線性關系，證明該量子點可應用于對癌細胞的檢測及熒光成像。該研究對臨床醫(yī)學中的癌細胞識別及成像領域具有重要意義。

關鍵詞： ?碳量子點; 癌細胞; 熒光成像

中圖分類號： R318.51; R318.08 ?文獻標識碼： A

近年來，熒光成像技術發(fā)展日新月異，其在輔助治療癌細胞領域起到關鍵作用[1]。傳統(tǒng)的熒光染料大多含有苯環(huán)化合物，由于這些熒光染料合成成本高、工藝復雜、毒副作用強等因素，限制了其進一步應用，因此開發(fā)新型的熒光染料勢在必行。作為一種新型的碳納米材料，碳量子點因其水溶性好、光穩(wěn)定強等性能，受到人們的關注[13]。碳量子點（carbon quantum dots，CQDs）是一類由分散的類球狀碳顆粒組成的尺寸極小的納米顆粒，粒徑一般小于10 nm。2006年，Sun Y P等人[4]報道了具有獨特熒光性質的CQDs，世界各地的研究人員開始對CQDs進行更深入的研究。因其具有水溶性好、光學穩(wěn)定性強等眾多優(yōu)點，被廣泛用于醫(yī)學成像及熒光檢測等領域[57]。Wang T Y等人[8]以半胱氨酸和半乳糖為原料，利用不同濃度的堿溶液，合成具有藍、綠和黃三種顏色碳量子點，實驗證明其具有較好的生物相容性和穩(wěn)定的光學性能;Liu S等人[9]以青草為碳原料，通過水熱合成法制備了具有良好水溶性的氮摻雜碳量子點，成功用于Cu2+的檢測;Jiang K等人[10]以鄰苯二胺、間苯二胺和對苯二胺為原料，通過水熱合成法，制備出具有紅、綠、藍三色的碳量子點，并將其應用于細胞成像。盡管研究人員通過多種方式合成了CQDs，但由于合成工藝復雜、步驟繁瑣、產(chǎn)值較低等問題，限制了碳量子點在熒光成像中的進一步應用。因此，如何找到一種既綠色環(huán)保，又簡便快捷的CQDs合成方法，是整個實驗中需要邁出的第一步?；诖?，本實驗通過簡單的一步水熱法，以間苯二酚和磷酸為原料，成功制備具有獨特熒光性質的CQDs。利用各種表征手段，分別對CQDs的形貌、元素及官能團進行表征，結果顯示所制備的CQDs尺寸均一、分散性良好。同時，通過熒光分光光度計對CQDs的光學性質進行表征，擬合出CQDs的熒光強度與pH值的線性回歸曲線，并以CQDs為熒光染料，成功將其應用于對癌細胞的檢測及熒光成像。該研究在臨床醫(yī)學成像領域意義重大。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

間苯二酚（國藥集團化學試劑有限公司），磷酸（國藥集團化學試劑有限公司），磷酸鹽緩沖液（上海源葉生物科技有限公司），F(xiàn)BZ1002UP型標準試劑純水機（青島富勒姆集團），Lambda 950型紫外可見分光光度計（上海普利賽斯集團），XB 220A型電子天平（上海普利賽斯集團），F(xiàn)S5型熒光分光光度計（英國愛丁堡儀器公司）。

1.2 CQDs的合成

將0.11 g間苯二酚和10 mL蒸餾水充分混合后，加入0.1 mL磷酸并放入反應釜中，隨后置于真空干燥箱加熱12 h，得到橙黃色的液體，即CQDs。

1.3 CQDs的熒光特性

制備的CQDs在紫外線光下呈藍綠色，取0.4 mL樣品加入2 mL蒸餾水稀釋，獲得實驗溶液A，在A樣品中逐步加入酸（磷酸）溶液，紫外線照射下的樣品顏色逐漸變綠，反之在A樣品中逐步加入堿（稀氫氧化鈉）溶液，紫外線照射下的樣品顏色逐漸變藍。多次制備結果相同，說明該量子點樣品具有穩(wěn)定的熒光特性，并且在不同酸堿度的影響下表現(xiàn)不同。

1.4 CQDs的熒光成像

將MCF7細胞和Hela細胞分別接種在培養(yǎng)皿中，經(jīng)37 ℃下培養(yǎng)12 h。隨后將培養(yǎng)后的兩種細胞洗滌3次，并懸浮于CQDs溶液（60 μg/mL）中，經(jīng)溫育4 h并用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后，用共聚焦顯微鏡觀察細胞488 nm波長激發(fā)下的熒光成像。

2 結果與討論

2.1 CQDs的形貌表征

CQDs的形貌表征如圖1所示。由圖1a可以看出，已成功制備出CQDs，納米點狀材料尺寸較小，且分布均勻，證明所制備的CQDs具有良好的分散性;由圖1b可以看出，通過分析TEM圖像中的100個粒子點，求得CQDs的平均橫向尺寸為3.4±0.2 nm。

由圖1c和圖1d可以看出，所獲得的CQDs是高度均勻的，其平均高度為3.19±0.85 nm，表明制備的CQDs具有少量的層狀和近球形結構。

2.2 CQDs的粒徑及光學特性表征

CQDs的粒徑及熒光特性分析如圖2所示。由圖2a可知，CQDs整齊的排列在平面上，表明CQDs的粒子間高度相差較小;由圖2b可知，通過熒光發(fā)射光譜研究了CQDs的光學性質，而且在不同激發(fā)波長下，通過收集220 nm和500 nm之間CQDs的熒光發(fā)射數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在220～400 nm之間，CQDs的熒光強度隨激發(fā)波長的增加而增加，此后繼續(xù)增加激發(fā)波長，熒光強度逐漸降低，證明CQDs的最大激發(fā)波長為400 nm;由圖2c可知，通過對CQDs懸浮液分別照射可見光（左）和365 nm紫外線（右），觀察CQDs懸浮液的顏色，發(fā)現(xiàn)在可見光下，樣本呈橘黃色，而經(jīng)紫外照射后有明顯的綠色光通路，證明合成的CQDs呈現(xiàn)綠色熒光。

2.3 CQDs的元素及其官能團分析

CQDs的元素及其官能團分析如圖3所示。由圖3a可以看出，在285，400和532 eV 3個主要峰值處，分別對應著C、N和O元素的特征峰，證明合成的材料里含有C、N和O 3種元素，考慮實驗中具有尚未完全反應的底物或者含有一定的中間產(chǎn)物，也可能是空氣中的氮元素夾雜在產(chǎn)物中的結果。

由圖3b可以看出，C 1s的XPS光譜顯示有CO、C—N和CC特征峰，證明合成的材料中C元素含有以上三種化學鍵;由圖3c可以看出，O 1s的光譜進一步驗證了CO（530.7 eV）和C—O（532.3 eV）的存在[1113];由圖3d可以看出，利用傅里葉紅外光譜（FTIR）對合成的CQDs進行表面官能團分析，發(fā)現(xiàn)在3 200～3 600 cm-1和1 654 cm-1區(qū)域的峰值，分別對應著—OH和—CO的典型振動帶[1421]。

2.4 CQDs在不同pH環(huán)境下的熒光強度分析

在不同激發(fā)波長下，CQDs的熒光強度分析如圖4所示。由圖4a可以看出，在400 nm激發(fā)下，檢測CQDs在不同pH環(huán)境中的熒光強度，發(fā)現(xiàn)在一定的pH值下，CQDs的熒光強度與pH值呈現(xiàn)出相應的線性關系。隨后通過縮小pH范圍，發(fā)現(xiàn)在pH=4.5到pH=9之間，CQDs的熒光強度隨pH增加而增大;由圖4b可以看出，通過對上述數(shù)據(jù)進行擬合，發(fā)現(xiàn)pH值在6～7.5的范圍內，CQDs的熒光強度與pH呈現(xiàn)出線性關系，計算出R2=0.99，擬合線性回歸方程為Y=346.478X-1 778.103。

正常人體的pH值是6.5～7.1，其中越靠近中間值（pH=6.8）越正常;越靠近兩邊，離不正常的情況越近。癌細胞的pH一般較低，屬于偏酸性。鑒于癌細胞偏酸的特性，且其pH值在線性范圍之內，設想在癌細胞培養(yǎng)中摻入所合成的CQDs，實現(xiàn)對癌細胞的檢測及熒光成像。

2.5 CQDs應用于癌細胞的熒光成像

本實驗選用MCF7細胞和Hela細胞這兩種具有代表性的癌細胞進行CQDs的熒光成像實驗。MCF7細胞和Hela細胞中CQDs的熒光成像如圖5所示。圖5a為MCF7細胞在60 μg mL-1的CQDs溶液中培育3 h后的激光共聚焦明場圖像，圖5d為Hela細胞在60 μg mL-1的CQDs溶液中培育3 h后的激光共聚焦明場圖像。由圖5a～圖5c可以看出，在60 μg mL-1，將MCF7細胞與CQDs溶液中培育3 h后，經(jīng)400 nm的波長激發(fā)下，細胞呈現(xiàn)出綠色熒光，說明CQDs己經(jīng)成功進入到細胞中;由圖5d～圖5f可以看出，經(jīng)過相同的處理，在Hela細胞中同樣可以觀察到綠色的熒光細胞，證明所制備的CQDs成功地應用于癌細胞檢測及熒光成像。

3 結束語

本文以間苯二酚和磷酸為原料，通過一步法合成了具有熒光特性的CQDs。利用TEM、AFM、XPS和FTIR對所合成的CQDs的形貌、價態(tài)及官能團進行表征，進一步證明所合成的CQDs大小均等、尺寸均一。通過在不同pH環(huán)境下，對CQDs的熒光強度進行檢測，證明在一定的pH范圍內，CQDs的熒光強度與pH呈現(xiàn)出線性關系。利用CQDs特有的熒光性質，成功將其應用于癌細胞的檢測及熒光成像。此外，利用該實驗中的碳量子點熒光強度與pH值的線性關系，進一步制得可量化的熒光強度檢測pH值的方法。該實驗也可作為其他實驗的預實驗，在初步分析細胞是否癌變等領域提供了一種新的思路。

參考文獻：

[1] Li H， He X， Kang Z， et al. Water-soluble fluorescent carbon quantum dots and photocatalyst design[J]. Angewandte Chemie International Edition， 2010， 49（26）： 44304434.

[2] Lim S Y， Shen W， Gao Z. Carbon quantum dots and their applications[J]. Chemical Society Reviews， 2015， 44（1）： 362381.

[3] Liang Q， Ma W， Shi Y， et al. Easy synthesis of highly fluorescent carbon quantum dots from gelatin and their luminescent properties and applications[J]. Carbon， 2013， 60： 421428.

[4] Sun Y P， Zhou B， Lin Y， et al. Quantum-sized carbon dots for bright and colorful photoluminescence[J]. Journal of the American Chemical Society， 2006， 128（24）： 77567757.

[5] Justin R， Tao K， Román S， et al. Photoluminescent and superparamagnetic reduced graphene oxide-iron oxide quantum dots for dual-modality imaging， drug delivery and photothermal therapy[J]. Carbon， 2016， 97： 5470.

[6] Qiang Q， Zhu A， Shao X， et al. Development of a carbon quantum dots-based fluorescent Cu2+ probe suitable for living cell imaging[J]. Chemical Communications， 2012， 48（44）： 54735475.

[7] Hou J， Yan J， Zhao Q， et al. A novel one-pot route for large-scale preparation of highly photoluminescent carbon quantum dots powders[J]. Nanoscale， 2013， 5（20）： 95589561.

[8] Wang T Y， Chen C Y， Wang C M， et al. Multicolor functional carbon dots via one-step refluxing synthesis[J]. Acs Sensors， 2017， 2（3）： 354363.

[9] Liu S， Tian J Q， Wang L， et al. Hydrothermal treatment of grass： a low-cost， green route to nitrogen-doped， carbon-rich， photoluminescent polymer nanodots as an effective fluorescent sensing platform for label-free detection of Cu（II） ions[J]. Advanced Materials， 2012， 24（15）： 20372041.

[10] Jiang K， Sun S， Zhang L， et al. Red， green， and blue luminescence by carbon dots： full-color emission tuning and multicolor cellular imaging[J]. Angewandte Chemie， 2015， 127（18）： 54505453.

[11] Ma Z， Ming H， Huang H， et al. One-step ultrasonic synthesis of fluorescent N-doped carbon dots from glucose and their visible-light sensitive photocatalytic ability[J]. New Journal of Chemistry， 2012， 36（4）： 861864.

[12] Xu M， He G， Li Z， et al. A green heterogeneous synthesis of N-doped carbon dots and their photoluminescence applications in solid and aqueous states[J]. Nanoscale， 2014， 6（17）： 1030710315.

[13] Edison T， Atchudan R， Shim J J， et al. Turn-off fluorescence sensor for the detection of ferric ion in water using green synthesized N-doped carbon dots and its bio-imaging[J]. J Photochem Photobiol B， 2016， 158： 235242.

[14] Li S J， Li C， Li Y， et al. Facile and sensitive near-infrared fluorescence probe for the detection of endogenous alkaline phosphatase activity in vivo[J]. Analytical Chemistry， 2017， 89（12）： 68546860.

[15] Kong W Q， Li H， Huang H， et al. Fluorescent N-doped carbon dots for both cellular imaging and highly-sensitive catechol detection[J]. Carbon An International Journal Sponsored by the American Carbon Society， 2015， 91： 6675.

[16] Song Z， Quan F， Xu Y， et al. Multifunctional N， S co-doped carbon quantum dots with pH-and thermo-dependent switchable fluorescent properties and highly selective detection of glutathione[J]. Carbon， 2016， 104： 169178.

[17] Xia C， Zhu S， Feng T， et al. Evolution and synthesis of carbon dots： from carbon dots to carbonized polymer dots[J]. Advanced Science， 2019， 6（23）： 19013161901339.

[18] Zhang J， Yu S H. Carbon dots： large-scale synthesis， sensing andbioimaging[J]. Materials Today， 2016， 19（7）： 382393.

[19] Hu C， Li M Y， Qiu J H， et al. Design and fabrication of carbon dots for energy conversion andstorage[J]. Chemical Society Reviews， 2019， 48（8）： 23152337.

[20] Li H， Su D， Gao H， et al. Design of red emissive carbon dots： robust performance for analytical applications in pesticide monitoring[J]. Analytical Chemistry， 2020， 92（4）： 31983205.

[21] Rosso C， Filippini G， Prato M. Carbon dots as nano-organocatalysts for synthetic applications[J]. ACS Catalysis， 2020， 10（15）： 80908105.