王浩 鄒茜

摘要 目的：觀察人參皂苷Rb1是否通過調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）表達(dá)抗晶狀體上皮細(xì)胞衰老。方法：構(gòu)建晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04衰老模型，加入人參皂苷Rb1培養(yǎng)后通過PCR檢測SIRT1的表達(dá)改變，通過β-半乳糖苷酶染色檢測衰老情況。敲降正常晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04中SIRT1的表達(dá)后檢測衰老情況，再次加入人參皂苷Rb1后通過PCR和免疫熒光觀察上述指標(biāo)有無改變。結(jié)果：60 μmol/L人參皂苷Rb1處理衰老SRA01/04細(xì)胞內(nèi)SIRT1表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;SIRT1沉默后，SRA01/04細(xì)胞衰老程度明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與SIRT1沉默組比較，SIRT1沉默同時(shí)加入人參皂苷Rb1后，SIRT1有所上升。結(jié)論：人參皂苷Rb1可以通過調(diào)節(jié)SIRT1表達(dá)抗晶狀體上皮細(xì)胞衰老。

關(guān)鍵詞 年齡相關(guān)性白內(nèi)障;晶狀體上皮細(xì)胞;人參皂苷Rb1;沉默信息調(diào)節(jié)因子1;細(xì)胞衰老;凋亡;炎證;氧化損傷

Abstract Objective：To observe whether ginsenoside Rb1 can inhibit senescence of lens epithelial cells by regulating expression of SIRT1.Methods：Senescence model of lens epithelial cell line SRA01/04 was established，and cultured with adding ginsenoside Rb1.The mRNA expression of SIRT1 was detected by PCR and the degree of senescence were detected by β-galactosidase staining positive rate.The expression of SIRT1 in the normal lens epithelial cell line SRA01/04 was knocked down to detect aging，and then ginsenoside Rb1 was added again to observe whether the above indicators have changed by PCR and immunofluorescence.Results：60 μmol/L ginsenoside Rb1 treatment of senescent SRA01/04 cells increased the expression of SIRT1 （P<0.05）; after silencing SIRT1，SRA01/04 cells senescence significantly increased （P<0.05）; compared with the silence SIRT1 group，after silencing SIRT1 simultaneously adding ginsenoside Rb1，SIRT1 increased.Conclusion：Ginsenoside Rb1 can resist the senescence of lens epithelial cells by regulating the expression of SIRT1.

Keywords Age-related Cataract; Lens Epithelial Cells; Ginsenoside Rb1;SIRT1; Cell senescence; Apoptosis; Inflammation; Oxidative damage

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.013

年齡相關(guān)性白內(nèi)障（Age-related Cataract，ARC）是我國乃至全球范圍內(nèi)首位致盲性眼病[1]。隨著社會的老齡化增加，ARC的患病率也隨之增高，將成為社會的一大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管手術(shù)仍然是唯一有效的白內(nèi)障治療方法，但仍存在術(shù)后近遠(yuǎn)期的并發(fā)癥[2]。因此研究ARC的病因和發(fā)病機(jī)制用于指導(dǎo)臨床藥物開發(fā)對其防治有著重要意義。ARC是復(fù)雜性多因素疾病，是環(huán)境和遺傳因素共同作用下的結(jié)果。晶狀體上皮細(xì)胞（Lens Epithelial Cells，LECs）是晶狀體的代謝活躍中心，是ARC病理生理過程的關(guān)鍵細(xì)胞。目前普遍認(rèn)為LECs的氧化損傷導(dǎo)致細(xì)胞衰老是ARC發(fā)生發(fā)展最重要的因素[3]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent Information Regulation 1，SIRT1）是一種參與調(diào)控細(xì)胞衰老的高度保守的生物酶，被稱為“抗衰老酶”。SIRT1通過結(jié)合P53蛋白并使去乙?；瘡亩?fù)性調(diào)節(jié)其活性減緩細(xì)胞衰老[4]。SIRT1還參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子FOXO1的活性等細(xì)胞衰老相關(guān)信號通路[5]。

人參皂苷Rb1是人參中含量最多的成分，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗炎、抗氧化、抗衰老等方面發(fā)揮著重要作用。已有研究報(bào)告顯示人參皂苷Rb1可通過SIRT1/核因子κB信號通路抑制高糖處理的H9C2細(xì)胞的凋亡與炎癥反應(yīng)[6]，可以通過調(diào)控SIRT1/eNOS/NO信號通路抵抗人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老[7]，還可以通過調(diào)控MAPK/PKA-LKB1細(xì)胞信號通路抑制紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖[8]。本研究擬建立晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04衰老模型，探討人參皂苷Rb1是否能夠延緩SRA01/04細(xì)胞衰老，并從調(diào)控SIRT1作用方面探討人參皂苷Rb1對晶狀體上皮抗衰老方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 細(xì)胞采用人類晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04，購自中國科學(xué)院。

1.1.2 藥物 人參皂苷Rb1購自普菲德（中國成都）。

1.1.3 試劑與儀器 人參皂苷Rb1（普菲德公司，成都，貨號：41753-43-9）;胎牛血清（GIBCO公司，澳洲，貨號：10099-141）;TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國，貨號：15596026）;轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司，美國，貨號：11668-027）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本，貨號：RR036A）;熒光定量試劑盒（Thermos fisher公司，美國，貨號：4376598）;兔抗SIRT1、GAPDH多克隆抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab189494，ab9485）;SIRT1小干擾RNA（siSIRT1，銳博生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將SRA01/04衰老模型分為對照組;20 μmol/L;40 μmol/L;60 μmol/L和80 μmol/L人參皂苷Rb1組。常規(guī)培養(yǎng)SRA01/04細(xì)胞傳至2～3代后，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種至24孔板中。加入50 μmol/L的過氧化氫（H2O2），繼續(xù)培養(yǎng)后收取細(xì)胞。進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（Senescenceβ-Galactosidase）染色，當(dāng)染色比較穩(wěn)定時(shí)，即為本實(shí)驗(yàn)中SRA01/04細(xì)胞的衰老模型。

1.2.2 給藥方法 將不同濃度的人參皂苷Rb1分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，同等條件下培養(yǎng)48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)及β-半乳糖苷酶染色陽性率選擇最宜濃度。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1）探討人參皂苷Rb1抗SRA01/04細(xì)胞衰老的最佳濃度：

將不同濃度的人參皂苷Rb1分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，同等條件下培養(yǎng)48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)及β-半乳糖苷酶染色陽性率選擇最宜濃度。

2）探討人參皂苷Rb1抗SRA01/04細(xì)胞衰老的機(jī)制：

在SRA01/04細(xì)胞生長至60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為對照組、siSIRT1組、人參皂苷Rb1組、siSIRT1+人參皂苷Rb1組。轉(zhuǎn)染后加入80 μmol/L人參皂苷Rb1繼續(xù)培養(yǎng)。各組在相同培養(yǎng)時(shí)間后，檢測SIRT1的表達(dá)。RNA干擾序列是由銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

3）qRT-PCR法檢測SIRT1表達(dá)量：

用TRIzol法提取各組細(xì)胞的RNA，測定RNA的純度和濃度;按照TaKaRa試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。選取SIRT1（assay ID：Hs01009006_m1），以人GAPDH（Hs02786624_g1）作為內(nèi)參，加入TaqMan Expression Master Mix（Thermos fisher），用ABI公司的step-one型實(shí)時(shí)PCR儀分析，通過檢測熒光信號，比較SIRT1和內(nèi)參基因的Ct值，最后用2-△△Ct分析相關(guān)基因的表達(dá)情況。該實(shí)驗(yàn)對每個(gè)樣本重復(fù)做3次。

4）免疫熒光：

在培養(yǎng)板中加入小圓片用于細(xì)胞爬片，經(jīng)過4%的多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100室溫通，BSA室溫封閉后，每張小圓片滴加50 μL一抗，放入濕盒4 ℃過夜。PBS清洗，擦干多余液體，滴加熒光二抗，放入濕盒室溫孵育1 h，PBS浸洗，滴加Hochest進(jìn)行染核，PBS清洗。封片后在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間以單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRA01/04細(xì)胞衰老模型的建立與驗(yàn)證

加入H2O2組衰老模型組的細(xì)胞形態(tài)由短胖變細(xì)長，并出現(xiàn)生長緩慢、貼壁細(xì)胞減少等衰老改變。見圖1。

2.2 人參皂苷Rb1抗衰老的最佳濃度

在SRA01/04細(xì)胞衰老模型中加入不同濃度（20、40、60和80 μmol/L）的人參皂苷Rb1進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后觀察β-半乳糖苷酶染色情況。結(jié)果顯示，與對照組（0 μmol/L）比較，加入了人參皂苷Rb1的SRA01/04細(xì)胞，β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中以60 μmol/L組效果最佳。見圖2。

2.3 人參皂苷Rb1通過SIRT1抗SRA01/04細(xì)胞衰老

分為正常SRA01/04細(xì)胞組，SRA01/04衰老模型組，加入不同濃度（20、40、60和80 μmol/L）人參皂苷Rb1組。提取各組總RNA并檢測SIRT1的表達(dá)。結(jié)果顯示除了正常SRA01/04細(xì)胞中SIRT1最高外，與不加入人參皂苷Rb1組比較，加入了人參皂苷Rb1的衰老模型SRA01/04細(xì)胞SIRT1的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），以60 μmol/L人參皂苷Rb1組最明顯。見圖3。

2.4 免疫熒光驗(yàn)證人參皂苷Rb1通過SIRT1抗SRA01/04細(xì)胞衰老

檢測SRA01/04衰老模型及同時(shí)加入60 μmol/L人參皂苷Rb1后SIRT1中的表達(dá)。與不加入人參皂苷Rb1組比較，加入人參皂苷Rb1組（60 μmol/L）SIRT1比SRA01/04衰老模型高。見圖4。

2.5 沉默SIRT1以及同時(shí)加入人參皂苷Rb1對SIRT1表達(dá)的影響

SIRT1沉默后SIRT1水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;加入60 μmol/L人參皂苷Rb1后，SIRT1升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;同時(shí)SIRT1沉默及加入60 μmol/L人參皂苷Rb1組的SIRT1水平僅表現(xiàn)為輕度降低，較SIRT1沉默組明顯提高。見圖5。

3 討論

ARC的病因和發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚。目前手術(shù)仍是主要治療手段，但手術(shù)遠(yuǎn)期效果不佳[9]。因此研究其病因和發(fā)病機(jī)制用于指導(dǎo)藥物開發(fā)對ARC的防治有著重要意義。在眾多ARC病因的假說中，LECs的DNA氧化損傷假說較為公認(rèn)[3，10-11]。紫外線和過氧化氫（H2O2）等外源性刺激可以引起DNA損傷，同時(shí)，可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，導(dǎo)致年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生[12-14]。目前關(guān)于衰老的學(xué)說有很多種，最常見的包括自由基、DNA損傷、端粒酶和炎癥反應(yīng)。SIRT1可通過參多種途徑參與抗細(xì)胞衰老，包括調(diào)節(jié)代謝和炎癥反應(yīng)等[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，60 μmol/L人參皂苷Rb1能明顯上調(diào)SIRT1表達(dá)，延緩晶狀體上皮細(xì)胞衰老。

在中國，人參歷來被視為百草之王，其應(yīng)用已有數(shù)千年。中醫(yī)認(rèn)為，人參具有大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津，安神等作用。有研究發(fā)現(xiàn)，人參藥理作用主要包括調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老、抵抗疲勞等，臨床應(yīng)用廣泛，同時(shí)也可用于強(qiáng)身固本[18]。而人參皂苷是從人參中提煉而來，被視為人參中最重要的活性成分，因其多方面的藥理作用，成為了熱門的研究對象。研究已發(fā)現(xiàn)人參皂苷在多種細(xì)胞中均具有延緩衰老作用[19-22]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，SRA01/04細(xì)胞衰老模型中，SIRT1表達(dá)減少，人參皂苷Rb1干預(yù)后，SIRT1表達(dá)增加，而β-半乳糖苷酶染色陽性率降低;SIRT1沉默后發(fā)現(xiàn)，SIRT1表達(dá)明顯減少;然而，在SIRT1沉默同時(shí)加用人參皂苷Rb1，SIRT1未發(fā)生明顯減少。從正反兩面說明，人參皂苷Rb1可以上調(diào)SIRT1表達(dá)，延緩SRA01/04細(xì)胞衰老。

本研究探討了人參皂苷Rb1延緩SRA01/04細(xì)胞衰老的可能機(jī)制，結(jié)果表明人參皂苷Rb1可通過調(diào)控SIRT1延緩SRA01/04細(xì)胞衰老。但研究仍然停留在細(xì)胞層面，需要進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證，最終用于臨床防治ARC。

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（2019-05-19收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）