袁玉虹，孫 艷，鄭郁善*

(1.福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 南平 353000；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福建 福州 350002)

雷公藤(Tripterygium wilfordii)又名斷腸草，為衛(wèi)矛科雷公藤屬攀緣藤本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛、殺蟲(chóng)解毒之功效[1]。雷公藤制劑在臨床上常用于治療自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎炎、接觸性皮炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[2]。雷公藤分布區(qū)域較為廣泛，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域和西南地區(qū)，如浙江、安徽、湖南、湖北、福建、廣東、廣西、云南等省區(qū)。近年來(lái)，雷公藤種植已成為福建山區(qū)主要脫貧致富途徑之一。

雷公藤的主要活性物質(zhì)為雷公藤甲素(Triptolide，C20H24O6)，又名雷公藤內(nèi)酯醇。雷公藤甲素藥用價(jià)值較高，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗生育等作用[3]。但其毒性大，臨床應(yīng)用中治療量和中毒量非常接近，安全范圍小，劑量稍高其毒副作用則超過(guò)活性作用，因此雷公藤甲素含量是其重要的質(zhì)量指標(biāo)[4]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)雷公藤的研究多集中在育苗、栽培、良種選擇、組織培養(yǎng)等方面[5—10]，其臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用、化學(xué)成分及測(cè)定[11—18]等方面也有較深入研究，而雷公藤甲素含量在不同采收期及各入藥部位的動(dòng)態(tài)變化尚未報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以種植5年的雷公藤為試材，對(duì)其不同采收期內(nèi)各入藥部位雷公藤甲素含量的動(dòng)態(tài)規(guī)律進(jìn)行分析，為雷公藤人工采收、質(zhì)量評(píng)價(jià)和資源開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

LC-20AD液質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津儀器公司，SPD-20A紫外可見(jiàn)雙波長(zhǎng)檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20A柱溫箱，CBM-20A系統(tǒng)控制器，LC solution工作站)，色譜柱(SinoChrom ODS-BP 5 μm，200 mm×4.6 mm)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-201，上海申勝生物技術(shù)有限公司)，數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限公司)，電子分析天平(CP214，奧豪斯儀器有限公司)。

1.1.2 試劑

雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品鑒定研究所，批號(hào)111567-201602)，色譜甲醇(德國(guó) MERCK)，色譜乙腈(德國(guó)MERCK)，中性氧化鋁(200～300目)，超純水，甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、無(wú)水乙醚均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 藥材

雷公藤為5年生成熟植株，樣品均采自福建省泰寧縣雷公藤規(guī)范化種植基地福建杉陽(yáng)雷公藤產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，共收集6批不同采收期的雷公藤根、莖與葉部位(表1)。

表1 雷公藤樣品采集時(shí)間Table 1 Different collection time of Tripterygium wilfordii samples

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液配制

稱取雷公藤甲素對(duì)照品適量，加乙腈溶解并定容至10 mL容量瓶中，溶液用0.45 μm微孔膜過(guò)濾，作為對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液配制

精密稱量雷公藤樣品粉末(過(guò)60目篩) 2 g于錐形瓶中，用80%甲醇溶液按料液比1:35浸提24 h，超聲處理35 min。用25 mL氯仿萃取3次，將所得膏狀物置于氧化鋁層析柱洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)洗脫液至干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中。加甲醇至刻度線，搖勻，過(guò)濾，轉(zhuǎn)入樣品瓶待測(cè)，即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為SinoChrom ODS-BP；流動(dòng)相為甲醇-水(45:55)；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm；柱溫40 ℃。取供試品溶液20 μL進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別從濃度為500 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液，依次倍比稀釋濃度為 250 μg·mL-1、125 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、31.25 μg·mL-1、15.625 μg·mL-1，在“1.2.3”色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，以雷公藤甲素對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 精密度試驗(yàn)

取同一濃度的雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各次的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一雷公藤樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h依次進(jìn)樣記錄峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱量 5份雷公藤樣品粉末 2.0 g，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，在“1.2.3”色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱量6份雷公藤樣品粉末，分別加入適量的雷公藤甲素對(duì)照品，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，在“1.2.3”色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得雷公藤甲素含量，計(jì)算回收率和RSD值。

1.2.9 樣品含量測(cè)定

取6批次采收期雷公藤樣品，精密稱量各批次雷公藤樣品根、莖、葉粉末2.000 g，平行稱樣3次。按“1.2.2”方法制備供試品溶液，并在“1.2.3”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算雷公藤甲素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件及適應(yīng)性試驗(yàn)

由圖1、圖2可知，雷公藤樣品中雷公藤甲素與其他成分分離效果良好。在“1.2.3”色譜條件下，雷公藤甲素的保留時(shí)間為10.52 min，已達(dá)到基線分離，分離度大于 1.5，理論板數(shù)大于 5000。結(jié)果表明，該方法在測(cè)定雷公藤甲素含量時(shí)具有良好的系統(tǒng)適應(yīng)性。

圖1 雷公藤甲素對(duì)照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of triptolide reference substance

圖2 雷公藤樣品中甲素色譜圖Fig.2 Chromatogram of triptolide in the sample of Tripterygium wilfordii

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在“1.2.3”色譜條件下進(jìn)行雷公藤甲素對(duì)照品定量測(cè)定，記錄雷公藤甲素的色譜峰保留時(shí)間及峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即 Y=0.0115X+1.3594(R2=0.9997)。結(jié)果表明雷公藤甲素的濃度在 7.75～250 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度考察

按照“1.2.5”方法，取同一濃度雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，記錄每次進(jìn)樣峰面積，計(jì)算峰面積平均值，得出RSD值為1.13%，表明儀器精密度良好，符合測(cè)定要求。

2.4 穩(wěn)定性考察

按照“1.2.6”方法，取同一雷公藤樣品溶液，在12 h內(nèi)每間隔2 h測(cè)定一次，記錄峰面積，其RSD值為1.07%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性考察

按照“1.2.7”方法，平行制備5份供試品溶液，測(cè)定并記錄峰面積，計(jì)算RSD值為0.98%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率考察

按照“1.2.8”方法，制備6份供試品溶液，測(cè)定并記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率和RSD值。結(jié)果顯示，雷公藤加樣回收率為 99.21%，RSD值為1.578%(表1)，表明該方法回收率較好。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test results of recovery rates

2.7 雷公藤甲素含量的動(dòng)態(tài)變化

由表3可以看出，采收時(shí)間對(duì)雷公藤根和葉的甲素含量有顯著影響，對(duì)雷公藤莖的甲素含量的影響不顯著。雷公藤整個(gè)生長(zhǎng)周期中，7～8月雷公藤葉片中甲素含量最高，其次是根部，含量最少的為莖部；11～12月根部甲素含量最高，其次是葉片，甲素含量最少的仍為莖部。就雷公藤全年采收量各部位雷公藤甲素含量的總和而言，雷公藤葉片甲素的含量略高于根部，具有資源開(kāi)發(fā)利用潛力。

表3 不同采收期雷公藤不同入藥部位的甲素含量(μg·g-1)Table 3 Contens of different harvesting periods of triptolide in different parts of Tripterygium wilfordii (μg·g-1)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤莖葉中含有大量的雷公藤甲素，因此，從資源利用角度講，可以將莖葉作為提取雷公藤甲素的生產(chǎn)原料[19]。孫乙銘等[16]、倪樂(lè)[20]研究發(fā)現(xiàn)，在不同套種模式下，雷公藤各部位甲素含量由高到低依次為根、葉、莖。但本研究顯示，不同采集部位和不同采收期下雷公藤甲素含量存在一定差異，在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，雷公藤甲素不同部位含量高低依次為葉、根、莖，可能是葉作為植物生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)器官，其代謝能力比根部旺盛，因此雷公藤葉片甲素含量較高。

本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤葉片甲素含量最高為7～8月，達(dá) 24.08 μg·g-1，11～12 月最低，為 15.44 μg·g-1，翌年又開(kāi)始逐漸上升。一般7～8月雷公藤葉片光合作用強(qiáng)，代謝旺盛，可能產(chǎn)生并積累了大量甲素；11月至翌年1月雷公藤葉片開(kāi)始枯萎，代謝減弱，溫度降低，導(dǎo)致葉片甲素含量降低，翌年3月雷公藤開(kāi)始長(zhǎng)新葉，代謝增強(qiáng)，葉片甲素含量又逐漸上升。雷公藤根部甲素含量在 11～12月最高，達(dá)21.71 μg·g-1，這一時(shí)期雷公藤地上部分停止生長(zhǎng)，繁殖器官營(yíng)養(yǎng)消耗大，導(dǎo)致莖、葉的活性成分轉(zhuǎn)移至根部，使根中甲素含量增加。這與斯金平等[21]報(bào)道的雷公藤體內(nèi)雷公藤甲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在冬季至初春季最高基本一致。但在整個(gè)采收期內(nèi)雷公藤莖中甲素變化不大。

本研究探討了雷公藤甲素在不同采收期植物體內(nèi)積累的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，建議生產(chǎn)中每年在7～8月采收雷公藤地上部分(莖葉)，11～12月采收雷公藤地下部分(根)，用于雷公藤甲素提取。