王荔，張騰飛，楊蘇才?，劉志號(hào)，茍雅玲，趙倩云，孫仲平，喬鵬煒

1.工業(yè)場(chǎng)地污染與修復(fù)北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,輕工業(yè)環(huán)境保護(hù)研究所

2.煜環(huán)環(huán)境科技有限公司

多環(huán)芳烴(PAHs)具有致癌、致畸、致突變和生物積累、放大等特征,是焦化廠、加油站、儲(chǔ)油庫(kù)等場(chǎng)地中常見(jiàn)的一類(lèi)持久性有機(jī)污染物[1-2],已被美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局(US EPA)列入優(yōu)先控制污染物名錄[3]。土壤環(huán)境中PAHs污染來(lái)源較廣,焦化廠中含PAHs的石油類(lèi)化合物的遺撒或滲泄漏是重要來(lái)源之一[4]。目前已開(kāi)發(fā)出多種有機(jī)污染土壤的修復(fù)技術(shù),微生物修復(fù)技術(shù)因其安全、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)勢(shì),被認(rèn)為是很有潛力的原位修復(fù)技術(shù)[5-6]。

受PAHs污染的土壤,其微生物群落組成往往會(huì)發(fā)生變化[7]:一方面,微生物對(duì)有機(jī)污染物適應(yīng)性的遺傳機(jī)制表明,污染環(huán)境中的微生物可以進(jìn)行選擇性富集,逐漸形成能夠降解有機(jī)污染物的優(yōu)勢(shì)菌群；另一方面,優(yōu)勢(shì)菌群利用包氣帶土壤中的PAHs作為微生物可利用碳源或形成共代謝[8]。因此,研究焦化廠土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)特征及其影響因素,對(duì)PAHs污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)的研發(fā)具有重要指導(dǎo)意義[9-11]。

目前,有關(guān)石油類(lèi)污染土壤的微生物學(xué)研究大多集中于污染土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)解析或PAHs降解菌篩選方面[12-13],對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響因素的探究較少,但土壤的理化性質(zhì)及污染物濃度是影響土壤微生物功能多樣性的關(guān)鍵因素[14]。因此,筆者以華北某焦化廠為研究對(duì)象,隨機(jī)選取30個(gè)土壤樣品(0~10 m深度)進(jìn)行PCR熒光定量和高通量測(cè)序,使用統(tǒng)計(jì)方法分析土壤中細(xì)菌豐度、群落結(jié)構(gòu)與土壤理化指標(biāo)之間的關(guān)系,旨在為焦化廠土壤修復(fù)技術(shù)研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集與保存

所選華北某焦化廠建于20世紀(jì)70年代,占地面積約20 hm2,2018年11月停產(chǎn)搬遷。選擇5個(gè)采樣點(diǎn)(記為A、B、C、D、E)進(jìn)行土壤樣品采集,每個(gè)點(diǎn)采樣深度分別為 －0.5~0、－2.5~－2.0、－4.5~－4.0、－6.5~－6.0、－8.5~－8.0、－10.5~－10.0 m,用編號(hào)1~6表示。采集的土壤樣品用無(wú)菌袋密封好,放在含有冰袋的樣品保存箱中,迅速送回實(shí)驗(yàn)室,過(guò)2 mm篩后儲(chǔ)存于－20℃環(huán)境中以備后續(xù)分析測(cè)試。

1.2 土壤理化性質(zhì)及PAH濃度測(cè)定

土壤PAHs濃度依據(jù)文獻(xiàn)[15]測(cè)定:取2 g干燥土壤樣品放入40 mL聚四氟乙烯離心管中,分別加入正己烷和二氯甲烷各15 mL,超聲30 min,高速離心10 min,此過(guò)程重復(fù)3次。離心所得液體經(jīng)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和氮吹儀濃縮,用二氯甲烷定容至1 mL,然后取200μg液體加入內(nèi)標(biāo)物待測(cè)。檢測(cè)儀器為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC∕MS),色譜柱為HP-5MS。測(cè)定條件:進(jìn)樣口溫度為290℃,設(shè)置分流進(jìn)樣,分流比為2∶1,進(jìn)樣量為1.0 μL；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0℃,保持2 min,以10℃∕min升至240℃,保持3 min,再以5℃∕min升至320℃,保持10 min；質(zhì)譜為EI電子源,選擇Scan模式。土壤pH采用2.5∶1.0的水土比,用pH儀(PHS-3C型)測(cè)定,含水率采用烘干法測(cè)定[16]；土壤總有機(jī)碳(TOC)濃度采用TOC分析儀(Elementar,德國(guó))測(cè)定,全氮、速效鉀、有效磷濃度分別采用凱氏定氮法、火焰光度法及Olsen法測(cè)定[17]。

1.3 土壤微生物DNA提取及微生物指標(biāo)分析

根據(jù)土壤DNA提取試劑盒(DNeasy Power Soil Kit)的使用說(shuō)明,從0.5 g土壤樣品中提取微生物總DNA。微生物高通量測(cè)序分析委托北京賽奧吉諾生物科技有限公司進(jìn)行。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)細(xì)菌的基因拷貝數(shù)(N),PCR擴(kuò)增條件參照Gou等[17]方法進(jìn)行,細(xì)菌數(shù)量以lgN計(jì)。16S rDNA基因的擴(kuò)增引物為1369F(5′-CGGTGAATACGTTCYCGG)∕1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT),探針為T(mén)M1389F(CTTGTACACACCGCCCGTC)。借助Illumina MiSeq v3測(cè)序平臺(tái)研究土壤微生物群落組成,并在門(mén)水平上分析與比較污染土壤中細(xì)菌群落組成的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,采用CANOCO 4.5軟件中的冗余分析(redundancy analysis,RDA)確定環(huán)境因子對(duì)土壤微生物群落組成的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤樣品理化性質(zhì)

30個(gè)土壤樣品的理化性質(zhì)如表1所示。由表1可知,土壤pH、含水率與有機(jī)質(zhì)、有效磷、全氮和速效鉀濃度在各土壤樣品間存在顯著差異。其中,土壤pH為7.22~8.65；TOC濃度為0.61%~4.71%,平均值為1.05%；含水率為0.90%~22.29%,平均值為14.00%；有效磷濃度為0.9~13.4 mg∕kg,平均值為6.9 mg∕kg；全氮濃度為0.12~0.93 g∕kg,平均值為0.47 g∕kg；速效鉀濃度為4.18~266.00 mg∕kg,平均值為98.95 mg∕kg。

表1 土壤樣品理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of soil samples

土壤樣品中PAHs濃度如表2所示。由表2可知,A、E采樣點(diǎn)為輕污染區(qū),PAHs濃度為2.05~38.12 mg∕kg；B、D采樣點(diǎn)為中污染區(qū),PAHs濃度為2.36~173.64 mg∕kg；C采樣點(diǎn)為重污染區(qū),PAHs濃度為2.81~1 256.21 mg∕kg。 整體而言,土壤中PAHs濃度隨采樣深度增加而降低。土壤中2~3環(huán)PAHs在不同采樣點(diǎn)占比為9.84%~64.80%,4環(huán)PAHs占比為12.06%~56.34%,5~6環(huán)PAHs占比為21.34%~73.91%。相對(duì)于2~3環(huán)PAHs,土壤中4環(huán)以上PAHs污染較重?？赡苁且?yàn)榈头肿恿康腜AHs易揮發(fā)降解,不易積累；高分子量PAHs蒸氣壓高且生物有效性低,在土壤中積累較多[18]。

表2 土壤樣品中PAHs濃度Table 2 PAHs concentrations in soil samples mg∕kg

2.2 土壤中細(xì)菌豐度

土壤環(huán)境中微生物豐度可反映土著細(xì)菌數(shù)量的變化規(guī)律[19]。5個(gè)采樣點(diǎn)各分層土壤樣品的細(xì)菌豐度如圖1所示。由圖1可知,不同采樣點(diǎn)細(xì)菌豐度差異較大,輕污染區(qū)A、E采樣點(diǎn)土壤細(xì)菌數(shù)量的lgN分別為5.33~7.31和6.60~7.92；中污染區(qū)B和D采樣點(diǎn)的lgN分別為7.10~7.75和5.48~8.89；高污染區(qū)C采樣點(diǎn)的lgN為6.63~8.25。

圖1 土壤樣品中細(xì)菌豐度Fig.1 Microbial abundance in soil samples

研究[20]表明,土壤中細(xì)菌豐度與土壤環(huán)境因子相關(guān)性越大,表明微生物對(duì)環(huán)境變化越敏感。土壤中細(xì)菌豐度與土壤各環(huán)境因子相關(guān)系數(shù)如表3所示。由表3可知,土壤中細(xì)菌豐度與采樣深度呈負(fù)相關(guān)(R2＝－0.739,P<0.01)。Ekelund等[21]的研究表明,表層土壤細(xì)菌豐度遠(yuǎn)高于深層土壤,且隨著采樣深度增加,細(xì)菌豐度隨之降低；Taylor等[22]對(duì)美國(guó)艾奧瓦州和密歇根州的土壤進(jìn)行表層—中層—深層剖面微生物量分析,發(fā)現(xiàn)微生物量隨土壤深度增加而顯著減少,上述研究與本研究結(jié)論一致。本研究中TOC、全氮濃度與細(xì)菌豐度呈明顯正相關(guān)(R2分別為0.403和0.405,P<0.05),不少學(xué)者在其他土壤剖面中觀察到相似的細(xì)菌豐度變化趨勢(shì),認(rèn)為較高的TOC和氮濃度有助于增加土壤微生物量[23-25]。

土壤細(xì)菌豐度與PAHs、不同環(huán)數(shù)PAHs濃度的相關(guān)性分析結(jié)果表明,細(xì)菌豐度與PAHs濃度相關(guān)性不顯著。排除PAHs濃度異常偏高的C2和C3樣品(PAHs濃度分別為1 256.21和925.47 mg∕kg)后,土壤中細(xì)菌豐度與PAHs濃度(R2為0.463,P<0.05)、不同環(huán)數(shù)PAHs濃度均呈正相關(guān)(表3)。這可能是因?yàn)镻AHs雖為降解菌提供可利用生長(zhǎng)基質(zhì),但微生物對(duì)有機(jī)污染物的耐受性存在閾值,超過(guò)閾值的高濃度PAHs有明顯生物毒性[26-28]。土壤中微生物數(shù)量與烴類(lèi)化合物污染程度存在密切關(guān)系,一定濃度的PAHs污染可以刺激優(yōu)勢(shì)菌群的生長(zhǎng),但當(dāng)PAHs污染程度較重時(shí),則對(duì)微生物產(chǎn)生抑制作用[29]。

表3 細(xì)菌豐度與土壤各環(huán)境因子相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients between bacterial abundance and soil environmental factors

2.3 土壤微生物群落多樣性

不同采樣點(diǎn)土壤中細(xì)菌類(lèi)群門(mén)水平的相對(duì)豐度如圖2所示。由圖2可知,各采樣點(diǎn)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和分布有顯著差異。通過(guò)門(mén)水平下細(xì)菌群落組成的比較,能夠初步明確土壤樣品的優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)群[30]。變形菌門(mén)(Proteobacteria)在土壤樣品中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位,其次是綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteria),這5個(gè)門(mén)細(xì)菌數(shù)量占門(mén)水平分類(lèi)微生物數(shù)量的64%~97%。Sutton等[7]發(fā)現(xiàn)Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi是烴類(lèi)污染土壤的主要細(xì)菌類(lèi)群。報(bào)道稱(chēng)在有氧或缺氧條件下,參與PAHs代謝和遺傳調(diào)控的降解菌大多屬于這5個(gè)門(mén)[14,31-32]。值得一提的是,該焦化廠土壤中Proteobacteria相對(duì)豐度占比最高達(dá)90%,這可能是因?yàn)橥寥辣籔AHs污染后,微生物之間發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移或在微生物染色體內(nèi)進(jìn)行基因重排、突變、復(fù)制,由此馴化得到能夠降解PAHs的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[8]。假單胞菌(Pseudomonas)和鞘氨醇單胞菌(Sphingomonads)已被證實(shí)是芳香烴的優(yōu)勢(shì)降解細(xì)菌,可利用脂肪烴類(lèi)或稠環(huán)芳烴類(lèi)作為唯一碳源和能量來(lái)源去除PAHs[33]。Bell等[34]研究表明,Proteobacteria是石油污染土壤的主導(dǎo)微生物,直接參與烴類(lèi)物質(zhì)降解。Gou等[35]研究表明,受PAHs污染嚴(yán)重的土壤中,降解PAHs的主要細(xì)菌群體為Proteobacteria。此外,Proteobacteria多為化能異養(yǎng)型,具有較高氮素轉(zhuǎn)化和利用能力,通過(guò)添加硝酸鹽電子受體可刺激該類(lèi)微生物的生長(zhǎng)[36],為有機(jī)污染場(chǎng)地微生物修復(fù)提供必備條件。

圖2 土壤樣品中不同細(xì)菌類(lèi)群門(mén)水平的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance at phylum level of different bacterial groups in soil samples

2.4 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群與環(huán)境因子冗余分析

基于土壤細(xì)菌類(lèi)群(門(mén))OTU聚類(lèi)結(jié)果與環(huán)境變量進(jìn)行冗余分析[37],結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,該焦化廠土壤環(huán)境因子共解釋細(xì)菌群落變異的33.59%,其中第1主軸(RDA1)和第2主軸(RDA2)分別解釋18.31%和15.28%。環(huán)境因子與樣本相關(guān)程度大小依次為pH>K(速效鉀)>HIGH(4~6環(huán)PAHs)>PAHs>N(全氮)>LOW(2~3環(huán)PAHs)>SWC(含水率)>DEPTH(采樣深度)>TOC>P(有效磷)。可見(jiàn),pH與速效鉀、PAHs和全氮濃度是影響采樣區(qū)土壤細(xì)菌群落組成的主要驅(qū)動(dòng)因子。Proteobacteria、Bacteroidetes豐度與PAHs、2~3環(huán)PAHs、4~6環(huán)PAHs、全氮、速效鉀、有效磷、TOC濃度呈正相關(guān)；Chloroflexi、Acidobacteria豐度與pH、含水率呈正相關(guān)；Firmicutes和Actinobacteria豐度與采樣深度呈正相關(guān)。

圖3 環(huán)境因子與細(xì)菌群落組成關(guān)系的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of relationship between environmental factors and bacterial community composition

國(guó)內(nèi)外有不少學(xué)者已關(guān)注到土壤理化性質(zhì)和污染物濃度對(duì)不同細(xì)菌類(lèi)群的形成有至關(guān)重要的作用[38-40]。土壤含水率、pH、有效磷、全氮、速效鉀是土壤微生境的基本組成,對(duì)細(xì)菌生存有顯著影響[41]。其中,pH是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要驅(qū)動(dòng)因素[42]。本研究冗余分析表明,微生物群落結(jié)構(gòu)受土壤pH影響明顯。此外,PAHs可為微生物提供可利用碳源和生長(zhǎng)基質(zhì),也是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素[43-44]。Proteobacteria、Bacteroidetes豐度與PAHs、2~3環(huán)PAHs、4~6環(huán)PAHs濃度呈正相關(guān),表明這2個(gè)門(mén)細(xì)菌受PAHs濃度影響較大。Proteobacteria是PAHs的優(yōu)勢(shì)降解菌[45],Zhang等[46]研究發(fā)現(xiàn),有氧條件下,α-Proteobacteria和δ-Proteobacteria能有效降解菲；在缺氧條件下,降解菲的優(yōu)勢(shì)菌主要為γ-Proteobacteria。β-Proteobacteria能在PAHs污染老化土壤中富集,并在有氧和缺氧環(huán)境下均顯示較強(qiáng)活性[43]。Proteobacteria作為本研究污染場(chǎng)地土壤的主導(dǎo)微生物,其相對(duì)豐度占全部細(xì)菌比例最高(達(dá)90%),可見(jiàn),Proteobacteria可能在該焦化廠污染土壤PAHs降解代謝中起到不可忽視的作用。

3 結(jié)論

(1)焦化廠土壤樣品中細(xì)菌數(shù)量的lgN為5.33~8.89,其中,表層土壤細(xì)菌豐度遠(yuǎn)高于深層土壤；土壤中細(xì)菌豐度與采樣深度呈明顯負(fù)相關(guān),與土壤PAHs、TOC、全氮濃度呈明顯正相關(guān)。

(2)焦化廠土壤樣品中微生物的主要細(xì)菌類(lèi)群(門(mén))為 Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Firmicutes和Acidobacteria,其占門(mén)水平分類(lèi)細(xì)菌數(shù)量的64%~97%,其中PAHs優(yōu)勢(shì)潛在降解菌Proteobacteria相對(duì)豐度占比最高達(dá)90%。

(3)焦化廠土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征是PAHs污染和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果,土壤pH與速效鉀、PAHs、全氮濃度是該焦化廠土壤細(xì)菌群落組成的主要驅(qū)動(dòng)因子；PAHs優(yōu)勢(shì)潛在降解菌Proteobacteria豐度受PAHs濃度影響較大,且呈正相關(guān)。