雷 佳 ，馬衛(wèi)華 ，李 捷 ，武文卿 ，宋懷磊 ，宋卓琴 ，申晉山 ，李立新 ，王 怡

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

大豆（Glycine mas（L.）Merr）屬于豆科蝶形花亞科大豆屬1 年生草本植物，在我國(guó)栽培歷史悠久。大豆不僅是重要的糧食作物，其種子也含有豐富的植物蛋白質(zhì)，可作為含有蛋白質(zhì)原料的動(dòng)物飼料。大豆在自然條件下異交率較低，由于是自花授粉作物，普通的大豆品種不需要昆蟲授粉就能夠結(jié)實(shí)。在生產(chǎn)大豆雜交種時(shí)，需要通過人工授粉或昆蟲傳粉來進(jìn)行不育系繁育和雜交種制種。有研究表明，大豆雜交種制種產(chǎn)量低、成本高是制約雜交大豆生產(chǎn)的瓶頸，開花授粉環(huán)節(jié)是關(guān)鍵[1-2]。因此，目前大豆雜種優(yōu)勢(shì)利用研究和雜交大豆生產(chǎn)研究的熱點(diǎn)是利用昆蟲傳粉。大豆有完整的蜜腺，開花時(shí)泌蜜具有典型的蟲媒花特征?；凼侵参锩巯俜置诔鰜淼囊环N甜液，是植物提供給訪花者最重要的報(bào)酬之一，也是影響訪花者訪花行為的重要性狀[2-3]。SEVERSON 等[4]對(duì)不同大豆品種花蜜特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，白花品種和紫花品種在花蜜性狀上無明顯差異；其中，時(shí)間是影響大豆花蜜性狀的主要因素。日溫差對(duì)花蜜性狀的影響最小。在單個(gè)采樣周期內(nèi)進(jìn)行比較的結(jié)果表明，不同品種花蜜特性存在的差異可能鼓勵(lì)蜜蜂優(yōu)先進(jìn)行采蜜。大豆泌蜜與氣候、土壤條件、地域性及品種有著密切關(guān)系。韓月鑫等[5]對(duì)油菜花蜜的單花泌蜜量、單花蜜腺面積以及其花蜜化學(xué)成分進(jìn)行研究，通過選擇吸引昆蟲訪花的品種來提高油菜產(chǎn)量。研究表明，植物通過分泌花蜜目的是吸引傳粉者和阻擋微生物侵染，最終提高自身繁殖適應(yīng)能力[2]。宋志峰等[6]研究發(fā)現(xiàn)，不同品種大豆花中揮發(fā)性組分含量存在一定的差異。

本研究采用頂空固相微萃取和氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[7-8]以及毛細(xì)管法[9]，對(duì)不同大豆花揮發(fā)性物質(zhì)和單花泌量進(jìn)行測(cè)定分析，以期為大豆花朵性狀與昆蟲傳粉關(guān)系的深入研究以及優(yōu)先考慮吸引昆蟲訪花授粉的品種選育提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為4 個(gè)大豆品種Z-119-99、JD-19、Z-17 和ZJ-7，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽試驗(yàn)基地，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所）雜交大豆育種課題組提供，其中，JD-19 為常規(guī)種，ZJ-7 為雜交種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花蜜收集 試驗(yàn)使用0.3 mm×100 mm 的毛細(xì)管[9]在 9：00、10：00、11：00、12：00、13：00、14：00、15：00、16：00 進(jìn)行花蜜收集，每個(gè)品種分別取單朵花的花蜜，重復(fù)15 次。泌蜜量用泌蜜體積表示。

1.2.2 大豆花頂空固相微萃取和氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析 氣相色譜條件：載氣為氦氣99.99%，流量為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度恒溫250 ℃，分流比50∶1。初始溫度 50 ℃，恒溫 25 min，以5 ℃/min 升溫至 170 ℃，恒溫 5 min，再以 10 ℃/min升溫至230 ℃，恒溫10 min。EI 源電子能量為70 eV，傳輸線溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃，掃描質(zhì)量范圍為40～600 amu。

稱取盛花期大豆花樣品2.0 g（每個(gè)品種3 個(gè)重復(fù)），放到20 mL 頂空樣品瓶中，70 ℃條件下恒溫預(yù)熱30 min，將萃取頭在250 ℃條件下活化35 min后插入頂空瓶中進(jìn)行萃取30 min，之后將萃取頭拔出（GC-MS 進(jìn)樣口 250 ℃）解吸 3 min。

采用頂空固相微萃取和氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）測(cè)定JD-19 和ZJ-7 大豆花揮發(fā)性成分[10-12]，得到GC/MS 總離子流圖，利用NIST/WIELY標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索大豆花各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析；每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，最后采用面積歸一化法，計(jì)算不同品種大豆花揮發(fā)性組分的相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS21.0軟件Means 和ANOVA 中的Duncan 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和檢驗(yàn)大豆不同品種間差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大豆品種在一天中不同時(shí)間單花泌蜜量的變化分析

從圖 1 可以看出，在一天中 9：00、10：00、11：00、12：00 和 14：00，大豆品種 JD-19 的單花泌蜜量均最高，其中，Z-119-99、JD-19 與 Z-17、ZJ-7 之間泌蜜量差異顯著（P＜0.05）。在 15：00 和 16：00 時(shí)，大豆品種Z-119-99 顯著高于其他3 個(gè)品種，其他3 個(gè)品種之間差異不顯著（P＞0.05）。在9：00 時(shí)，大豆品種JD-19 單花泌蜜量為 0.313 6 μL，其次是Z-119-99，其單花泌蜜量為 0.277 9 μL，二者之間泌蜜量差異不顯著（P＞0.05）；品種JD-19 泌蜜量與 Z-17、ZJ-7 之間差異顯著（P＜0.05）。

品 種 Z-17 和 ZJ-7 在 9：00、10：00、11：00、12：00、13：00、14：00、15：00、16：00 這 8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間差異均不顯著（P＞0.05）；在13：00，品種Z-119-99 和 JD-19 的泌蜜量與 Z-17 和 ZJ-7，且差異顯著（P＜0.05）；在 14：00，品種 JD-19 的泌蜜量顯著高于 Z-17 和 ZJ-7 這 2 個(gè)品種（P＜0.05），但隨著時(shí)間增加，在 15：00，JD-19、Z-17 和 ZJ-7 之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同大豆品種在不同時(shí)間單花泌蜜量的動(dòng)態(tài)變化

從圖 2 可以看出，在 9：00，品種 JD-19 單花泌蜜量高于其他3 個(gè)品種，隨著時(shí)間的推移，4 個(gè)品種泌蜜量均呈上升趨勢(shì)，JD-19 在11：00 泌蜜量達(dá)到最高值，泌蜜量為0.7 μL，之后呈逐漸下降趨勢(shì)，16：00 下降到最低值，泌蜜量?jī)H為0.13 μL。品種Z-119-99 在13：00 泌蜜量達(dá)到最高值。品種Z-17和ZJ-7 從9：00 開始隨著時(shí)間推移，泌蜜量呈上升趨勢(shì)，在11：00 時(shí)，品種ZJ-7 單花泌蜜量達(dá)到最高值，之后逐漸下降，在 12：00 時(shí)，品種 Z-17 泌蜜量達(dá)到最高值，之后呈緩慢下降趨勢(shì)。由此可以看出，4 個(gè)大豆品種泌蜜量變化從9：00 開始逐步升高，在13：00 以后呈逐步下降趨勢(shì)。15：00 時(shí)，品種 ZJ-7 和Z-119-99 又出現(xiàn)小高峰。

2.3 大豆花揮發(fā)性成分分析

2 個(gè)大豆品種JD-19 和ZJ-7，通過采用氣相色譜- 質(zhì)譜分析，測(cè)定出大豆花不同組分的質(zhì)譜總離子流圖（圖3），并采用質(zhì)譜- 計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果表明，大豆品種JD-19 和ZJ-7 中分別有41、40 種揮發(fā)性成分，分別為3- 辛酮、十三烷、1- 辛烯-3- 酮、正十五烷、芳樟醇、十一醛、苯乙醛、苯乙醇、棕櫚酸異丙酯、庚酸、順茉莉酮等化合物。最后采用面積歸一化法，計(jì)算得到2 個(gè)大豆品種不同成分的相對(duì)含量（表1）。

表1 2 種大豆花中揮發(fā)物成分分析

從表1、圖4 可以看出，JD-19 中醇類相對(duì)含量為63.22%，其中，以1- 辛烯-3- 醇的相對(duì)含量最高，為56.20%，其次為芳樟醇和1- 辛醇，其相對(duì)含量分別為2.08%和1.82%，3- 辛醇和1- 十五醇的相對(duì)含量分別為0.79%和0.66%?？梢缘贸?，JD-19 大豆花揮發(fā)物主要為醇類，酮類和酯類種類分別為8、6 種，但是較醇類含量相對(duì)較少。

ZJ-7 中揮發(fā)性成分中，醇類以1- 辛烯-3- 醇的相對(duì)含量最高，為52.74%，其次是1- 辛醇（3.14%）和3- 辛醇（2.47%）；硬脂醇相對(duì)含量最低，為0.13%。因此，ZJ-7 大豆花揮發(fā)物主要為醇類。烷烴類中十三烷相對(duì)含量較高，為1.72%。

研究報(bào)道中把含量較高、所占百分比較大的成分定義為揮發(fā)性主要成分（相對(duì)含量在3%以上）[7]。相對(duì)含量居中（1%～3%）的化合物成分定義為次要成分，種類較少或含量較低定義為修飾成分（相對(duì)含量在1%以下）。

ZJ-7 大豆花揮發(fā)物的主要成分為：3- 辛酮、1-辛烯 -3- 酮、1- 辛烯 -3- 醇、3，5，5 三甲基 2- 己烯、1- 辛醇；次要成分為十三烷、3- 辛醇、芳樟醇、乙酸癸酯、6，10，14- 三甲基 -2- 十五烷酮、7，9- 二叔丁基 -1- 氧雜螺[4.5]癸 -6，9- 二烯 -2，8- 二酮；修飾成分含量較少而種類卻較多，由29 種化合物組成。JD-19 大豆花揮發(fā)物的主要成分為：3- 辛酮、1- 辛烯 -3- 酮、1- 辛烯 -3- 醇、6，10，14- 三甲基-2- 十五烷酮；次要成分為3，5，5 三甲基2- 己烯、芳樟醇、乙酸癸酯、1- 辛醇；修飾成分含量較少而種類較多，由33 種化合物組成。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)4 個(gè)品種大豆單花泌蜜量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在一天中不同時(shí)間不同品種間泌蜜量存在一定差異。4 個(gè)大豆品種 Z-119-99、JD-19、Z-17、ZJ-7 在一天中泌蜜量達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)分別為13：00、11：00、12：00、11：00。內(nèi)在和外在因素相互作用共同影響蜜源植物開花泌蜜量。內(nèi)在因素主要為遺傳性方面，氣候（溫度和濕度）、降雨量、栽培土壤質(zhì)地等因素是影響蜜源植物泌蜜量的外在因素[13-18]。在栽培的蜜源植物中存在品種間的差異，從而造成不同植物的泌蜜特性（泌蜜量、泌蜜時(shí)間和花蜜濃度）存在差異。SEVERSON 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，一天中不同時(shí)間是影響大豆泌蜜量大小的主要因素；其花蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和總碳水化合物含量均隨時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，而花蜜體積則隨時(shí)間的增加而逐漸降低。本研究發(fā)現(xiàn)，一天中4 個(gè)大豆品種單花泌蜜量之間的差異可能是由于供試品種、栽培環(huán)境等原因造成的，掌握不同品種間單花泌蜜量變化趨勢(shì)，可為今后進(jìn)一步研究大豆泌蜜量和傳粉昆蟲之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，優(yōu)先考慮吸引昆蟲訪花授粉的品種，為今后大豆新品種選育和提質(zhì)增產(chǎn)提供新的評(píng)價(jià)指標(biāo)[19]。

在自然界中，昆蟲覓食信號(hào)是植物花朵釋放的不同的揮發(fā)性物質(zhì)。植物通過發(fā)出覓食信號(hào)來吸引傳粉昆蟲，達(dá)到為花朵授粉的目的，從而保證了植物界不同植物的繁衍進(jìn)化。這些花朵揮發(fā)性物質(zhì)在植物與動(dòng)物之間發(fā)揮著極其重要的作用。在自然界，植物種類不同，釋放的花朵揮發(fā)性物質(zhì)會(huì)存在一定差異。劉健等[20]對(duì)健康大豆、大豆蚜及蚜害大豆植株復(fù)合物、機(jī)械損傷大豆揮發(fā)物成分進(jìn)行了提取和組分分析，一共檢測(cè)出31 種揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)。本研究采用頂空固相微萃取和氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，測(cè)定2 個(gè)品種JD-19 和ZJ-7 大豆花散粉后的揮發(fā)性物質(zhì)成分，結(jié)果表明，JD-19 和ZJ-7 測(cè)得的揮發(fā)性物質(zhì)種類分別為41、40 種，其中，1- 辛烯-3- 醇在2 個(gè)大豆品種中含量最多，具有強(qiáng)烈的清香味（米糠油和藥草樣味）。在自然界中，薄荷類、水果類（香蕉和漿果）、豬肉、大豆、鮮蘑菇中含有1- 辛烯-3- 醇，類似于香料物質(zhì)[21-28]。由此可見，1-辛烯-3- 醇為大豆花氣味的主要貢獻(xiàn)化合物。JD-19中酮類化合物檢出8 種，其相對(duì)含量為16.66%，其中，1- 辛烯-3- 酮和3- 辛酮相對(duì)含量分別為5.1%和3.5%。ZJ-7 中1- 辛烯-3- 酮和3- 辛酮相對(duì)含量分別為10.96%和4.06%。在牡蠣和魚肉揮發(fā)成分測(cè)定中都有檢測(cè)出3- 辛酮，由此可知，3- 辛酮有可能會(huì)使大豆花朵氣味具有豆腥味[6-7，29]。JD-19 中烴類化合物檢出8 種，其中，烷烴類7 種，烯烴類1 種，其相對(duì)含量分別為3.91%和2.92%。ZJ-7 中烴類化合物檢出7 種，烷烴類6 種、烯烴類1 種，相對(duì)含量分別為3.13%和3.15%。研究表明，嗅覺閾值較高的烷烴類化合物，可能對(duì)氣味貢獻(xiàn)作用不明顯，同時(shí)酯類和烯烴類化合物可能對(duì)氣味特征貢獻(xiàn)也很小[6-7]。醛類化合物在JD-19 中檢出4 種，ZJ-7 中檢出3 種，油脂特征氣味的主要成分是醛類化合物。本研究檢測(cè)到的大豆鮮花揮發(fā)物成分種類和含量與文獻(xiàn)[6]會(huì)有一些出入，可能與試驗(yàn)方法、大豆品種和地域環(huán)境等多方面因素有關(guān)。本研究通過對(duì)大豆揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，獲得了2 個(gè)品種間大豆植株揮發(fā)物成分種類和含量，結(jié)果對(duì)于傳粉昆蟲相關(guān)領(lǐng)域研究工作的開展具有一定的參考價(jià)值[30]。試驗(yàn)中，尚需對(duì)大豆的全生育期揮發(fā)物釋放情況進(jìn)行細(xì)致分析，可為進(jìn)一步開展大豆揮發(fā)物對(duì)傳粉昆蟲吸引的研究奠定基礎(chǔ)。

志謝：特別感謝山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基因資源研究中心（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所）雜交大豆育種課題組在田間試驗(yàn)方面給予的大力幫助。