楊 茜，黃文芳，王雪琳，任豫超，史敏莉，賀立恒

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界三大糧食作物之一，其種植面積在谷物類作物中位居首位，是全球2.5 億余人的主糧[1]。小麥還為人類提供了約21%的膳食熱量和20%的蛋白營養(yǎng)，在保障糧食安全方面發(fā)揮著突出作用[1-3]。

氣孔作為植物水分排出和二氧化碳進入的主要通道，其狀態(tài)強烈影響著蒸騰作用和光合作用的生理過程[4]。在擬南芥中，表皮成熟的氣孔是由表皮原細胞（Protodermal cell，PC）經(jīng)一系列的分裂和分化活動發(fā)育而來的，3 種緊密相關(guān)的basic helixloop-helix（bHLH）家族蛋白 SPCH、MUTE 和 FAMA介導(dǎo)了這一過程[5]。其中，SPCH 是氣孔發(fā)育起始的關(guān)鍵因子，控制著PC 向擬分生組織母細胞（Meristemoid mother cell，MMC）的分化和 MMC 向擬分生細胞（Meristemoid cell，MC）的分裂[6]；MUTE 控制著 MC向保衛(wèi)母細胞（Guard mother cells，GMCs）的分裂[7]；FAMA 控制著 GMC 向成熟保衛(wèi)細胞（GC）的轉(zhuǎn)變[8]。研究發(fā)現(xiàn)，ICE1/SCREAM（SCRM）和 SCRM2 直接與SPCH、FAMA 和MUTE 相互結(jié)合形成二聚體，并影響其功能發(fā)揮[5]。此外，為了協(xié)調(diào)發(fā)育中的氣孔和表皮細胞之間的信號，防止氣孔彼此相鄰形成，許多胞外質(zhì)膜結(jié)合蛋白也是必不可少的[9]，包括表皮模式因子EPF 以及EPF-like 信號肽、Leu-rich repeat ERECTA 家族受體激酶以及TOO MANY MOUTHS（TMM）[10-11]。

單子葉植物和雙子葉植物的氣孔形態(tài)有著較大的差異，其中，單子葉植物的氣孔成排排列，呈啞鈴型；雙子葉植物的氣孔在葉片上不規(guī)則排列，呈腎型[12]，盡管二者在氣孔形態(tài)上存在較大的差異，但陸生植物氣孔形成的基本機制是相對保守的[13]。在水稻中，OsSPCH、OsMUTE、OsFAMA和OsICE1是成熟氣孔形成所必需的，其基本功能與擬南芥同源基因類似[14-15]。在現(xiàn)存最古老的氣孔譜系植物苔蘚中，成熟氣孔的形成同樣需要擬南芥中SPCH、MUTE、FAMA和ICE/SCRM的同源基因PpSMF1和PpSCRM1的介導(dǎo)[16-17]。在小麥近緣種二穗短柄草（Brachypodium distachyon）中，氣孔發(fā)育的起始同樣是由BdISCRM、BdSPCH1和BdSPCH2組成的氣孔發(fā)育模塊調(diào)控的[18]。

ICE1/SCRM 與 SPCH、MUTE 和 FAMA 的伙伴關(guān)系對于單子葉植物氣孔的啟動和成熟是必不可少的，但它們在單子葉植物中的蛋白功能可能與擬南芥中略有不同[14，19]。例如，在禾本科植物二穗短柄草中，存在著ICE1 和SCRM2 功能的特異化，而在擬南芥中這些蛋白似乎是冗余的[12，14]。類似地，在二穗短柄草中也發(fā)生了新的SPCH 重復(fù)和新功能化[20]，MUTE 對于二穗短柄草氣孔的副衛(wèi)細胞的形成具有決定性作用[18]。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥基因資源課題組利用基因定位獲得了1 個與小麥氣孔密度相關(guān)的候選基因TraesCS7A02G543300。本研究利用生物信息學(xué)軟件對小麥TraesCS7A02G543300基因的基本理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等進行分析，同時利用RT-qPCR分析小麥根、葉、莖在3 個時期的基因表達模式，旨在為進一步研究小麥TraesCS7A02G543300基因的功能和調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為普通小麥品種矮抗58。

1.2 試驗方法

本試驗于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家小麥改良中心完成，采用盆栽法進行小麥植株的培養(yǎng)，分別于兩葉一心期、拔節(jié)期和抽穗期收集健壯小麥根、莖、葉，并進行液氮速凍。

1.2.1TraesCS7A02G543300基因的克隆 使用北京莊盟公司的Plant Total RNA Kit（ZP405）提取小麥總RNA，使用EX RT kit（gDNAremover）（ZR108）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)Ensembl Plants 登錄的TraesCS7A02G543300基因序列，設(shè)計基因組特異引物（表1）。根據(jù)WANG 等[21]所述的方法進行PCR反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收純化并進行測序。

表1 用于基因克隆及表達分析的引物

1.2.2 TraesCS7A02G543300 蛋白的生物信息學(xué)分析 利用NCBI-ORF finder 工具獲取基因的開放閱讀框[22]；用Expasy-ProtParam 進行蛋白質(zhì)等電點、親疏水性等基本的理化性質(zhì)分析[23]；用NLS Mapper 預(yù)測核定位信號[24]；用Plant-mPLoc 預(yù)測蛋白質(zhì)亞細胞定位[25]；用 SignalP 4.0 預(yù)測蛋白的信號肽[26]；用NetPhos 3.1 分析蛋白質(zhì)序列潛在磷酸化位點[27]；用NPS-SOPMA 和SWISS-MODEL 分別對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測[28-29]；利用DNAMAN 軟件進行序列比對。

1.2.3TraesCS7A02G543300基因的表達分析 以1.2.1 獲得的 cDNA 為模板，參考 WANG 等[30]所述的方法進行實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）（TaTubulin為內(nèi)參基因，引物序列如表1 所示）。相對表達量的計算參考文獻[30]進行。采用SPSS 25.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TraesCS7A02G543300 基因的克隆

以1.2.1 得到的cDNA 為模板進行TraesCS7A02 G543300基因的擴增，電泳結(jié)果表明，在1 100 bp 左右有1 條明顯的特異性條帶（圖1）；測序結(jié)果表明，TraesCS7A02G543300基因的cDNA全長為1084bp；ORF 分析結(jié)果表明，該序列包含一個990 bp 的開放閱讀框，編碼329 個氨基酸。

2.2 TraesCS7A02G543300 蛋白的生物信息學(xué)分析

TraesCS7A02G543300 蛋白理化性質(zhì)分析表明，該蛋白分子式為C1540H2447N435O476S25，分子質(zhì)量為35.473 5 ku，理論等電點為5.1，親水系數(shù)為-0.182，脂溶系數(shù)為73.98，不穩(wěn)定系數(shù)是57.3（＞40），預(yù)測該蛋白為穩(wěn)定的酸性、親水性蛋白。在氨基酸序列第47—57 位含有核定位信號序列PASRKKRVEGM，表明該蛋白定位于細胞核。SignalP 4.0 分析無信號肽，表明該蛋白不是分泌型蛋白。NetPhos 3.1 分析結(jié)果表明，該蛋白中有18 個氨基酸可能被磷酸化，其中，包含11 個絲氨酸、5 個蘇氨酸和2 個酪氨酸。

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫對該蛋白進行了功能結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，該蛋白包含1 個保守的堿性/螺旋-環(huán)- 螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）結(jié)構(gòu)域。利用 BLAST 程序在 The Arabidopsis Information Re-source 數(shù)據(jù)庫中進行比較分析，結(jié)果表明，與其相似度最高的3 個擬南芥蛋白分別為AtbHLH093（相似性 51.76%）、AtICE1/AtSCRM（相似性 31.61%）和AtSCRM2（相似性33.6%），這3 個蛋白同屬于bHLH-LZs 亞家族，在擬南芥中參與了氣孔的發(fā)育過程。氨基酸序列比對結(jié)果表明，TraesCS7A02G543300蛋白與擬南芥SPCH、FAMA、MUTE 的相似度較低，其氨基酸一致性分別為20.00%、11.81%和21.15%（圖 2）。

TraesCS7A02G543300 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖3 所示，其主要由α- 螺旋和無規(guī)則卷曲組成，分別占比47.72%和40.73%；此外，N 端以α-螺旋的形式存在，C 端以延伸鏈的形式存在。以AtbHLH093 為模型蛋白對TraesCS7A02G543300 進行了三維結(jié)構(gòu)的建模，預(yù)測結(jié)果如圖4 所示，TraesCS7A02G543300 蛋白具有典型的螺旋- 環(huán)-螺旋（HLH）結(jié)構(gòu)。

2.3 TraesCS7A02G543300 基因的表達分析

RT-qPCR 結(jié)果表明（圖5），TraesCS7A02G543300基因在小麥葉中表達量極顯著高于根和莖；且在兩葉一心期的表達量極顯著高于拔節(jié)期和抽穗期，預(yù)測TraesCS7A02G543300基因在小麥的生長發(fā)育前期發(fā)揮主要作用。

3 結(jié)論與討論

為進一步了解TraesCS7A02G543300基因在小麥中的功能，本研究對TraesCS7A02G543300基因進行了生物信息學(xué)分析，并研究了TraesCS7A02G543300基因在矮抗58 不同組織及不同發(fā)育時期的表達特性。結(jié)果表明，TraesCS7A02G543300基因包含的完整開放閱讀框長度為990 bp，編碼了329 個氨基酸。TraesCS7A02G543300 蛋白的亞細胞定位被預(yù)測位于細胞核，這與其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能是一致的。TraesCS7A02G543300 蛋白包含1 個保守的b HLH 結(jié)構(gòu)域，屬于 bHLH-LZs 亞家族，與擬南芥中的AtICE1/SCRM 高度同源，因此，TraesCS7A02G 543300 的功能可能與擬南芥AtICE1/SCRM 類似[5]。TraesCS7A02G543300基因在小麥葉中的表達量顯著高于其他組織，在兩葉一心期的表達量明顯高于其他時期，這與ICE1/SCRM等氣孔發(fā)育調(diào)控因子在擬南芥等植物中的表達特性一致[5，13]。這些結(jié)果為TraesCS7A02G543300基因在小麥葉片中參與氣孔的發(fā)育過程奠定了理論基礎(chǔ)。

前人研究表明，ICE1/SCRM 能與SPCH、FAMA和MUTE 相互作用并影響氣孔的形成[6]。本研究對TraesCS7A02G543300 蛋白的基本理化性質(zhì)進行了預(yù)測分析，但關(guān)于其蛋白功能的研究相對粗淺。接下來可以利用酵母雜交等驗證TraesCS7A02G543300是否能與SPCH、FAMA 和MUTE 形成二聚體，從而研究TraesCS7A02G543300基因在小麥中的功能。除了參與氣孔發(fā)育過程外，ICE1/SCRM 和SCRM2還能參與植物的逆境響應(yīng)過程，過表達SCRM 能夠增強水稻的耐逆性[31]。因此，下一步可分析TraesCS7A02G543300基因在逆境脅迫下的表達量，從而驗證TraesCS7A02G543300基因是否參與了小麥的逆境響應(yīng)過程。但由于單子葉植物氣孔結(jié)構(gòu)及氣孔調(diào)控機制的差異，TraesCS7A02G543300基因的功能在小麥中是否有功能特化等還需進一步驗證。