周倩倩，張亞見，張靜，殷涂童，盛下放，何琳燕

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095）

近年來隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，牧草的需求量也逐漸擴(kuò)大，牧草的安全生產(chǎn)也愈受重視。紫花苜蓿（Medicago sativa）被譽(yù)為“牧草之王”，廣泛種植于世界各地，不僅具有飼用價(jià)值，還具有食用和藥用價(jià)值［1］，因此，苜蓿的質(zhì)量安全與人類健康息息相關(guān)。張虎等［2］發(fā)現(xiàn)，高濃度Co 脅迫會(huì)降低苜蓿幼苗抗氧化系統(tǒng)活性和活性氧清除能力，造成膜脂損傷，從而抑制了紫花苜蓿種子的萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)。邱麗莉等［3］通過探究不同Pb2+濃度對(duì)苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響發(fā)現(xiàn)，高濃度Pb2+會(huì)影響苜蓿的呼吸強(qiáng)度，降低其葉綠素含量從而抑制苜蓿的生長(zhǎng)。研究表明，苜蓿等牧草很容易從土壤和地下水環(huán)境中富集鉛。生長(zhǎng)在鉛污染土壤中的苜蓿易受到鉛的毒害，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢，品質(zhì)下降，同時(shí)也易出現(xiàn)鉛超標(biāo)事件，威脅畜產(chǎn)品安全和人體健康［4］。為了確保苜蓿品質(zhì)，保障人畜安全，必須減少苜蓿種植環(huán)境中的重金屬含量，降低重金屬向苜蓿的遷移。

土壤環(huán)境是植物生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，也是生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，一旦重金屬進(jìn)入土壤環(huán)境，很難通過自身的凈化能力去除。目前針對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)方法主要有物理、化學(xué)和生物修復(fù)。其中生物鈍化修復(fù)成為研究熱點(diǎn)，利用鈍化金屬的細(xì)菌來阻控植物吸收、積累重金屬成為許多學(xué)者不斷探索的方向。細(xì)菌表面具有許多官能團(tuán)，能夠與重金屬結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)吸附土壤中的重金屬；有些菌株能夠分泌一些胞外聚合物、多胺、硫化氫（H2S）等物質(zhì)來降低植物根際土壤重金屬的有效性［5］。研究表明，H2S 是細(xì)菌中重要的信號(hào)分子，在介導(dǎo)對(duì)生物或非生物脅迫的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。最近，已有研究表明，H2S 和下游反應(yīng)性硫類物質(zhì)可通過蛋白質(zhì)組的S 巰基化作用來調(diào)節(jié)某些細(xì)菌毒力基因的表達(dá)［6］；Huang 等［7］的研究結(jié)果表明外源添加H2S 能夠增強(qiáng)重金屬脅迫下金黃色葡萄球菌細(xì)胞的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性，降低重金屬對(duì)細(xì)胞的毒害，增強(qiáng)細(xì)胞的存活率，提高細(xì)胞對(duì)重金屬離子的去除能力。目前關(guān)于細(xì)菌產(chǎn)H2S 的研究大多與其耐藥性有關(guān)，在應(yīng)對(duì)重金屬脅迫方面研究較少，而且，關(guān)于H2S 是否提高微生物的修復(fù)效率及相關(guān)機(jī)理解釋還不清楚。

在植物細(xì)胞中，H2S 參與植物整個(gè)生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟和衰老的過程［8］，如促進(jìn)植物種子萌發(fā)［9］，調(diào)節(jié)根的形態(tài)建成［10］，調(diào)控陰離子通道［11］等。此外，H2S 能夠提高植物對(duì)多種環(huán)境脅迫的抗性，包括干旱、高鹽、極端溫度以及重金屬脅迫等［12］。近年來越來越多的學(xué)者通過外源添加H2S 的方式來緩解重金屬對(duì)植物的毒害作用，Cui 等［13］發(fā)現(xiàn)，外源添加H2S 能夠通過調(diào)節(jié)Cd 脅迫下苜蓿體內(nèi)谷胱甘肽和活性氧（reactive oxygen species ，ROS）水平來增強(qiáng)苜蓿對(duì)Cd 的耐受性并減少苜蓿幼苗對(duì)Cd 的吸收；Fang 等［14］發(fā)現(xiàn)，在Pb 和Cd 污染土壤中，外源添加H2S 能夠增加Pb 和Cd 脅迫下苜蓿體內(nèi)葉綠素含量，促進(jìn)苜蓿生長(zhǎng)，提高苜蓿體內(nèi)抗氧化酶活性，并通過增加污染土壤中過氧化氫酶和多酚氧化酶活性、根際細(xì)菌群落，從而減少苜蓿對(duì)Pb 和Cd 的吸收。但是外源添加H2S 的方式在生產(chǎn)實(shí)際中難以為繼，應(yīng)用很少，需要尋找其他更加可行的方法產(chǎn)生H2S，因此，以微生物產(chǎn)生H2S 具備了潛在應(yīng)用前景，然而目前關(guān)于產(chǎn)H2S 細(xì)菌對(duì)植物吸收重金屬的影響和機(jī)制研究鮮有報(bào)道。

本研究首先篩選耐重金屬的產(chǎn)H2S 細(xì)菌，然后采用田間小區(qū)試驗(yàn)，以一株高產(chǎn)H2S 細(xì)菌為供試菌株，研究其對(duì)生長(zhǎng)于Pb 污染土壤上的苜蓿吸收、積累Pb 以及土壤理化性質(zhì)的影響，以期闡明產(chǎn)H2S 細(xì)菌鈍化修復(fù)Pb 污染土壤、減少苜蓿Pb 含量的作用和機(jī)制，為今后牧草的安全生產(chǎn)及重金屬污染土壤的修復(fù)提供理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

培養(yǎng)基：LB 液體培養(yǎng)基（蛋白粉10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，去離子水1000 mL，pH 7.0），1/5 LB 固體培養(yǎng)基（蛋白粉2 g，酵母粉1 g，氯化鈉1 g，去離子水1000 mL，瓊脂粉2 g，pH 7.0），1/5 LB 液體培養(yǎng)基（蛋白粉2 g，酵母粉 1 g，氯化鈉 1 g ，去離子水 1000 mL，pH 7.0）。YN 液體培養(yǎng)基（蔗糖 10 g，硫酸銨 1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.1 g，磷酸氫二鉀 0.2 g，酵母粉 0.5 g，去離子水 1000 mL，pH 7.2）。

供試植物：紫花苜蓿，種子購自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子站。

1.2 鉛抗性產(chǎn)硫化氫細(xì)菌的分離篩選與鑒定

2019 年4 月1 日，將從云南省蘭坪白族普米族自治縣某礦區(qū)附近農(nóng)田采集的苜蓿清洗干凈，剪取干凈完整的根部，用75%乙醇浸泡3 min 消毒，然后用無菌水沖洗3 次。用滅菌后的研缽將根部磨碎并進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專瑢⑵渫坎加诤?50 mg·L?1Pb（NO3）2的 1/5 LB 固體培養(yǎng)基上，在 30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3～5 d 后，挑取單個(gè)菌落，再劃線純化2～3 次，然后將菌株保藏備用。

H2S 檢測(cè)參考Shatalin 等［15］的方法，配置 LB 固體培養(yǎng)基，滅菌后每100 mL 培養(yǎng)基加入1 mL 過濾除菌的10%硫代硫酸鈉和醋酸鉛，以實(shí)驗(yàn)室保存的一株不產(chǎn)H2S 的臺(tái)灣假單胞菌（Pseudomonas taiwanensis）WRs8 作為對(duì)照，用牙簽挑取純化后的單菌落豎直插入H2S 培養(yǎng)基中，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察其顏色變化。以是否產(chǎn)生黑色硫化鉛沉淀判斷其是否有H2S 產(chǎn)生，以此篩選產(chǎn)H2S 的菌株。

菌株吸附 Pb 能力的測(cè)定參考 Han 等［5］的方法，將供試菌株接種于 1/5 LB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r·min?1培養(yǎng)12～16 h 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，離心收集菌體并清洗，用無菌水重懸，然后將菌株接種于含10 mg·L?1Pb（NO3）2的1/5 LB 液體培養(yǎng)基中，以未接菌的培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，30 ℃靜置培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)結(jié)束后，取4 mL 發(fā)酵液、6000 r·min?1離心10 min、取上清液2 mL，加入2 mL 10%的硝酸，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀ICP?OES（inductively coupled plasma?optical emission spectrometer，Optima 2100DV，Perkin Elmer）測(cè)定上清液中Pb2+濃度。

將供試菌株接種于含不同濃度的 Cd（0、10、20、30、40 和 50 mg·L?1）和 Pb（100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg·L?1）的 1/5 LB 液體培養(yǎng)基中，以不接菌處理作為對(duì)照，30 ℃培養(yǎng) 3～5 d，觀察菌株能否正常生長(zhǎng)。吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）的測(cè)定參考 Jiang 等［16］的方法。鐵載體測(cè)定參考 Rajkumar 等［17］的方法。脲酶的檢測(cè)參考 Ignatius 等［18］的方法。

提取供試菌株的總DNA，利用通用引物 27F（正向引物）：5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′；1492R（反向引物）：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物送至南京金斯瑞公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST 軟件與Gene Bank 中已知的16S rDNA 序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3 菌劑的制備

供試菌株經(jīng)過活化，挑取單菌落接種至新鮮LB 培養(yǎng)基中，置于30 ℃、160 r·min?1搖床上過夜培養(yǎng)18 h，隨后6000 r·min?1離心5 min，收集菌體，用生理鹽水重懸（保持總體積不變），制得液體菌劑，含細(xì)菌數(shù)量108cfu·mL?1。將菌液一分為二，一份做活菌液接種，另一份經(jīng)121 ℃、30 min 高壓滅菌，作為滅菌液接種用。

1.4 田間試驗(yàn)

田間試驗(yàn)地點(diǎn)選自江蘇省南京市棲霞區(qū)某礦區(qū)周邊一處農(nóng)田（32°9.7′N，118°56.8′E），土壤基本性質(zhì)為：土壤總 Pb 含量為 400 mg·kg?1，有機(jī)質(zhì)（11.67±1.49）g·kg?1，pH（6.81±0.05）（土∶水=1 g∶2.5 mL），肥力適中。試驗(yàn)進(jìn)行前，將所選地塊經(jīng)過除草、翻地、晾干、碎土和平整后，用卷尺分成9 個(gè)2 m×3 m 的小區(qū)，每個(gè)小區(qū)之間留下20 cm 的間隙。試驗(yàn)共有3 個(gè)處理，分別是不接菌處理組（CK）、接活菌液處理組（Sar15）、接滅菌液處理組（dSar15）。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。為了降低地塊區(qū)域環(huán)境對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，采用隨機(jī)小區(qū)分布方式處理。

首先對(duì)苜蓿種子進(jìn)行消毒，用5%的次氯酸鈉溶液浸泡5 min，然后用無菌去離子水洗3 次。將牧草種子分別放到活菌液和滅菌液中浸種2 h，最后將種子均勻地撒到每個(gè)小區(qū)土壤的表面，薄土覆蓋，用相對(duì)應(yīng)菌液澆灌，對(duì)照澆等量水，再用遮陽網(wǎng)蓋住。待種子生長(zhǎng)5 d 后，掀開遮陽網(wǎng)，正常生長(zhǎng)。同時(shí)，在生長(zhǎng)的過程中，逐步間苗。整個(gè)牧草生長(zhǎng)周期共計(jì)90 d，期間注意灌溉和除草。

1.5 土壤和植物樣品的分析

將苜蓿植株清洗干凈，根部用0.01 mol·L?1EDTA-2Na 溶液浸泡10 min，清洗完畢后瀝干，稱取苜蓿的鮮質(zhì)量。將苜蓿地上部和根部組織在100 ℃下殺青30 min，然后在80 ℃下烘干至恒重，稱取干質(zhì)量。

將烘干后的地上部和根部組織磨碎，準(zhǔn)確稱取0.1 g 于微波消解儀中進(jìn)行消解，5% HNO3定容，用ICP?OES 溶液中測(cè)定Pb2+濃度，分別計(jì)算苜蓿地上部和根部Pb 含量。

苜蓿Pb 轉(zhuǎn)移系數(shù)、富集系數(shù)及Pb 的總含量按下面公式計(jì)算：

轉(zhuǎn)移系數(shù)（translocation factor，TF）=苜蓿地上部 Pb 含量（mg·kg?1）/苜蓿根部 Pb 含量（mg·kg?1），根部富集系數(shù)（bioconcentration factor，BCF）=苜蓿根部 Pb 含量（mg·kg?1）/土壤 Pb 含量（mg·kg?1），Pb 總含量（mg）=苜蓿地上部（或根部）Pb 含量（mg·kg?1）×地上部（或根部）干質(zhì)量（kg）。

DTPA（diethylene thiamine pentacetate acid，二乙烯五乙酸硫胺）提取劑的配制參照Li 等［19］的方法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取風(fēng)干后研磨過0.850 mm 篩的根際土壤，將其與DTPA 提取劑按1∶4 的質(zhì)量體積比混合，置于160 r·min?1搖床上室溫振蕩2 h，8000 r·min?1離心后取上清液，用ICP?OES 測(cè)定上清液中Pb2+的濃度，并計(jì)算每kg 土壤樣品中DTPA 提取態(tài)Pb 的含量。

使用BCR 分級(jí)提取法［20］對(duì)根際土壤中Pb 進(jìn)行分級(jí)提取，每步提取完成后，用去離子水清洗，然后5000 r·min?1，離心10 min，將上清液與相應(yīng)的提取液合并，用ICP?OES 測(cè)定Pb 的含量。第1 步為酸可提取態(tài)，第2 步為可還原態(tài)，第3 步為可氧化態(tài)。

將風(fēng)干并研磨過0.425 mm 篩的根際土壤與去離子水按1∶2.5 的質(zhì)量體積比混合，置于160 r·min?1搖床上室溫振蕩 2 h，6000 r·min?1離心 5 min，用 pH 計(jì)（Srtourius PB-10，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）測(cè)定土壤 pH 值。土壤酶活性的測(cè)定參考關(guān)松蔭［21］的方法。

采集0.1 g 各處理組新鮮苜蓿根部，置于2 mL 離心管中加入1.9 mL 去離子水，在超聲儀中振蕩2～3 min，將此溶液進(jìn)行梯度稀釋，取含菌水溶液涂到加有 100 mg·L?1Pb、50 mg·L?1慶大霉素和 25 mg·L?1氯霉素的 LB 固體平板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算菌株在根表的定殖數(shù)目。然后取出根樣品，用75%酒精消毒3 min，用無菌去離子水沖洗3 次，加入無菌水研磨并進(jìn)行梯度稀釋，將根勻漿液均勻地涂布在含有100 mg·L?1Pb、50 mg·L?1慶大霉素和 25 mg·L?1氯霉素的 LB 固體平板，30 ℃培養(yǎng) 3～5 d，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，計(jì)算菌株在根內(nèi)的定殖數(shù)目。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究各處理均重復(fù)3 次，利用Microsoft Office 2016 和GraphPad Prism 制表、作圖。利用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著分析利用t值檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的篩選與鑒定

從紫花苜蓿根內(nèi)分離純化得到5 株具有較強(qiáng)產(chǎn)H2S 能力的菌株，編號(hào)分別為 Mr2、Mr3、Mr11、Mr40和Sar15，圖1 為菌株在產(chǎn)H2S 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落和產(chǎn) H2S 特征，其中 Sar15 產(chǎn) H2S 能力最強(qiáng)。H2S 能與鉛產(chǎn)生黑色硫化鉛沉淀，培養(yǎng)基顏色變黑表明菌株具有產(chǎn)H2S 的能力，且顏色越深表明菌株產(chǎn)H2S 能力越強(qiáng)。隨后對(duì)這5 株菌株吸附Pb 特性及生理特性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)除菌株Mr2 外，其余4 株菌株均能顯著降低溶液中Pb2+濃度，其降低率為23%～60%，菌株Sar15 處理的溶液Pb2+濃度最低（圖2）。5 株菌株均能產(chǎn)IAA、鐵載體，菌株Mr3、Mr40 和Sar15 均產(chǎn)脲酶（表1）。通過對(duì)這5 株菌株產(chǎn)H2S 能力、吸附Pb 能力及生理特性的綜合分析，將菌株Sar15 作為后續(xù)試驗(yàn)的供試菌株。16S rDNA 序列與 GeneBank 中彭氏變形菌 NCTC 12737（P. penneriNCTC 12737）的 16S rDNA 序列相似性達(dá)99.76%，將其歸屬為彭氏變形菌，16S rDNA 序列登錄號(hào)為MT557004。

表1 菌株的生理特性Table 1 Physiological characteristics of the isolated strains

圖1 菌株產(chǎn)H2S 特性Fig.1 Hydrogen sulfide-producing characteristics of strains

圖2 菌株對(duì)溶液中鉛濃度的影響Fig.2 Effect of strains on the concentration of Pb in solution

2.2 菌株Sar15 對(duì)苜蓿生物量和吸收Pb 的影響

在Pb 污染土壤中，與不接菌對(duì)照相比，接種活菌Sar15 的苜蓿地上部和根部干重分別顯著增加20%和25%；與CK 相比，接種活菌Sar15 處理顯著降低了苜蓿組織中的Pb 含量，其中地上部和根部Pb 含量分別下降了44%和45%，地上部和根部Pb 總量分別下降了32%和31%。Sar15 能顯著減少紫花苜蓿Pb 的富集系數(shù)，與CK 相比，接種活菌Sar15 后苜蓿Pb 富集系數(shù)極顯著下降了45%（P＜0.01），對(duì)Pb 轉(zhuǎn)移系數(shù)無顯著影響。接種滅活菌液對(duì)苜蓿Pb 吸收特性無顯著影響（表2）。

表2 Sar15 對(duì)紫花苜蓿干重、Pb 含量、總量、轉(zhuǎn)移系數(shù)和富集系數(shù)的影響Table 2 Effects of strain Sar15 on the dry weight，Pb content，total content，translocation factor and bioconcentration factor of M.sativa

2.3 菌株Sar15 對(duì)紫花苜蓿根際土壤pH、DTAP 提取態(tài)Pb 含量和土壤酶活性的影響

通過對(duì)牧草土壤pH、DTAP 提取態(tài)Pb 含量、脲酶和硫酸酯酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在Pb 污染土壤中，與CK相比，接種活菌Sar15 能夠使苜蓿根際土壤pH 顯著提高0.24 個(gè)單位（圖3A）；使得苜蓿根際土壤DTPA 提取態(tài)Pb 含量顯著降低32%（圖3B）；接種活菌Sar15 使紫花苜蓿根際土壤脲酶和硫酸酯酶活性分別顯著提高了15%和59%（圖3C，D）。但接種滅活菌液的苜蓿根際土壤的pH、DTPA 提取態(tài)Pb 含量、脲酶和硫酸酯酶活性都沒有顯著變化。

圖3 菌株Sar15 對(duì)苜蓿根際土壤pH、DTPA 提取態(tài)鉛含量、脲酶和硫酸酯酶活性的影響Fig.3 Effects of strain Sar15 on pH，DTPA-extractable Pb content，urease and sulfatase activity in rhizosphere soil of M.sativa

2.4 菌株Sar15 對(duì)苜蓿根際土壤Pb 形態(tài)及含量的影響

在Pb 污染土壤中，與CK 相比，接種活菌Sar15 使苜蓿根際土壤酸可提取態(tài)Pb 含量顯著降低了43%（圖4A）；與CK 相比，各處理組對(duì)紫花苜蓿根際土壤可還原態(tài)Pb 沒有顯著影響（圖4B）。與CK 相比，接活菌Sar15 處理能夠顯著增加紫花苜蓿根際土壤可氧化態(tài)Pb 含量，使得苜蓿根際可氧化態(tài)Pb 含量顯著增加了33%（圖4C）。而接滅活菌液組的紫花苜蓿根際土壤以及非根際土壤Pb 形態(tài)沒有顯著變化。說明Pb 向有機(jī)結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化，可能受土壤有機(jī)物、pH 等變化的影響。

圖4 菌株Sar15 對(duì)苜蓿根際土壤酸可提取態(tài)Pb、可還原態(tài)Pb 和可氧化態(tài)Pb 含量的影響Fig. 4 Effects of strain Sar15 on the content of acid extractable Pb，reducible Pb and oxidizable Pb in M. sativa rhizosphere soil

2.5 菌株在紫花苜蓿根部的定殖

通過平板計(jì)數(shù)方法發(fā)現(xiàn)，接活菌Sar15 組中在苜蓿根表和根內(nèi)均能檢測(cè)到Sar15 菌株，且其在根表的定殖數(shù)量可達(dá)105cfu·g?1（圖5），菌株Sar15 在根表定殖數(shù)量大于根內(nèi)，大量細(xì)胞可為土壤提供有機(jī)物。對(duì)照和接滅活菌液處理組的平板在該數(shù)量級(jí)沒有觀察到菌落的形成。

圖5 菌株Sar15 在苜蓿根部的定殖Fig.5 Colonization of strain Sar15 in the roots of M. sativa

3 討論

紫花苜蓿是重要的多年生牧草，在世界范圍內(nèi)分布廣泛［22］，包括許多被重金屬污染的地區(qū)。生長(zhǎng)在重金屬污染土壤的牧草體內(nèi)重金屬含量升高，牧草組織中過多的重金屬積累會(huì)抑制其生長(zhǎng)，降低其產(chǎn)量，并增加重金屬進(jìn)入食物鏈的風(fēng)險(xiǎn)［23?24］。 因此，提高牧草的生物量和減少牧草組織中重金屬的積累是有效和安全使用牧草的重要因素。最近的研究表明，H2S 可以保護(hù)植物免受重金屬脅迫，例如 Ni［25］，Cd［26］，Cr［27］，Pb［28］和 Zn［29］等，一些學(xué)者通過外源添加硫氫化鈉生成 H2S，緩解重金屬對(duì)植物的毒害。但是外源添加劑在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用受到限制，因此，分離篩選具有產(chǎn)H2S 特性的細(xì)菌在修復(fù)重金屬污染土壤方面具有可行性。其中沙門氏菌、愛德華氏菌、亞利桑那菌、檸檬酸桿菌和變形菌等細(xì)菌具有產(chǎn)H2S 的特性。本研究從生長(zhǎng)在重金屬污染地區(qū)的苜蓿根內(nèi)分離篩選到一株產(chǎn)H2S 的細(xì)菌Sar15，可以降低溶液中Pb 含量，可能是細(xì)菌產(chǎn)生的H2S 與鉛形成了硫化鉛沉淀，還需收集并檢測(cè)到硫化鉛沉淀加以證實(shí)。另外，菌株Sar15 具有合成IAA、鐵載體和脲酶的能力，IAA 和鐵載體能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)和鐵素營(yíng)養(yǎng)、提高植物抗逆性。嚴(yán)警等［30］發(fā)現(xiàn)苜蓿中華根瘤菌 D10 具有產(chǎn)IAA 和鐵載體的能力，該菌株能夠促進(jìn)苜蓿在Cu 污染土壤中的生長(zhǎng)，增強(qiáng)苜蓿對(duì)Cu 的耐受性；脲酶可以分解尿素提高環(huán)境pH 值。Singh 等［31］通過研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌釋放的脲酶催化尿素水解為氨（NH3），能夠增加溶液或土壤的pH，從而降低重金屬的毒性和生物有效性。田間試驗(yàn)表明該菌株不僅可以提高苜蓿的生物量，還能降低苜蓿地上部和根部對(duì)Pb 的吸收量，為產(chǎn)H2S 細(xì)菌在阻控牧草吸收重金屬的應(yīng)用上提供了試驗(yàn)依據(jù)。

根際土壤是指受植物根系直接影響的那部分區(qū)域土壤，其區(qū)域的重金屬形態(tài)直接影響到重金屬對(duì)植物的有效性［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株Sar15 能夠顯著增加苜蓿根際土壤的pH、脲酶和硫酸酯酶活性，降低土壤DTPA 提取態(tài)鉛含量。土壤脲酶能夠作用于土壤有機(jī)物質(zhì)中的C?N 鍵，從而促進(jìn)土壤中尿素水解成氨，加速土壤中的氮循環(huán)，脲酶活性增加可能是土壤pH 升高的一個(gè)重要原因。土壤pH 一般與酸可提取態(tài)重金屬含量呈負(fù)相關(guān)，而與可氧化態(tài)和可還原態(tài)重金屬呈正相關(guān)。酸可提取態(tài)主要包括水溶態(tài)、可交換態(tài)及碳酸鹽結(jié)合態(tài)，這一形態(tài)重金屬對(duì)環(huán)境較敏感，易于遷移轉(zhuǎn)化，容易被植物吸收；可氧化態(tài)重金屬在土壤中主要表現(xiàn)為有機(jī)結(jié)合態(tài)，是土壤中各種有機(jī)物，動(dòng)植物體腐殖質(zhì)及礦物顆粒等包裹重金屬形成的螯合物［33］，隨著土壤pH 值的升高，土壤中存在的有機(jī)物重金屬絡(luò)合物會(huì)逐漸穩(wěn)定，有機(jī)結(jié)合態(tài)重金屬含量增多。土壤可還原態(tài)重金屬在土壤中主要表現(xiàn)為鐵錳氧化態(tài)，土壤中pH 值和氧化還原電位較高時(shí)有利于鐵錳氧化物的形成。細(xì)菌胞外分泌物如H2S 等與土壤中重金屬形成沉淀，降低重金屬有效性。本研究發(fā)現(xiàn)，接菌處理使苜蓿根際土壤中可氧化態(tài)Pb 含量增加，但可還原態(tài)Pb 變化無差異，推測(cè)細(xì)菌及其代謝物可與Pb 形成螯合物并以有機(jī)結(jié)合態(tài)的形式固定在土壤中，沒有明顯鐵錳氧化物形成。土壤中的硫酸酯酶通常來自微生物，參與土壤中的硫素循環(huán)，催化土壤中的有機(jī)硫經(jīng)中間體H2S 轉(zhuǎn)化為無機(jī)硫酸鹽形式被植物吸收［34］。菌株Sar15 能夠顯著增加苜蓿根際土壤硫酸酯酶活性，因而可能增加苜蓿硫素營(yíng)養(yǎng)，從而增強(qiáng)苜蓿抗逆性，可進(jìn)一步研究苜蓿硫素養(yǎng)分循環(huán)來闡明功能菌株阻控苜蓿吸收重金屬的機(jī)理。此外，微生物在土壤中的生存能力是微生物修復(fù)重金屬污染土壤的基礎(chǔ)［35］，菌株在植物根部大量聚集而發(fā)揮作用［5］。菌株Sar15 能夠在苜蓿根內(nèi)及根表定殖，有利于細(xì)菌發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

本研究從受污染土壤中生長(zhǎng)的紫花苜蓿根內(nèi)篩選到了一株高產(chǎn)H2S 且可降低溶液中Pb 含量的菌株Sar15，在Pb 含量為400 mg·kg?1的土壤中，接種菌株Sar15 能夠極顯著降低紫花苜蓿地上部Pb 含量、根際土壤有效態(tài)Pb 含量，提高土壤pH、土壤脲酶及硫酸酯酶活性，降低酸可提取態(tài)Pb 含量，提高可氧化態(tài)Pb 含量，促進(jìn)苜蓿的生長(zhǎng)，為Pb 污染環(huán)境中牧草的安全生產(chǎn)提供實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。