喬兵兵 李世朋 宋浩森 季敏 趙龍栓

肝臟缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是常見的臨床問題，其發(fā)生機(jī)制錯綜復(fù)雜[1-3]。細(xì)胞焦亡是一種依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase），并伴有大量促炎因子釋放的程序性細(xì)胞死亡，在細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)等病理生理過程中具有重要作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡可參與肝細(xì)胞的損傷與修復(fù)[6]，但磷酸甘油酸變位酶5（phosphoglycerate mutase 5，PGAM5）調(diào)控細(xì)胞焦亡參與肝臟 IRI的分子機(jī)制并不明確。本項目通過研究PGAM5/Caspase-1/Gasdermin D（GSDMD）信號通路調(diào)控細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制，以明確PGAM5調(diào)控細(xì)胞焦亡在肝臟IRI過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

雄性C57小鼠30只，體質(zhì)量（22.0±2.0）g，清潔等級為無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供。小鼠正常肝細(xì)胞AML12細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK購于上海藍(lán)木化工有限公司，PGAM5 小干擾核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）及 siRNA 陰性對照（siRNA-negative control，siRNA-NC）均購于廣州銳博生物公司；PGAM5、NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、Caspase-1、 裂 解Caspase （cleaved Caspase）-1、GSDMD與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購于英國Abcam公司；蛋白定量試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于北京百普賽斯生物科技有限公司；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α試劑盒、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β試劑盒、免疫組織化學(xué)（免疫組化）試劑盒及免疫熒光試劑盒均購自鄭州賽默斯生物科技有限公司。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）試劑盒購于德國 Roche公司。四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒購于美國Sigma公司。

1.2 小鼠肝臟IRI模型建立與分組

建立小鼠肝臟IRI模型的方法參考文獻(xiàn)[7]，缺血1 h后松開血管夾，然后關(guān)閉腹部切口。再灌注時間分別設(shè)置為 6 h（6 h 組）和 12 h（12 h 組），并設(shè)立假手術(shù)組（Sham組），每組10只小鼠。小鼠再灌注6 h、12 h取血清后脫臼處死，收集肝組織。血清用于生化指標(biāo)檢測，肝組織用于病理學(xué)檢查、免疫組化、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）、蛋白質(zhì)印跡法等實驗。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、處理與分組

將狀態(tài)良好的AML12細(xì)胞以1×105/孔接種于培養(yǎng)板，待其貼壁，參考文獻(xiàn)[8]建立AML12細(xì)胞IRI模型（IRI組）。采用5 μM Z-YVAD-FMK 預(yù)處理AML12細(xì)胞，再建立肝細(xì)胞IRI模型（抑制劑組），并將未處理的AML12細(xì)胞作為對照組，用于分析抑制Caspase-1活性對肝細(xì)胞焦亡的影響。

采用脂質(zhì)體3000將PGAM5 siRNA（siRNA組）和siRNA-NC（siRNA-NC組）轉(zhuǎn)染至AML12細(xì)胞，再建立肝細(xì)胞IRI模型，并將未處理的AML12細(xì)胞作為對照組，用于分析PGAM5調(diào)控細(xì)胞焦亡對AML12細(xì)胞IRI的影響。

1.4 實驗方法

1.4.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗 小鼠建模完成后取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）試劑盒檢測 TNF-α、IL-1β、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

1.4.2 病理學(xué)檢查 小鼠肝組織標(biāo)本采用10%多聚甲醛等滲溶液固定，采用梯度酒精脫水、二甲苯透明，制作肝組織石蠟塊后切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.4.3 TUNEL染色 肝組織石蠟切片常規(guī)去蠟、水洗，蛋白酶 K 37 ℃孵育 15 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗后添加TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗后于正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.4 免疫組化染色 石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化以及抗原修復(fù)后，Caspase-1及PGAM5抗體4 ℃濕盒中孵育12 h，滴加免疫組化試劑盒工作液，3,3′-二氨基聯(lián)苯胺（3,3′-diaminobenzidine，DAB）顯色，顯微鏡下觀察并拍攝，陽性細(xì)胞染色呈棕黃色。

1.4.5 RT-qPCR 提取各組小鼠肝組織總 RNA，采用RT-qPCR檢測IL-1β、PGAM5信使核糖核酸（message ribonucleic acid，mRNA）的表達(dá)。

1.4.6 免疫熒光染色 AML12細(xì)胞處理后采用10%多聚甲醛等滲溶液固定，PBS漂洗后GSDMD一抗4 ℃濕盒中孵育12 h，加相應(yīng)免疫熒光二抗，PBS漂洗后于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.7 蛋白質(zhì)印跡法 提取各組小鼠肝組織蛋白，檢測肝組織PGAM5、GAPDH的表達(dá)，提取各組AML12細(xì)胞蛋白，檢測PGAM5、cleaved Caspase-1、GSDMD、NLRP3、GAPDH的表達(dá)。一抗4 ℃孵育12 h，加相應(yīng)二抗37 ℃孵育1 h，進(jìn)行X線片曝光，顯影、定影。

1.4.8 MTT 檢測細(xì)胞存活率 將各組 AML12 細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板，培養(yǎng)20 h時每孔加入5 mg/mL MTT 溶液 20 μL 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液 200 μL，震蕩 5 min 后酶標(biāo)儀檢測 490 nm 處每孔的吸光度（absorbance，A）值。細(xì)胞存活率=處理組A值/對照組A值×100%。

1.5 研究方法

分析IRI對小鼠肝組織和血清學(xué)指標(biāo)的影響；分析小鼠肝臟IRI過程中PGAM5、Caspase-1的表達(dá)情況；分析抑制Caspase-1活性對細(xì)胞焦亡的影響；分析PGAM5調(diào)控細(xì)胞焦亡對AML12細(xì)胞IRI的影響。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對于符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IRI對小鼠肝組織和血清學(xué)指標(biāo)的影響

6 h組和12 h組小鼠肝組織中部分肝細(xì)胞水腫，肝竇區(qū)變窄，中央靜脈充血，偶見點灶狀壞死等，且12 h組較6 h組病變加重（圖1A）。與Sham組比較，6 h組和12 h組小鼠血清ALT、AST水平均升高，且12 h組高于6 h組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01～0.05，圖1B、C）。與Sham組比較，6 h組和12 h組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平均升高，且12 h組較6 h組下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01～0.05，圖1D、E）。與Sham組比較，6 h組和12 h組小鼠肝組織IL-1β mRNA 相對表達(dá)量均升高，12 h 組低于 6 h組（P＜0.01～0.05， 圖 1F）。 與 Sham 組 比 較，6 h組和12 h組小鼠肝組織中細(xì)胞凋亡率均升高，12 h組較6 h組減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＜0.01，圖1G、H）。

圖1 各組小鼠肝組織和血清學(xué)指標(biāo)的表現(xiàn)Figure 1 Manifestations of the indexes of liver tissues and serology of mice in each group

2.2 PGAM5及Caspase-1在小鼠肝臟IRI過程中的表達(dá)

與Sham組比較，6 h組和12 h組小鼠肝組織PGAM5 mRNA相對表達(dá)量及蛋白相對表達(dá)量均升高，且 12 h 組 高 于 6 h 組（P＜0.01～0.05， 圖 2A、B）；6 h組和12 h組小鼠肝組織PGAM5、Caspase-1蛋白表達(dá)均增多（圖2C）。

圖2 各組小鼠肝組織PGAM5和Caspase-1的表達(dá)情況Figure 2 Expression of PGAM5 and Caspase-1 in liver tissues of mice in each group

2.3 抑制Caspase-1活性對肝細(xì)胞焦亡的影響

IRI組 細(xì) 胞 NLRP3、cleaved Caspase-1 及 GSDMD蛋白相對表達(dá)量均高于對照組，而抑制劑組細(xì)胞NLRP3、cleaved Caspase-1及GSDMD蛋白相對表達(dá)量均較IRI組下降（P＜0.01～0.05，圖3A）。IRI組細(xì)胞GSDMD熒光強(qiáng)度較對照組增強(qiáng)，抑制劑組細(xì)胞GSDMD熒光強(qiáng)度較IRI組減弱（均為P＜0.01，圖3B）。

圖3 各組肝細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Figure 3 Expression of pyroptosis related proteins of hepatocytes in each group

2.4 PGAM5調(diào)控細(xì)胞焦亡對AML12細(xì)胞IRI的影響

為了進(jìn)一步研究PGAM5調(diào)控細(xì)胞焦亡的機(jī)制，本文采用PGAM5 siRNA轉(zhuǎn)染AML12細(xì)胞進(jìn)行驗證。siRNA-NC組細(xì)胞的存活率較對照組下降，siRNA組細(xì)胞的存活率較 siRNA-NC 組升高（P＜0.01～0.05，圖4A）。siRNA-NC組細(xì)胞PGAM5、NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD蛋白相對表達(dá)量均較對照組升高，siRNA 組細(xì)胞 PGAM5、NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD蛋白相對表達(dá)量均較siRNA-NC組下降（P＜0.01～0.05，圖4B）。siRNA-NC組細(xì)胞GSDMD熒光強(qiáng)度較對照組增強(qiáng)，而siRNA組細(xì)胞GSDMD熒光強(qiáng)度較siRNA-NC組減弱（均為P＜0.01，圖4C）。

圖4 各組肝細(xì)胞存活及PGAM5/Caspase-1/GSDMD信號通路蛋白表達(dá)情況Figure 4 Survival and protein expression of PGAM5/Caspase-1/GSDMD signaling pathway in hepatocytes in each group

3 討 論

肝臟外科或肝移植手術(shù)過程中常需要阻斷肝門血管，造成肝臟IRI，引起術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥[8-9]。肝臟IRI是機(jī)制復(fù)雜的病理生理過程，是肝臟疾病研究的熱點[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，IRI小鼠肝組織PGAM5表達(dá)隨再灌注時間延長而變化，在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯水平均顯示出差異性，提示PGAM5可能參與了肝臟IRI過程。PGAM5作為一種線粒體膜蛋白，在細(xì)胞壞死和凋亡中起關(guān)鍵作用[12]。有研究發(fā)現(xiàn)PGAM5可通過調(diào)控Keap1介導(dǎo)的Bcl-xL降解調(diào)控IRI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，這可能為治療急性心肌梗死提供了新靶點[13]。Remijsen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在急性炎癥性肝損傷中，受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）3可激活 PGAM5，調(diào)節(jié)動力相 關(guān) 蛋 白（dynamin-related protein，DRP）1和 活化 T 細(xì) 胞 核 因 子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）去磷酸化，促進(jìn)促炎因子產(chǎn)生，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，IRI小鼠血清TNF-α、IL-1β水平升高，肝組織IL-1β mRNA相對表達(dá)量升高。有研究表明，在肝臟IRI中，PGAM5和促炎因子均參與了肝細(xì)胞損傷，促炎因子與細(xì)胞焦亡密切相關(guān)[15]。PGAM5是否可以調(diào)控細(xì)胞焦亡參與肝臟IRI？筆者未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。

細(xì)胞焦亡作為一種程序性細(xì)胞死亡方式，廣泛參與組織損傷與修復(fù)、腫瘤、感染等疾病的發(fā)生發(fā)展[16-21]。最近的研究表明，移植腎IRI可導(dǎo)致肝細(xì)胞焦亡而引起急性肝損傷，而血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 可 逆 轉(zhuǎn)肝細(xì)胞焦亡，減輕肝損傷[22]。二十二碳六烯酸（docosa hexaenoic acid，DHA）通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路下調(diào)細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1表達(dá)，減少促炎因子分泌，從而減輕肝臟IRI[23]。El-Sisi等[24]發(fā)現(xiàn)奧曲肽可下調(diào)Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/MyD88/核因子（nuclear factor，NF）-κB/NLRP3通路，抑制 TLR4/NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，減輕大鼠IRI。甘草酸苷可通過 高 遷 移 率 族 蛋 白 1（high mobility group box 1，HMGB1）依賴的GSDMD調(diào)控細(xì)胞焦亡以減輕肝臟IRI[25]。

細(xì)胞焦亡是由GSDMD調(diào)控的細(xì)胞炎性壞死，參與了多種疾病的病理生理過程[26]。Caspase-1能夠特異性地對GSDMD進(jìn)行切割，從而產(chǎn)生N-端及C-端蛋白，N-端蛋白片段具有打孔活性，能插入細(xì)胞膜形成孔洞，激活細(xì)胞焦亡[27-29]。本研究結(jié)果顯示，在肝臟IRI中，肝組織Caspase-1、PGAM5均表達(dá)升高，且隨著再灌注時間延長而增多。為驗證Caspase-1對細(xì)胞焦亡的影響，本文采用Caspase-1抑制劑預(yù)處理AML12細(xì)胞，再經(jīng)IRI處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞 NLRP3、cleaved Caspase-1及 GSDMD 蛋白相對表達(dá)量明顯下降，GSDMD熒光強(qiáng)度減弱，表明抑制Caspase-1活性可減少肝細(xì)胞焦亡指標(biāo)NLRP3、cleaved Caspase-1及GSDMD表達(dá)水平，從而抑制肝細(xì)胞焦亡。有研究發(fā)現(xiàn)，PGAM5對NLRP3和黑素瘤缺乏因子 2（absent in melanoma 2，AIM2） 炎癥小體激動劑IL-1的分泌至關(guān)重要，是一種新的炎癥小體和Caspase-1活性調(diào)節(jié)因子[30]。在肝臟IRI過程中，PGAM5是否可以通過調(diào)節(jié)NLRP3、Caspase-1及GSDMD表達(dá)水平調(diào)控細(xì)胞焦亡參與肝細(xì)胞損傷？本研究結(jié)果顯示，下調(diào)AML12細(xì)胞PGAM5表達(dá)水平后，細(xì)胞內(nèi) PGAM5、NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD蛋白相對表達(dá)量下降，細(xì)胞焦亡水平下降。

綜上所述，PGAM5/Caspase-1/GSDMD信號通路通過調(diào)控細(xì)胞焦亡在肝臟IRI中發(fā)揮重要作用，對研究保護(hù)缺血的肝細(xì)胞及減少移植供肝IRI的發(fā)生提供新思路。