黃亞冰 郭暉 官陽 鐘偉雄

隨著臨床器官移植的發(fā)展，移植病理學(xué)也在不斷發(fā)展和深入。其中，Banff移植病理學(xué)會議（Banff會議）的召開及Banff移植病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)（Banff標(biāo)準(zhǔn)）的建立是國際移植病理學(xué)發(fā)展的重要里程碑。自此之后，移植腎穿刺活組織檢查（活檢）標(biāo)本的合格標(biāo)準(zhǔn)及其染色的基本要求，移植腎并發(fā)癥的基本病理學(xué)類型，排斥反應(yīng)的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)、病變分級及相應(yīng)的組織病理學(xué)評分不斷發(fā)展和完善，為國際范圍內(nèi)的移植腎活檢病理學(xué)診斷提供了統(tǒng)一的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且引領(lǐng)了移植病理學(xué)相關(guān)的基礎(chǔ)研究[1]。與此同時，隨著對移植腎并發(fā)癥診斷研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識到，與腎臟病的臨床診斷相似，移植腎并發(fā)癥診斷不僅需要組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平的光學(xué)顯微鏡（光鏡）觀察和免疫熒光等特殊染色，也同樣需要亞細(xì)胞水平的超微病理學(xué)診斷。因此，電子顯微鏡（電鏡）在移植腎活檢病理學(xué)診斷中的作用日益得到重視，事實也證明電鏡在移植腎的并發(fā)癥尤其是抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（antibody-mediated rejection，AMR）、特定腎小球病等的診斷和鑒別診斷中可以發(fā)揮不可缺少的獨(dú)特作用[2-5]。

1 電子顯微鏡及其超微病理診斷的基本定義

1.1 電子顯微鏡的定義

1.2 超微病理學(xué)的基本定義

細(xì)胞是組成人體組織結(jié)構(gòu)和發(fā)揮正常生理功能的基本結(jié)構(gòu)單位，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的異常則是導(dǎo)致人體各種疾病的前提條件，由此借助顯微鏡對細(xì)胞及其特定組織結(jié)構(gòu)予以觀察，成為診斷各種疾病的主要手段，主要包括組織病理學(xué)（histopathology）或細(xì)胞病理學(xué)（cytopathology）。而進(jìn)一步導(dǎo)致組織和細(xì)胞形態(tài)學(xué)及其功能異常的病理生理學(xué)機(jī)制中，細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)即多種細(xì)胞器在不同致病因素的損傷下的改變，則是更為重要的、根本性的機(jī)制之一。因此借助電鏡這一分辨能力更高的設(shè)備，對細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞基質(zhì)以及細(xì)胞內(nèi)包含物和細(xì)胞外沉積物等進(jìn)行精細(xì)的觀察，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中對多種疾病進(jìn)行明確診斷和鑒別的重要途經(jīng)。籍此，超微病理學(xué)（ultrastructural pathology）的基本定義為借助電鏡的高分辨能力，觀察在不同疾病狀態(tài)下亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變以及細(xì)胞內(nèi)、外異常物質(zhì)的產(chǎn)生與沉積，從而協(xié)助對人體各個系統(tǒng)的疾病予以明確診斷和鑒別診斷。而在移植腎活檢的病理診斷中，主要可以協(xié)助對移植腎的復(fù)發(fā)性疾?。╮ecurrent disease）、新發(fā)性疾?。╠e novo disease）予以診斷，近年來研究和臨床診斷日益明確，在移植腎AMR的早期發(fā)現(xiàn)和明確診斷中，電鏡可以發(fā)揮獨(dú)特的診斷作用。借助電鏡對移植腎腎小球毛細(xì)血管袢內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和腎小管周毛細(xì)血管基膜等特定部位的精細(xì)觀察，并與臨床移植術(shù)后供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA）檢測和活檢組織內(nèi)補(bǔ)體片段C4d的免疫組織化學(xué)染色相結(jié)合，可以進(jìn)一步對急性或慢性活動性AMR予以早期發(fā)現(xiàn)和明確診斷，更好地指導(dǎo)臨床予以針對性治療，保障移植腎的長期存活。

2 Banff移植腎病理電鏡診斷的研究歷程及其主要進(jìn)展

從1993年移植腎Banff標(biāo)準(zhǔn)的首次建立到2019年Banff會議的召開，各類移植器官病理學(xué)診斷的Banff標(biāo)準(zhǔn)得以不斷的更新和完善[8]。部分研究觀察到在AMR的腎活檢中，腎小球炎癥細(xì)胞的浸潤常伴有內(nèi)皮細(xì)胞的增大，造成毛細(xì)血管管腔的狹窄或完全阻塞，并確定這是一種內(nèi)皮細(xì)胞損傷和激活的表現(xiàn)，建議把這些特征作為診斷活動性AMR的形態(tài)學(xué)指標(biāo)[9-11]。通過電鏡的超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生AMR 時腎小球出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞腫脹和內(nèi)皮下間隙增寬，這些改變與后期發(fā)生慢性AMR造成的腎小球基底膜雙軌征形成相關(guān)，因此，這種改變被認(rèn)為是慢性AMR的最早期表現(xiàn)，這些超微病理學(xué)特征可以提示臨床疾病處于進(jìn)展階段并指導(dǎo)臨床給予積極的干預(yù)措施[12-14]。

2013年Banff會議首次將活檢組織的分子檢測作為一項診斷AMR的依據(jù)[15]，但當(dāng)時只有極少數(shù)醫(yī)療中心具備檢測條件，并且研究結(jié)果僅僅來自于個別研究中心。既往移植腎的慢性腎小球病變評分主要依靠光鏡診斷，此次會議首次明確提出了電鏡觀察的重要性，并且提倡有條件的移植中心采用電鏡對光鏡無法確認(rèn)的早期移植腎腎小球?。╰ransplant glomerulopathy，TG）進(jìn)行診斷。

2013年Banff會議將移植腎的慢性（chronic，c）腎小球（glomerular，g）病變中cg1分為兩個亞型，即cg1a和cg1b。cg1a的形態(tài)學(xué)改變是：光鏡下無基底膜雙軌征的改變，但電鏡下觀察到≥3個腎小球毛細(xì)血管基底膜出現(xiàn)部分或整周的雙軌征，并伴有相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞腫脹和（或）內(nèi)皮下間隙增寬；cg1b的形態(tài)學(xué)改變是：在光鏡下有≥1個腎小球毛細(xì)血管基底膜出現(xiàn)雙軌征，可以發(fā)生在1個或多個非硬化的腎小球，如果有條件，建議用電鏡證實；cg 2和cg 3評分標(biāo)準(zhǔn)維持不變。會議同時更新了腎小球毛細(xì)血管基底膜雙軌征的診斷標(biāo)準(zhǔn)：把光鏡下腎小球基底膜雙軌征從至少涉及10%的毛細(xì)血管袢更新為僅單個毛細(xì)血管袢出現(xiàn)雙軌征即可建立診斷。既往cg評分主要依靠光鏡下的診斷，2013年Banff會議強(qiáng)調(diào)了電鏡觀察的重要性，并且建議在條件許可的情況下，將電鏡檢查納入常規(guī)移植腎活檢病理診斷，尤其是DSA陽性的受者，應(yīng)在腎移植術(shù)后3個月或6個月行移植腎活檢，以便早期診斷TG并及時給予適當(dāng)?shù)闹委煛?/p>

TG受者的腎小管周毛細(xì)血管也可以發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞活化和基膜損傷。Monga等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，由于腎小管周毛細(xì)血管的變化往往與TG同時存在，依據(jù)腎小管周毛細(xì)血管基膜的多層化可以推斷TG的存在或潛在可能性。但也有許多學(xué)者認(rèn)為，腎小管周毛細(xì)血管基膜多層（peritubular capillary basement membrane multilayering，PTCML）并不完全是 AMR的特異性改變，有報道稱感染后腎小球腎炎、狼瘡性腎炎、環(huán)孢素腎毒性和尿路梗阻性疾病同樣會出現(xiàn)PTCML[18-19]。2013年Banff會議明確了需要通過電鏡觀察PTCML以診斷慢性AMR。PTCML的診斷標(biāo)準(zhǔn)是：要求1個腎小管周毛細(xì)血管基膜層數(shù)≥7層以及2個腎小管周毛細(xì)血管基膜層數(shù)≥5層，同時應(yīng)避免在斜切面處計算層數(shù)。當(dāng)電鏡檢測時只觀察到1個腎小管周毛細(xì)血管基膜層數(shù)達(dá)到7層時，則還需要2個達(dá)到5層的腎小管周毛細(xì)血管才能診斷，這是診斷PTCML的最低標(biāo)準(zhǔn)。但如果觀察到多個腎小管周毛細(xì)血管基膜有7層，則不需要另外2個達(dá)到5層的腎小管周毛細(xì)血管。

2015年Banff 會議將分子病理學(xué)診斷引入到AMR的診斷中，同時成立了 4個新的Banff工作組，其中就包括電鏡Banff工作組。與2013年Banff 標(biāo)準(zhǔn)相比，cg1b的診斷標(biāo)準(zhǔn)做了一些細(xì)微調(diào)整。在此次會議中cg1b的形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)是：光鏡下受累最嚴(yán)重的非硬化腎小球有1%～25%的毛細(xì)血管袢出現(xiàn)基底膜雙軌征，建議電鏡證實[20]。

在2019年Banff會議上，電鏡工作組制定了組織取樣及電鏡分析cg1a和PTCML的詳盡指南[21-26]，建議所有的活檢組織盡可能進(jìn)行電鏡取材和包埋制片，特別是懷疑存在腎小球疾病的活檢組織。電鏡工作組建議對懷疑存在腎小球疾病或其他需要電鏡協(xié)助診斷的疾病以及存在AMR風(fēng)險的受者的移植腎活檢標(biāo)本均應(yīng)進(jìn)行超微病理觀察及診斷。

3 電鏡Banff工作組對移植腎活檢中電鏡診斷的建議

3.1 移植腎活檢電鏡標(biāo)本的取材

（1）如果條件允許，建議所有的移植腎活檢組織都做電鏡取材、固定和樹脂包埋，特別是懷疑存在腎小球疾病的活檢標(biāo)本；（2）雖然采用石蠟切片或冷凍切片免疫熒光染色可以檢測電子致密物沉積，以及評估一定程度的足突融合，但不推薦用此類標(biāo)本檢測腎小球基底膜厚度、cg1a或PTCML；（3）在所有情況下，均推薦首先進(jìn)行半薄切片染色及光鏡檢查[10]。

3.2 超微病理診斷

推薦以下情況進(jìn)行超微病理診斷：（1）臨床、光鏡和（或）免疫組織化學(xué)染色懷疑存在且電鏡可協(xié)助診斷的腎小球疾病或其他疾??；（2）有AMR風(fēng)險的受者，高致敏受者、移植術(shù)后任何時間出現(xiàn)DSA陽性和（或）既往活檢顯示有AMR特征的受者[C4d染色陽性，腎小球炎和（或）腎小管周毛細(xì)血管炎 ][10]。

3.3 電鏡檢查

電鏡檢查還可用于：（1）檢測經(jīng)活檢證實的造成自體腎衰竭的腎小球疾病的早期復(fù)發(fā)；（2）在移植術(shù)后3個月及以上的指征性活檢和移植術(shù)后6個月及以上的活檢標(biāo)本中，確定是否存在TG的早期變化（cg1a）并早期檢測DSA；（3）類似自體原發(fā)性腎病的腎活檢，對所有病例均應(yīng)進(jìn)行腎小球疾病的評估[10]。

3.4 對可能存在AMR的活檢標(biāo)本的評估

對于可能存在AMR的活檢標(biāo)本的評估，按照以下建議評估cg1a和PTCML[10]。

3.4.1 電鏡包埋塊及切片制備的建議 選擇非壞死皮質(zhì)區(qū)，優(yōu)先觀察腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化較少的部位，至少觀察1個完整的腎小球，但建議觀察的腎小球數(shù)目≥2個；至少保留10個腎小管周毛細(xì)血管，為此，應(yīng)適當(dāng)保留電鏡樹脂包埋組織塊腎小球周圍的部分組織，避免僅保留腎小球結(jié)構(gòu)而切削成在頂端僅含有腎小球結(jié)構(gòu)的“錐形”或“金字塔形”。

3.4.2 cg1a的超微病理診斷和報告指南 （1）除外整體或部分硬化的腎小球和嚴(yán)重缺血的腎小球；（2）至少檢查1個完整的腎小球，如果條件允許可以檢查2個及以上的腎小球；（3）在高倍視野（≥5 000倍）下檢查毛細(xì)血管袢。

cg1a定義為：光鏡下無腎小球基底膜雙軌征；電鏡下單個腎小球3個以上毛細(xì)血管袢顯示內(nèi)皮下新基底膜形成（整周或部分，單層或多層）以及內(nèi)皮細(xì)胞增大和（或）內(nèi)皮下間隙增寬。報告應(yīng)說明檢查了多少腎小球以及多少個毛細(xì)血管袢顯示cg1a。

3.4.3 PTCML 的超微結(jié)構(gòu)評估和報告指南 （1）評估腎小球皮質(zhì)的腎小管周毛細(xì)血管的PTCML；（2）除外疤痕皮質(zhì)、壞死和出血區(qū)域；（3）高倍視野（≥5 000倍）下檢查至少10個腎小管周毛細(xì)血管，計數(shù)3個最嚴(yán)重的腎小管周毛細(xì)血管基膜層數(shù)及其層數(shù)最多的節(jié)段（沿血管周最嚴(yán)重的區(qū)域）。報告應(yīng)說明檢查的腎小管周毛細(xì)血管的數(shù)量，受影響最嚴(yán)重的腎小管周毛細(xì)血管的基膜層數(shù)，以及是否達(dá)到2013年Banff標(biāo)準(zhǔn)中對慢性AMR的判定閾值（ptcml1：1個腎小管周毛細(xì)血管基膜層數(shù)≥7層以及2個腎小管周毛細(xì)血管基膜層數(shù) ≥5層）。

4 Banff移植腎電鏡診斷的基本術(shù)語及其病變特征

對光鏡和電鏡下觀察到的獨(dú)立的腎小球病變，電鏡工作組建議盡可能使用與腎臟病理工作組形成共識的特定術(shù)語，例如在代表移植腎早期病變 （cg1a）中運(yùn)用下列這些特定術(shù)語：內(nèi)皮細(xì)胞增大（圖1A），內(nèi)皮下間隙增寬（圖1B），腎小球內(nèi)皮下新生致密基底膜（圖1C）。

4.1 內(nèi)皮細(xì)胞增大及其定義

內(nèi)皮細(xì)胞增大定義為腎小球內(nèi)皮細(xì)胞胞體增大（圖1A）伴有胞質(zhì)增加、毛細(xì)血管管腔面積減少和窗孔消失。不應(yīng)使用“內(nèi)皮細(xì)胞腫脹”、“反應(yīng)性內(nèi)皮改變”、“內(nèi)皮激活”、“內(nèi)皮損傷”或“內(nèi)皮細(xì)胞變性”等不準(zhǔn)確或不正確的術(shù)語。

4.2 內(nèi)皮下間隙增寬及其定義

內(nèi)皮下間隙增寬定義為低電子密度的物質(zhì)使腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球基底膜致密層之間的間隙擴(kuò)大（圖1B），不應(yīng)使用“內(nèi)疏松層增寬”或“內(nèi)皮下疏松”等術(shù)語。

4.3 腎小球內(nèi)皮下新生致密基底膜及其定義

腎小球內(nèi)皮下新生致密基底膜定義為與原腎小球基底膜明顯不同的環(huán)狀或不連續(xù)的單層或多層基底膜（圖1C）。

4.4 其 他

因為目前支持的資料很少，其他有關(guān)腎小球和腎小管周毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞和基膜的特征暫由病理學(xué)家在報告中自行描述。基于電鏡Banff工作組的共識，推薦將“腎小管周毛細(xì)血管基膜多層”這一專有名詞的英文縮寫由PTCBMML簡化為PTCML。（圖1D）。

圖1 移植腎特征性病變的電鏡表現(xiàn)Figure 1 Electron microscopic findings of characteristic lesions of renal allograft

光鏡、免疫病理聯(lián)合電鏡觀察，可以為移植腎的病理診斷提供更為全面的形態(tài)學(xué)依據(jù)，在AMR的病理學(xué)診斷中，電鏡可以更早發(fā)現(xiàn)和診斷光鏡無法識別的早期TG，可以指導(dǎo)臨床及時進(jìn)行早期的干預(yù)治療，從而更好地保障移植腎的長期存活[27-28]。

5 小 結(jié)

電鏡觀察與診斷已經(jīng)是移植腎活檢組織病理學(xué)診斷中不可缺少的有機(jī)組成部分。電鏡的高分辨能力可以更早發(fā)現(xiàn)和診斷移植腎的AMR損傷，同時對移植腎的復(fù)發(fā)性疾病和新發(fā)性疾病的診斷和鑒別也能發(fā)揮獨(dú)特的作用。籍此，2013年Banff會議及隨后的歷屆會議及其Banff診斷標(biāo)準(zhǔn)中均推薦對移植腎活檢組織在光鏡、免疫病理（免疫熒光）觀察的同時，也必須予以電鏡診斷，因而能更早、更準(zhǔn)確地對移植腎并發(fā)癥予以診斷和針對性治療，更好地保障移植腎和受者的長期存活。