陳明權(quán)， 商雪瑩， 張懷， 何風(fēng)雷， 覃仁安

（廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司，廣東廣州 510288）

2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]規(guī)定陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種（如茶枝柑Citrus reticulate‘Chachi’等）的成熟果皮，主要有陳皮、廣陳皮2個(gè)品種，其中，廣陳皮（Citrus reticulate‘Chachi’）主產(chǎn)于廣東新會(huì)，新會(huì)陳皮最為道地[2]。中醫(yī)藥理論及歷代本草論述[3]中均認(rèn)為陳皮“陳久者良”，是指陳皮需放置陳化后才能作為藥用，且陳化時(shí)間越久的陳皮藥效越好。廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)《DB44/T 604-2009地理標(biāo)志產(chǎn)品新會(huì)陳皮》定義“陳皮”為在自然陳化環(huán)境下保存時(shí)間3年或以上的茶枝柑皮[4]。

目前的陳皮市場(chǎng)中，對(duì)于高年份陳皮的追捧一直熱度不減，且陳化年份對(duì)陳皮的價(jià)格具有決定性的影響，不良商販為了追求高利潤(rùn)采用各種“加速陳化工藝”對(duì)新皮進(jìn)行加速處理，例如將新皮放入電烤箱、灑水濕悶或煮茶染色，以使新皮表皮顏色快速變深用以冒充高年份的陳皮售賣，也導(dǎo)致了“虛假陳化年份”的市場(chǎng)亂象。而對(duì)于陳皮年份的鑒定，國(guó)家沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，基本靠陳皮廠商自律和采購(gòu)者的經(jīng)驗(yàn)鑒別，“工藝皮”極大地混淆了陳皮市場(chǎng)。因此，建立鑒別自然陳化陳皮和人工加速陳化陳皮的方法對(duì)于維護(hù)陳皮市場(chǎng)的良好生態(tài)顯得尤為重要。

一方面，色澤是鑒定藥材最直觀的方式，也是陳皮陳化年份的重要判別標(biāo)志，但是通過肉眼區(qū)分色澤的方法缺乏客觀性，且不能進(jìn)行有效推廣。鑒于此，本試驗(yàn)引入色差分析儀[5]對(duì)藥材的色澤進(jìn)行數(shù)據(jù)量化，可以對(duì)外觀色澤有更加客觀的表述。另一方面，大多數(shù)中藥在炮制或者儲(chǔ)存過程中，其色澤均有加深的跡象，絕大多數(shù)含有氨基酸及糖類成分的中藥，在加熱的條件下，會(huì)加速M(fèi)aillard反應(yīng)[6]的進(jìn)行。Maillard反應(yīng)又稱為非酶褐變反應(yīng)，是指羰基化合物（主要為還原糖類）與氨基化合物（如氨基酸、蛋白質(zhì)等）之間發(fā)生的反應(yīng)。反應(yīng)生成多種產(chǎn)物，5-羥甲基糠醛是Maillard反應(yīng)的經(jīng)典產(chǎn)物?，F(xiàn)代研究[7-10]表明百部、五味子、天冬、大棗等中藥材在儲(chǔ)藏過程中色澤加深均與5-羥甲基糠醛有直接的相關(guān)性，且何首烏[11]、山茱萸[12]、白術(shù)[13]在炮制后均產(chǎn)生了5-羥甲基糠醛，說明經(jīng)過高溫處理中藥材的5-羥甲基糠醛含量會(huì)增加，同時(shí)藥材色澤也會(huì)加深。

本研究以不同來源、不同陳化年份的多批次新會(huì)陳皮為研究對(duì)象，先建立測(cè)定內(nèi)在指標(biāo)5-羥甲基糠醛含量的高效液相色譜（HPLC）儀與QDa質(zhì)譜儀聯(lián)用方法，通過比較不同來源樣品中5-羥甲基糠醛的含量，以制定能有效判別“高溫加速陳化陳皮”的指標(biāo)限度。再利用色差儀對(duì)判別為“非高溫加速陳化陳皮”樣品的外觀色澤進(jìn)行客觀數(shù)據(jù)量化。同樣，通過比較不同來源樣品中總色差值ΔE的大小，以制定能有效判別“煮茶染色加速陳皮”的指標(biāo)限度。最終根據(jù)5-羥甲基糠醛與ΔE的限度范圍，建立一種可靠、客觀的陳皮陳化方式的判別方法。同時(shí)，本研究可為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的完善提供一種新的思路與方法。

1 材料

1.1 儀器NH310型三恩馳便攜式電腦色差儀（深圳市三恩馳科技有限公司）；Waters ACQUITY Arc-QDa高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀及Empower 3軟件處理器，X Select?HSS T3色譜柱（2.5μm，3.0×150 mm）（美國(guó)沃特世公司）；XPR 26/A百萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Sartorius BS110S萬分之一電子天平、TGL-15B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q Reference純水機(jī)（法國(guó)Millipore公司）；SB-5200 DT超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；WXJ型粉碎機(jī)（上海凱旋中藥機(jī)械制造有限公司）。

1.2 試劑5-羥甲基糠醛對(duì)照品（純度≥98%，中國(guó)廣州分析測(cè)試中心科力技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品，批號(hào)：19060403）；色譜級(jí)甲醇（德國(guó)Merck公司）；超純水、色譜級(jí)甲酸（純度>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)樣品本研究的49個(gè)試驗(yàn)樣品，分別為定向采購(gòu)樣品（編號(hào)：D1~D15），市售樣品（編號(hào)：S16~S26），新會(huì)產(chǎn)區(qū)購(gòu)置樣品（編號(hào)：C27~C30），基地采集自然陳化至今的樣品（編號(hào)：J31~J41、J45），以及自制加速陳化陳皮樣品（編號(hào)：W42~W44、W46~W48，R49），其中自制加速陳化陳皮樣品的處理方式：（1）將2007年11月采集的大紅皮（J41，自然陳化）分別制成不同的自制加速陳化樣品：①高溫110℃、高濕加速陳化（W42）；②高溫130℃加速陳化30 min（W43）；③高溫150℃加速陳化30 min（W44）。（2）將2007年10月采集的青皮（J45，自然陳化）制成不同的自制加速陳化樣品：①高溫110℃、高濕加速陳化（W46）；②高溫130℃加速陳化30 min（W47）；③高溫150℃加速陳化30 min（W48）。（3）將2003年當(dāng)年新皮用煮開的普洱茶水浸泡染色并晾干，自制成煮茶染色加速樣品（R49）。

以上樣品均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定為蕓香科植物茶枝柑Citrus reticulate‘Chachi’的果皮。樣品具體信息見表1。

表1 新會(huì)陳皮樣品信息表Table 1 Information of Xinhui Pericarpium CitriReticulatae samples

（續(xù)表1）

2 方法與結(jié)果

2.15-羥甲基糠醛含量測(cè)定

2.1.1 HPLC及質(zhì)譜條件 HPLC色譜條件：Waters X Select?HSS T3色譜柱（2.5μm，3.0 mm×150 mm）；以甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序：2%~8%甲醇（0~12 min），8%~10%甲醇（12~20 min）；流速0.5 mL·min-1；柱溫35℃；進(jìn)樣量：1μL。

質(zhì)譜條件：采用負(fù)離子模式。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：采用電噴霧離子源（ESI源），離子源溫度（Probe）為600℃；正離子檢測(cè)，選擇性離子監(jiān)測(cè)（SIM）；毛細(xì)管電壓0.8 kV，錐孔電壓15 V，以質(zhì)荷比（m/z）127.04為測(cè)定離子（5-羥甲基糠醛）。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品5-羥甲基糠醛20 mg，置于100 mL容量瓶中，加入10%甲醇充分溶解并稀釋至刻度線作為儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中。

2.1.3 供試品溶液的制備 取陳皮樣品粉末0.5 g（過65目篩），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 10%甲醇，稱質(zhì)量，超聲處理45 min（功率300 W，頻率40 kHz）；放冷后稱質(zhì)量，用10%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量；離心10 min（10 000 r·min-1，離心半徑3.5 cm），取上清，過0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 專屬性考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和溶劑（10%甲醇，空白樣品）各1μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。樣品色譜圖與對(duì)照品色譜圖峰保留時(shí)間一致，且溶劑無干擾。色譜及質(zhì)譜圖分別見圖1、2。樣品色譜圖中出現(xiàn)與對(duì)照品色譜圖中保留時(shí)間（RT）一致的色譜峰（RT=10.11 min），無陳皮的陰性樣品對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 陳皮樣品、對(duì)照品及空白樣品離子通道色譜圖（m/z 127.04）Figure 1 Comparison of TIC chromatogram of Pericarpium CitriReticulatae samples，reference substances，and blank samples（m/z 127.04）

圖2 5-羥甲基糠醛質(zhì)譜圖Figure 2 Spectrum chromatogram of 5-hydroxymethylfurfura

2.1.5 線性關(guān)系考察 取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液依次稀釋并制成6個(gè)質(zhì)量濃度分別為25.00、6.26、1.56、0.39、0.09、0.04μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品濃度X（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得5-羥甲基糠醛回歸方程為Y=6.92×105X+4.60×105（r=0.999 8）。結(jié)果表明，5-羥甲基糠醛的進(jìn)樣濃度在0.04~25.00μg·mL-1之間與峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液1μL，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得5-羥甲基糠醛的峰面積積分值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，5-羥甲基糠醛的RSD值為2.15%，表明儀器的精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一供試樣品（J31）6份，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)得5-羥甲基糠醛含量分別為0.023、0.024、0.023、0.025、0.021、0.024μg·g-1，計(jì)算RSD，結(jié)果顯示，其RSD值為4.60%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得5-羥甲基糠醛的RSD值為3.11%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率 取已測(cè)定的陳皮樣品（D5）粉末0.50 g，精密稱定9份，分為3組，每組3份；分別加入5-羥甲基糠醛的0.5、1、1.5倍量對(duì)照品，按照上述供試品制備方法及色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)其峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，5-羥甲基糠醛平均回收率為96.30%，RSD值為2.77%（n=6）。結(jié)果見表2。

表2 5-羥甲基糠醛加樣回收結(jié)果Table 2 Sample recovery results of 5-hydroxymethylfurfura

2.1.10 含量測(cè)定 取不同來源陳皮樣品，分別按照“2.1.3”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下條件測(cè)定含量，結(jié)果見表3、圖3。

從表3可知，不同來源陳皮的5-羥甲基糠醛含量存在明顯差異。自然陳化樣品（D、C、J）中的5-羥甲基糠醛含量介于0.003~0.213 mg·g-1之間，自制的高溫加速陳化樣品（W）的5-羥甲基糠醛含量（0.434~7.516 mg·g-1）均大于0.25 mg·g-1；而煮茶染色加速樣品（R49）的5-羥甲基糠醛含量?jī)H為0.022 mg·g-1，遠(yuǎn)低于高溫加速陳化樣品的。同時(shí)還可以發(fā)現(xiàn)，4個(gè)不同陳皮專營(yíng)店購(gòu)買的市售樣品（S）之間的5-羥甲基糠醛含量差異也較明顯，其中除了從“陳皮專營(yíng)店3”購(gòu)買的樣品（S22~S24）的5-羥甲基糠醛含量小于0.25 mg·g-1，其他市售樣品的含量均大于0.25 mg·g-1，特別是從“陳皮專營(yíng)店2”購(gòu)買的市售樣品（S18~S21）中5-羥甲基糠醛含量（0.257~1.133 mg·g-1），與自制的高溫加速陳化樣品（W）的含量范圍存在交集，說明市售樣品（S18~S21）可能經(jīng)過高溫加速處理。據(jù)此類推，市售樣品（S16~S17，S25~S26）也可能是經(jīng)過高溫加速處理的。

表3 不同來源陳皮中5-羥甲基糠醛含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Results for the determination of 5-hydroxymethylfurfura content （n=2，mg·g-1）

結(jié)合圖3可知，當(dāng)5-羥甲基糠醛含量≥0.25 mg·g-1時(shí)，可以將高溫加速處理樣品與其他樣品區(qū)分開來。一方面，從“陳皮專營(yíng)店3”購(gòu)買的市售樣品（S22~S24）中的5-羥甲基糠醛含量范圍為0.014~0.114 mg·g-1，根據(jù)判別指標(biāo)5-羥甲基糠醛僅可推測(cè)市售樣品（S22~S24）未經(jīng)過高溫加速處理；另一方面，煮茶染色加速樣品（R49）的5-羥甲基糠醛含量（0.022 mg·g-1）在自然陳化樣品（D、C、J）5-羥甲基糠醛含量（0.003~0.213 mg·g-1）范圍內(nèi)，表明判別指標(biāo)5-羥甲基糠醛無法將“煮茶染色加速樣品”鑒別出來。

圖3 49種陳皮樣品5-羥甲基糠醛含量散點(diǎn)圖Figure 3 Scatter plot of 5-hydroxymethylfurfura content in 49 Pericarpium CitriReticulatae samples

以上結(jié)果表明，僅憑判別指標(biāo)5-羥甲基糠醛含量及限度，可以有效判斷出“高溫加速陳化陳皮”，而不能將“煮茶染色加速陳皮”鑒別出來，需要結(jié)合外觀色差等其他指標(biāo)進(jìn)一步研究。

2.2 陳皮外觀色差測(cè)定

2.2.1 測(cè)定方法 采用國(guó)際照明委員會(huì)（CIE）認(rèn)可的D65光源（相當(dāng)于自然日光，6 504 K），并進(jìn)行黑白校正。陳皮樣品粉碎過65目篩，取約3.5 g，置于粉末測(cè)試盒（光距長(zhǎng)1.0 cm），壓實(shí)，測(cè)定樣品的色度值為L(zhǎng)*、a*、b*，按如下公式計(jì)算各樣品本身的總色度值ΔE[5]。

色度儀利用的是L*，a*，b*3個(gè)不同的坐標(biāo)軸，指示顏色在幾何坐標(biāo)圖中的位置及代號(hào)。a*和b*表示不同的色調(diào)方向。a*表示紅綠方向，+a*表示紅方向，-a*表示綠方向；b*表示黃藍(lán)方向，+b*表示黃方向，-b*表示藍(lán)方向；L*表示明度，L*越大亮度越高。以這3個(gè)數(shù)值計(jì)算的ΔE可以客觀地表示不同樣品的色澤能力，ΔE數(shù)值越大，其色澤越淺；反之，ΔE數(shù)值越小，其色澤越深。

2.2.2 測(cè)定結(jié)果 在陳皮樣品5-羥甲基糠醛含量測(cè)定結(jié)果的基礎(chǔ)上，針對(duì)除W、S16~S21，S25~S26等14個(gè)高溫加速處理樣品之外的35個(gè)陳皮樣品，采用色差儀測(cè)定其L*、a*、b*3個(gè)色度值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，并計(jì)算總色度值ΔE。結(jié)果見表4、圖4。

圖4 35個(gè)陳皮樣品總色度值ΔE散點(diǎn)圖Figure 4 Scatter plot of totalchromaticity valueΔE in 35 Pericarpium CitriReticulatae samples

從表4可以看出，不同來源的同一陳化年份樣品的總色度值ΔE存在明顯的差異。其中，自然陳化樣品（D、C、J）的色差值ΔE介于68.74~88.21之間，而市售樣品（S22~S24）的ΔE值范圍為61.87~67.04，煮茶染色加速樣品（R49）的ΔE值67.56；三者之間的ΔE值并不存在交集。

表4 新會(huì)陳皮樣品總色度值ΔE測(cè)定結(jié)果Table 4 Results for the determination of total chromatic valueΔE of Pericarpium Citri Reticulatae samples（n=2）

一方面，按照新會(huì)陳皮陳化年份越久，其外觀色澤越深、色差值ΔE越小的變化趨勢(shì)；而市售樣品（S22~S24）的陳化年份（17~30年）低于自然陳化樣品（C30）的陳化年份（39年），其總色度值ΔE（61.87~67.04）卻小于自然陳化樣品C30（68.74）的，這不符合新會(huì)陳皮自然陳化的變化規(guī)律，表明市售樣品（S22~S24）的陳化方式不是自然陳化。另一方面，市售樣品（S22~S24）的ΔE值也均小于煮茶染色加速樣品（R49）的。由此可以推測(cè)，市售樣品（S22~S24）可能也經(jīng)過煮茶染色處理。

結(jié)合圖4可知，當(dāng)總色度值ΔE≤68時(shí)，可以有效判斷出“煮茶染色加速陳皮”；而自然陳化的陳皮樣品總色度值ΔE＞68。

以上結(jié)果表明，在一定的陳化年份范圍內(nèi)，以總色度值ΔE作為判別指標(biāo)，可以有效判斷出“煮茶染色加速陳皮”。

3 討論

根據(jù)廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)《DB44/T 604-2009地理標(biāo)志產(chǎn)品新會(huì)陳皮》規(guī)定，陳皮烘干時(shí)最高溫度不超過45℃，且2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》中亦有規(guī)定陳皮應(yīng)曬干或低溫干燥而成。一方面，自然陳化的陳皮樣品不會(huì)經(jīng)過高溫處理，而人工加速陳化的陳皮一般會(huì)通過高溫、高濕處理，根據(jù)Maillard反應(yīng)的原理，高溫會(huì)導(dǎo)致其經(jīng)典產(chǎn)物5-羥甲基糠醛的含量顯著增加，因此，以5-羥甲基糠醛含量作為判別“高溫加速陳化陳皮”的指標(biāo)是科學(xué)的；另一方面，陳皮經(jīng)過煮茶染色處理后，其外觀色澤變黑，較同年份的自然陳化陳皮的色澤深，因此，以外觀色差值ΔE作為判別“煮茶染色加速陳皮”的指標(biāo)是可行的。

本研究以不同來源、不同陳化年份、不同處理方式等49批陳皮樣品為研究對(duì)象，首先根據(jù)陳皮高溫加速陳化會(huì)發(fā)生Maillard反應(yīng)的特點(diǎn)，建立了靈敏度高、重復(fù)性好的HPLC-QDa聯(lián)用測(cè)定5-羥甲基糠醛含量的方法，并制定了可以有效判別出“高溫加速陳化陳皮”的5-羥甲基糠醛含量限度（≥0.25 mg·g-1）。在此基礎(chǔ)上，引入色差分析儀對(duì)陳皮外觀色澤進(jìn)行客觀的數(shù)據(jù)量化，分析非高溫加速樣品的總色度值ΔE變化范圍，制定了可以有效判別出“煮茶染色加速陳皮”的ΔE值限度（≤68）。由此可見，先后通過指標(biāo)5-羥甲基糠醛含量、總色度值ΔE的綜合判斷，可以有效鑒別出陳皮的陳化方式。

本研究首次提出以雙指標(biāo)5-羥甲基糠醛含量、ΔE判斷陳皮的陳化方式，并規(guī)定其限度。該雙指標(biāo)可以同時(shí)監(jiān)控陳皮外觀色澤與含量限度，可以客觀、準(zhǔn)確地判定陳皮陳化方式，同時(shí)可以為傳統(tǒng)陳皮陳化年份鑒定提供規(guī)范化的評(píng)價(jià)方法，對(duì)維護(hù)陳皮市場(chǎng)穩(wěn)定、健康發(fā)展具有重要的意義。

與制備前的樣品（J41、J45）相比，自制的高溫加速陳化樣品中5-羥甲基糠醛含量會(huì)隨著處理溫度的升高而增加。經(jīng)110、130、150℃高溫加速后，大紅皮加速樣品（W42~W44）中5-羥甲基糠醛的含量由加速陳化前的0.091 mg·g-1分別增加至0.476、1.819、7.516 mg·g-1，而青皮（W46~W48）中5-羥甲基糠醛的含量由加速陳化前的0.133 mg·g-1分別增加至0.434、0.858、3.196 mg·g-1，其5-羥甲基糠醛含量變化程度較大紅皮的小。從側(cè)面可以反映出，在相同加速條件下，大紅皮發(fā)生Maillard反應(yīng)的程度較青皮的快。究其原因，可能是大紅皮中多糖類物質(zhì)較青皮多[14-15]，而Maillard反應(yīng)以糖類為反應(yīng)底物，以致大紅皮在高溫加速M(fèi)aillard反應(yīng)時(shí)得到的產(chǎn)物5-羥甲基糠醛比青皮的多，外觀色澤變得也較青皮的深。

以總色度值ΔE（≤68）作為判別指標(biāo)判別“煮茶染色加速陳皮”時(shí)，按照新會(huì)陳皮隨陳化年份越久，各相近年份陳皮之間的外觀色差值變化越小的規(guī)律，可以推測(cè)，該值的指標(biāo)限度也應(yīng)該適用于50年以內(nèi)的自然陳化陳皮。但該推斷是否可行，還有待以40~50年的自然陳化陳皮樣品作進(jìn)一步驗(yàn)證。