黃 晗，唐源英，陳祉瀟，李偉英,2，周 為,2,*

(1.同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092；2.長江水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室<同濟(jì)大學(xué)>，上海 200092)

飲用水的安全對(duì)人體的健康十分重要，不安全的飲用水可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的急性或慢性的水傳播疾病[1]，對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。研究表明，飲用水中存在的微生(如病原微生物)可能會(huì)導(dǎo)致介水疾病的傳播[1-4]。因此，飲用水水質(zhì)微生物安全的研究具有重要意義。

傳統(tǒng)的細(xì)菌分類標(biāo)準(zhǔn)基于細(xì)菌的形態(tài)和生理特性，在進(jìn)行鑒定時(shí)需對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)后再從形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和生理生化特性等方面進(jìn)行分類，但該方法的細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間較長、靈敏度較低以及鑒定的特異性不足，且無法檢測水中活的但不可培養(yǎng)的細(xì)菌(viable but non-culturable bacteria, VBNC)[5-7]。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以16S rRNA為代表的基因測序技術(shù)逐漸被應(yīng)用于飲用水微生物多樣性的研究。本文將基于16S rRNA基因的特點(diǎn)、分析技術(shù)及其基本原理的發(fā)展進(jìn)程，從水源水質(zhì)、水處理工藝以及供水管網(wǎng)特性等方面探討其對(duì)末梢水中微生物多樣性的影響，總結(jié)了飲用水全流程對(duì)末梢水微生物多樣性影響的特點(diǎn)，為建立水質(zhì)與微生物多樣性的關(guān)系提供參考依據(jù)，為其在飲用水中微生物檢測的廣泛應(yīng)用提供支撐，最后對(duì)該技術(shù)在飲用水微生物多樣性研究的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 16S rRNA基因測序技術(shù)的發(fā)展歷程

基因測序技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程集中于近50年(圖1)?；谟蒘anger和Coulson開創(chuàng)的鏈終止法以及1976年—1977年Maxam和Gibert提出的DNA測序的化學(xué)降解法，Sanger于1977年完成了噬菌體ΦⅩ174全基因組測序，發(fā)明了雙脫氧鏈終止法，即第一代測序(first-generation sequencing)方法。第一代測序的主要特點(diǎn)是測序讀長可達(dá)1 000 bp，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，然而，其存在測序成本高、通量低等方面的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用[8-10]。2005年，經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進(jìn)，產(chǎn)生了以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)志的第二代測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)。與第一代Sanger測序相比，第二代具有通量高[11]、測序快等優(yōu)勢，大幅降低了測序成本，擴(kuò)大了基因組學(xué)研究的規(guī)模[12]。然而，第二代測序技術(shù)仍然存在讀長較短、價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)。2008年之后，PacBio公司的單分子實(shí)時(shí)(single molecule real time, SMRT)測序技術(shù)和Helicos Biosciences公司的Heliscope遺傳分析系統(tǒng)即第三代測序技術(shù)被相繼發(fā)明。與前兩代相比，其最大的特點(diǎn)就是讀長較長、成本較低、速度快、無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但仍然存在準(zhǔn)確性不高的缺點(diǎn)，目前未能在飲用水配水流程的微生物多樣性研究中較為廣泛地應(yīng)用。第四代測序技術(shù)以O(shè)xford Nanopore Technologies公司的納米孔測序技術(shù)為代表。四代測序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及部分平臺(tái)如表1與表2所示。

表1 16S rRNA測序技術(shù)

圖1 測序技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程

表2中的測序平臺(tái)和測序儀器均來自國外的生物公司，目前，在我國的飲用水微生物多樣性分析領(lǐng)域，依然主要使用這些設(shè)備和相應(yīng)的技術(shù)。在基因測序設(shè)備幾乎被國外壟斷的局面下，我國也在通過自主研發(fā)、聯(lián)合研發(fā)以及收購國外公司的方式發(fā)展本國的基因測序設(shè)備[27]，如華因康開發(fā)的基因測序儀HYK-PSTAR-IIA、中科紫鑫的測序儀BIGIS-4等。在基因測序設(shè)備研發(fā)上我國已取得一些成效，部分儀器在一些測序結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性上可以與國外儀器相當(dāng)[28]。但是目前基于國內(nèi)設(shè)備和技術(shù)的研究較少，其在飲用水微生物中的應(yīng)用也較少，暫時(shí)無法進(jìn)行更全面的分析。

表2 16S rRNA部分測序平臺(tái)

2 16S rRNA基因測序在飲用水中的應(yīng)用

2.1 16S rRNA在水源微生物多樣性的研究應(yīng)用

地表淡水(如湖泊、河流等)中的飲用水水源隨著人口增加和城市化進(jìn)程的建設(shè)，受污水、有毒化學(xué)物質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)以及由此產(chǎn)生的有害水華的影響，水源水質(zhì)污染加劇，增加了飲用水處理工藝的難度與成本。水源水質(zhì)的優(yōu)劣對(duì)后續(xù)處理后水中微生物的存在水平及其多樣性影響較大。

葛英亮等[29]使用Illumina MiSeq對(duì)水源水水樣中病毒基因組進(jìn)行測序，與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)獲得基因數(shù)據(jù)，分析了飲用水源水中病毒的多樣性，可為水體中病毒的檢測提供理論上的參考依據(jù)。張明露等[30]采用基于16S rRNA的焦磷酸測序技術(shù)，對(duì)丹江口水庫水和北京地區(qū)4個(gè)水源水總微生物進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示丹江口水庫水和北京地區(qū)水源水細(xì)菌群落的差異大，且pH、氨氮等對(duì)水樣中細(xì)菌群落影響較大。Gomez-Alvarez等[31]研究了地下水與地表水對(duì)供水管網(wǎng)中微生物多樣性的影響，多變量分析表明兩區(qū)域之間存在顯著差異，多樣性指數(shù)研究表明地表水源供水管網(wǎng)中的微生物群落多樣性比地下水源的高，且包含更多的與當(dāng)?shù)匚⑸锶汗泊娴倪h(yuǎn)緣物種，源水水質(zhì)參數(shù)可能是群落結(jié)構(gòu)差異的主要原因。

Mukherjee等[32]使用基于16S rRNA基因的焦磷酸測序方法，對(duì)西半球中部高原農(nóng)村地區(qū)水源和末梢水進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示水源水與末端水中的細(xì)菌群落顯著不同，且水源中致病菌可能會(huì)影響龍頭水水質(zhì)，而龍頭水與水源細(xì)菌群落的差異性也說明凈水工藝和供水管網(wǎng)對(duì)用水水質(zhì)的影響。

不同水源水中的微生物的優(yōu)勢菌群存在差異。張明露等[30]對(duì)丹江口水庫和北京地區(qū)兩個(gè)水源水的測序結(jié)果表明，3類樣本的優(yōu)勢菌群不同，北京地區(qū)兩水源水樣為α變形菌綱、β變形菌綱和藍(lán)藻綱，而丹江口水庫水樣中優(yōu)勢菌群為硝化螺旋菌綱等。Mukherjee等[32]的水樣組成顯示，硬壁菌門較豐富，其次是變形桿菌和擬桿菌。水源類型和不同水源水的混合比例也會(huì)影響某些類群的豐度和比例[33-34]。此外，水源水中有機(jī)物對(duì)飲用水全流程系統(tǒng)乃至龍頭水中微生物多樣性也存在較大影響，如青霉素-G[35]、丙吡胺[36]、抗生素[37]等有機(jī)物的存在會(huì)抑制水中細(xì)菌群落的活動(dòng)，導(dǎo)致水樣中細(xì)菌總數(shù)與豐度下降。

2.2 16S rRNA在水處理工藝中微生物多樣性的研究應(yīng)用

飲用水微生物的有效凈化是預(yù)防介水傳染病及其傳播的重要環(huán)節(jié)。細(xì)菌群落組成與條件致病菌的出現(xiàn)存在潛在聯(lián)系[38]。飲用水處理廠或配水過程中遇到的問題可能會(huì)導(dǎo)致條件性致病菌(如分支桿菌、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團(tuán)菌等)的擴(kuò)散[39-40]。飲用水微生物的有效滅活是預(yù)防介水傳染病及其傳播的重要環(huán)節(jié)。

Hou等[41]為了了解飲用水處理系統(tǒng)中的細(xì)菌群落變化，采用Illumina Hiseq測序分析，在不同季節(jié)對(duì)華南某飲用水處理廠處理流程中的微生物群落進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，處理過程中放線菌、變形桿菌和硬壁菌的比例發(fā)生了較大的變化，放線菌的比例急劇下降，而處理水中的變形桿菌和硬壁菌的比例增加并占主導(dǎo)地位。氯化后細(xì)菌群落發(fā)生了顯著變化，而出廠水中細(xì)菌群落的豐度相對(duì)穩(wěn)定，不隨季節(jié)變化。在包括出廠水在內(nèi)的各個(gè)工藝流程的水中檢測到一些條件致病菌，包括假單胞菌、不動(dòng)桿菌、檸檬酸桿菌、分枝桿菌等，這表明飲用水的安全可能受到威脅，該結(jié)果為飲用水處理流程中微生物時(shí)空變化提供了材料。Wu等[35]采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測飲用水中青霉素-G的含量，并采用聚合酶鏈反應(yīng)和高通量測序技術(shù)(檢測細(xì)菌16S rRNA V3和V4區(qū)基因)，用Illumina HiSeq2000檢測樣品中細(xì)菌的多樣性，并計(jì)算了各樣品的多樣性指數(shù)。結(jié)果表明，不同濃度的青霉素-G對(duì)飲用水細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)影響較大，添加青霉素-G后，飲用水樣品中細(xì)菌群落物種總數(shù)和豐度明顯下降，但群落結(jié)構(gòu)的數(shù)量和豐度并未隨濃度的變化而變化。青霉素-G能抑制飲用水中細(xì)菌群落的活動(dòng)，降低飲用水中細(xì)菌的多樣性。Potgieter等[42]使用3種連續(xù)的消毒策略(氯化、氯胺化和次氯酸化作用)，在飲用水處理廠和分配系統(tǒng)中采集大量水樣，通過Illumina MiSeq對(duì)16S rRNA基因的V4可變區(qū)進(jìn)行測序來表征細(xì)菌的群落組成，結(jié)果顯示，α-和β-變形桿菌在飲用水細(xì)菌群落中占主導(dǎo)地位，在氯胺化后β-變形桿菌數(shù)量增加。除消毒過程對(duì)微生物多樣性影響之外，軟化[43]、臭氧生物活性炭[44]、混凝[45]、過濾[46]等均會(huì)對(duì)水中微生物多樣性產(chǎn)生影響。

這些研究表明，飲用水處理廠的處理工藝(物理、化學(xué)、生物工藝)均會(huì)對(duì)水中的細(xì)菌群落產(chǎn)生一定影響。

2.3 16S rRNA技術(shù)在管網(wǎng)系統(tǒng)微生物多樣性變化的研究應(yīng)用

經(jīng)過處理廠凈水系統(tǒng)后的出廠水，通過供水管網(wǎng)(drinking water distribution system, DWDS)運(yùn)輸?shù)礁饔盟c(diǎn)。DWDS的微生物生態(tài)受多種因素影響，包括環(huán)境和工程因素以及影響生物膜、水環(huán)境和沉積物中細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)的操作條件等[47]。除了水中微生物的影響，出廠水也可能會(huì)受到配水系統(tǒng)本身的影響，比如管道材料[48-49]、管道腐蝕[51]和松散沉積物的再懸浮[47-51]等。

Huang等[52]使用了Illumina高通量測序和454焦磷酸測序兩種方法對(duì)飲用水全流程的細(xì)菌毒性和毒性因子進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，經(jīng)過氯氣消毒后，細(xì)菌多樣性下降，但經(jīng)過管道分配運(yùn)輸后多樣性上升，且飲用水中依然存在部分致病菌。研究認(rèn)為，聯(lián)合使用Illumina和454焦磷酸測序能夠更全面地表征飲用水系統(tǒng)中的細(xì)菌毒性和毒性因子。

供水管網(wǎng)材質(zhì)是影響末梢水微生物多樣性的一個(gè)重要因素。Liu等[53]采用的焦磷酸測序方法，以Roche 454 GS FLX 測序平臺(tái)，分析了聚氯乙烯(PVC)和鑄鐵管道中的水以及生物膜中的微生物群落組成。結(jié)果顯示，菌絲體和腐蝕相關(guān)細(xì)菌是PVC和鑄鐵生物膜中最具優(yōu)勢的細(xì)菌，而常見條件致病菌在不同材質(zhì)管網(wǎng)中相對(duì)豐度不同，且不同材料表面上的細(xì)菌群落具有特定的細(xì)菌種群，不同管道材料(PVC和鑄鐵)對(duì)微生物群落，特別是對(duì)細(xì)菌組成影響顯著，多種微生物會(huì)在不同的管材上選擇性繁殖。王薇等[54]利用 Roche 454 GSFLX+測序儀進(jìn)行測序，研究了灰口鑄鐵管、鍍鋅管和不銹鋼復(fù)合管對(duì)供水管網(wǎng)生物膜微生物種群多樣性的影響，灰口鑄鐵管生物膜種群多樣性最高，鍍鋅管生物膜種群多樣性相對(duì)較為單一，不銹鋼復(fù)合管生物膜種群多樣性最低，不同管材生物膜細(xì)菌群落組成差異很大。Yu等[55]分析了管道材料銅、氯化聚氯乙烯、聚丁烯、聚乙烯、不銹鋼、鍍鋅鋼對(duì)生物膜形成潛力和微生物群落的影響，細(xì)菌16S rDNA片段的變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)顯示，不同材料之間存在顯著差異，管道材料不僅影響生物膜形成潛力，而且影響微生物多樣性。Inkinen等[56]利用16S rRNA和16S rRNA基因測序，對(duì)銅和交聯(lián)聚乙烯(PEX)飲用水管道生物膜在兩種不同處理?xiàng)l件(額外消毒和磁化水處理)下的細(xì)菌群落變化。結(jié)果表明，管材對(duì)分枝桿菌的產(chǎn)生有一定的影響，對(duì)磁化水處理的銅管的細(xì)菌群落有影響，而對(duì)磁化水處理的PEX管的細(xì)菌群落影響不明顯。值得一提的是，由于基于DNA的測序無法區(qū)分活細(xì)菌與死細(xì)菌，該研究同時(shí)構(gòu)建了樣本的16S rDNA和16S rRNA庫，以便更好地研究細(xì)菌群落的活性。

DWDS中的微生物群落具有很強(qiáng)的復(fù)雜性，是因其受到各種因素的聯(lián)合影響。來自出廠水中攜帶的微生物和消毒副產(chǎn)物，分配系統(tǒng)的管材、生物膜、沉積物等，以及分配過程的水力條件、水齡(時(shí)間)、地點(diǎn)(空間)等均會(huì)對(duì)分配系統(tǒng)中的微生物群落造成影響，可能引起微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化。Liu等[53]、Yu等[55]和Inkinen等[56]的研究均表明了管材對(duì)于分配系統(tǒng)中微生物群落的選擇性。

除管網(wǎng)材質(zhì)外，時(shí)空變化亦是影響末梢水生物安全的重要因素。Wang等[57]研究了管網(wǎng)中不同水齡的4個(gè)樣本，結(jié)果顯示，隨著水齡的增長，余氯逐漸減少，溶解有機(jī)質(zhì)、細(xì)菌總數(shù)和細(xì)菌多樣性增加。但是也有相反的報(bào)道，如Hwang等[58]對(duì)5個(gè)地點(diǎn)的水樣微生物群落的研究表明，采樣地點(diǎn)和水齡(<21.2 h)對(duì)大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)樣品的微生物組成無明顯影響。Perrin等[59]研究巴黎DWDSs的細(xì)菌群落，結(jié)果表明，菌絲微桿菌和幽門桿菌是最具代表性的細(xì)菌屬，細(xì)菌群落在空間上相當(dāng)穩(wěn)定，隨著時(shí)間的推移略有波動(dòng)。Roeselers等[60]從荷蘭32個(gè)飲用水供水管網(wǎng)的不同地點(diǎn)收集水樣，結(jié)果顯示，出廠水的微生物群落結(jié)構(gòu)與末梢水沒有實(shí)質(zhì)性差異，同一供水管網(wǎng)的特定群落展現(xiàn)出時(shí)間上的穩(wěn)定性，同一供水管網(wǎng)內(nèi)的末梢水樣顯示出非常相似的群落結(jié)構(gòu)。

2.4 其他

除了上述水處理工藝、配水系統(tǒng)中生物膜和管材以及時(shí)間的影響之外，還有許多其他方面的對(duì)飲用水微生物的研究，例如水力條件[61]、水化學(xué)因素[62]等。Liu等[51]利用Illumina MiSeq進(jìn)行DNA測序，確定了水源、處理水和配水系統(tǒng)在利用Bayesian “SourceTracker”方法塑造龍頭水細(xì)菌群落方面的比例貢獻(xiàn)。

Douterelo等[63]研究了小流量、穩(wěn)態(tài)流量和大流量水力條件對(duì)試驗(yàn)配水系統(tǒng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成的影響，結(jié)果表明，在大流量水力條件下，細(xì)菌群落的物種豐富度和多樣性有提高的趨勢。

在對(duì)細(xì)菌群落多樣性分析方面，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，高通量測序技術(shù)具備一定優(yōu)勢。Perrin等[59]研究了巴黎4個(gè)飲用水分配系統(tǒng)的細(xì)菌群落，比較了基于培養(yǎng)方法描述的細(xì)菌多樣性和基于高通量測序方法描述的細(xì)菌多樣性。結(jié)果表明，基于培養(yǎng)的方法所展現(xiàn)的細(xì)菌多樣性，僅為基于高通量測序法的1.3%～1.8%。僅小部分的細(xì)菌多樣性能夠被傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所鑒定。高通量測序法則顯示高靈敏度的特點(diǎn)，使用高通量技術(shù)能夠更準(zhǔn)確地描述微生物群落的狀態(tài)以及檢測其內(nèi)部和外部發(fā)生的干擾。

3 總結(jié)與展望

本文基于16S rRNA基因的特征，總結(jié)并分類分析了16S rRNA應(yīng)用于飲用水的微生物多樣性研究，包括源水水質(zhì)、水處理流程、供水管網(wǎng)條件等因素對(duì)微生物多樣性的影響。結(jié)果表明，水源條件、處理工藝、管網(wǎng)條件等均會(huì)對(duì)末梢水微生物群落多樣性造成影響，其中，水源條件與末梢水微生物種群結(jié)構(gòu)的相關(guān)性較大，處理工藝與管網(wǎng)條件對(duì)龍頭水中微生物種群豐度的影響較大。

16S rRNA測序技術(shù)為飲用水微生物多樣性研究帶來了極大的幫助，但仍存在一些問題，如僅采用16S rRNA分析無法對(duì)某些差異較小的細(xì)菌鑒定到種，基于PCR技術(shù)可能帶來的污染和假陽性問題等。在此，對(duì)16S rRNA測序技術(shù)及飲用水微生物研究做出以下幾點(diǎn)預(yù)測。

(1)高通量測序技術(shù)的不斷革新。NGS的出現(xiàn)使得微生物基因研究的成本大幅度降低，試驗(yàn)時(shí)間大幅度縮短，帶來了很好的經(jīng)濟(jì)和效率收益，加快推動(dòng)了微生物多樣性的研究。Illumina測序平臺(tái)繼推出Hiseq、Miseq之后，近幾年新推出了Novaseq和iSeq，以適應(yīng)更多的需求。可通過改進(jìn)文庫構(gòu)建[64-65]和測序讀長質(zhì)量控制[66-67]的方法來改善平臺(tái)的數(shù)據(jù)分析，不斷完善自身，降低錯(cuò)誤率，提高應(yīng)用能力。

(2)不同研究技術(shù)的結(jié)合使用。為了更好地研究飲用水微生物，只使用單一的方法是不夠的，因?yàn)槿魏畏椒ǘ加衅渚窒扌?，?yīng)當(dāng)合理地結(jié)合使用不同的方法，以求對(duì)樣本進(jìn)行更全面的描述和理解。例如:研究量較少時(shí)，第一代Sanger測序依然是一種選擇；需要較長讀長時(shí)，單分子測序技術(shù)的應(yīng)用則更適合；需要較高通量時(shí)，高通量測序技術(shù)則為較好的選擇；為了對(duì)樣品進(jìn)行初步的篩選或評(píng)估，可以使用指紋圖譜技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行微生物定量分析和群落結(jié)構(gòu)分析等。

(3)研究規(guī)模的不斷擴(kuò)大。目前，對(duì)飲用水微生物多樣性的研究大都是集中于一個(gè)方面(如管材、時(shí)間、消毒劑等)、一項(xiàng)處理流程或者一段運(yùn)輸分配路徑對(duì)飲用水微生物多樣性的影響，且對(duì)單一方面的研究也只局限于某一小區(qū)域的樣品分析。未來應(yīng)當(dāng)有更多的關(guān)于可能影響飲用水微生物的多種因素(飲用水處理全流程)的更大規(guī)模(市級(jí)供水管網(wǎng)、全國管網(wǎng))的項(xiàng)目及研究，以便更深刻地了解飲用水微生物的各項(xiàng)特性，從而對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性的處理。