李 曼

（河北省衡水市武邑縣職教中心，河北 衡水 053400）

1.材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試西瓜種子

“懶漢地瓜王”西瓜種子，千瑞種業(yè)公司生產(chǎn)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂an20g，1000ml水；NB培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，1000ml水。

1.2 實驗儀器

滅菌鍋SQ810C、恒溫培養(yǎng)箱BSG-250、搖床HNY-2102C、干燥箱DZF-6090

1.3 實驗方法

1.3.1 西瓜種子的處理

采用干熱處理法將種子在陽光下暴曬，使其充分干燥，然后在恒溫干燥箱內(nèi)進行處理。準備3個干燥箱，設(shè)65℃，70℃，75℃ 3個溫度處理。每處理3次重復，每重復3粒種子。將種子置于滅菌培養(yǎng)皿中，干燥箱內(nèi)烘干24h。對照（CK）為不經(jīng)過干熱處理的種子。

1.3.2 培養(yǎng)基的選擇

采用了水和NB培養(yǎng)液兩種培養(yǎng)液對本實驗進行了研究，用平板涂布法對兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)出的菌落進行了比較實驗。根據(jù)得出的結(jié)果，在正式實驗中選用NB培養(yǎng)基更加合理，確保實驗的準確性和嚴謹性。

1.3.3 菌懸液的培養(yǎng)

NA和NB培養(yǎng)基的配制方法是將幾種物質(zhì)分別稱量后放入1000 ml燒杯中，按比例加水、定容、攪勻、分裝，放入121℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min。干熱處理后的種子在超凈工作臺中接到滅好菌的三角瓶中，超凈作臺紫外線滅菌15分鐘，滅菌結(jié)束后吹風10分鐘左右后進行實驗操作。采用振蕩培養(yǎng)法將不同溫度干熱處理后的種子加入到滅菌的NB培養(yǎng)液中，160 rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.4 西瓜種子帶菌量的測定

將滅菌凝固后的NA培養(yǎng)液在微波爐內(nèi)加熱，直至呈液態(tài)。在超凈工作臺中倒入培養(yǎng)皿中。然后吸取1 ml菌懸液依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4和10-5倍。再從10-3、10-4、10-5的稀釋液中取100 μL在培養(yǎng)基上涂板，用三角玻璃環(huán)涂勻。每個處理3皿。以未進行干熱處理的種子作為對照。

待涂好板的培養(yǎng)基表面風干后，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24 h，觀察并用活細胞計數(shù)法計數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007軟件對所有數(shù)據(jù)進行整理作圖，并將得到的實驗數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進行分析。

2.結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基質(zhì)的測定結(jié)果

為了保證實驗的準確性和嚴謹性，我們采用了以水和NB培養(yǎng)液兩種培養(yǎng)液對本實驗進行了研究，用平板涂布法對兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)出的菌落進行了比較實驗，結(jié)果如圖3-1所示。

圖3 -1 選擇培養(yǎng)液對照

從兩種培養(yǎng)液的成分來看，其中NB培養(yǎng)液含有牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉，營養(yǎng)成分相對較多，為菌落生長提供了較好的環(huán)境；而以水作為培養(yǎng)液，沒有營養(yǎng)成分，菌落生長緩慢。得出的結(jié)果顯而易見，NB培養(yǎng)液生長出來的菌落非常多，而水培養(yǎng)出來的菌落比較稀少。綜上，NB培養(yǎng)液是適合本實驗的培養(yǎng)液，但是菌落數(shù)量龐大，需要對菌懸液進行更大的倍比稀釋，保證實驗的準確性。

2.2 不同溫度干熱處理下對種子帶菌量的測定

在預(yù)備實驗中，我們選擇了10-1、10-2、10-3，得到的細菌菌落非常多，難以統(tǒng)計。二次實驗，在制備菌懸液時沒有選用培養(yǎng)液培養(yǎng)，雖然滅菌率顯著，但是得到的結(jié)果沒有對比性。在我們不斷的測試中，選擇了在制備菌懸液時選擇NB培養(yǎng)液，然后選擇10-3、10-4、10-5的稀釋液。得到的數(shù)據(jù)如表：

如表3-1所示，65℃、70℃和75℃各個溫度下的10-3、10-4、10-5三個濃度梯度細菌數(shù)量由低到高成一定的倍比關(guān)系，符合實驗結(jié)果的發(fā)展規(guī)律；同一濃度下，各個溫度梯度細菌的數(shù)量差異性也非常顯著。

表3-1 處理后種子帶菌數(shù)量

在65℃ 24 h干熱處理下，西瓜種子帶菌量還較高，與對照相比，滅菌率57%；在70℃ 24 h干熱處理溫度下，西瓜種子帶菌量顯著降低，滅菌率80%；在75℃ 24 h干熱處理溫度下，西瓜種子滅菌已經(jīng)非常明顯，滅菌率高達95%。

以10-5為例，用SPSS22.0做方差分析，結(jié)果如下表：

以10-5濃度做方差分析研究不同干熱處理對西瓜種子帶菌量影響的結(jié)果表明，如表3-2所示：65℃，70℃和75℃的處理和對照比較均有顯著性差異，同一時間下三個溫度的干熱處理對西瓜種子帶菌量均有不同程度的影響。

表3-2 10-5濃度下菌落個數(shù)分析

其中75℃ 24 h干熱處理溫度對西瓜種子帶菌量抑制效果最顯著，平均細菌數(shù)量33個。其次是70℃ 24 h對其的抑制效果，平均細菌數(shù)量165個。與對照組相比效果最差的是65℃ 24 h的處理，其平均細菌數(shù)量還存在467個。

帶菌量檢測結(jié)果表明，同一時間下不同溫度組合干熱處理對種子表面病菌的滅菌率明顯，隨著干熱處理溫度升高，滅菌率明顯增加，帶菌量下降。表明西瓜種子帶菌量隨著干熱處理溫度升高呈顯著降低趨勢。

3.結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

由上面得到的結(jié)果表明：“懶漢地瓜王”西瓜種子經(jīng)NB培養(yǎng)液培養(yǎng)后，干熱處理對西瓜種子的滅菌率明顯。隨著干熱處理溫度升高，滅菌率明顯。65℃，70℃和75℃三個處理溫度的滅菌率分別是57%、80%和95%。所以，在實際生產(chǎn)中，75℃ 24 h的干熱處理是最適宜西瓜種子的處理。本實驗為干熱處理廣泛應(yīng)用在減少西瓜種子帶菌量提供了一些理論依據(jù)。

3.2 討論

現(xiàn)有選擇的培養(yǎng)基在種子實際帶菌量較低的情況下，由于培養(yǎng)基的靈敏度有限或?qū)嶒灢灰?guī)范導致培養(yǎng)基上長出來的全部是假陽性菌落，常?？赡軐е聶z測不到真實的病菌，導致錯誤檢測結(jié)果。所以注意自身安全，規(guī)范實驗操作，減少實驗誤差。在研究中發(fā)現(xiàn)控制和消除病害的早期污染源是預(yù)防植物病害的關(guān)鍵技術(shù)，但目前還沒有發(fā)現(xiàn)發(fā)生西瓜病害的流行規(guī)律、病害的早期污染源等。有研究結(jié)果表明，由于感染病菌的主要原因是接種源是感染病菌的種子。但是，關(guān)于病菌的種子的帶菌機制的研究還沒有完善，通過什么方法處理帶菌的種子是最有效的，這些都是生產(chǎn)上待解決的問題。

今后西瓜的重要種傳病害研究方向集中于以下幾個方面：深入了解種子如何感染病菌、病菌的種子傳播和生存機制，有助于完善種子檢測的規(guī)程和處理種子的技術(shù)?，F(xiàn)在的檢測方法在應(yīng)用中各有優(yōu)點和缺點，發(fā)展快速、準確的可以確認病菌的活力的高質(zhì)量檢測方法；在種子處理中，找到能夠提高種子的活力和易于操作、普及的方法同時有效地去除西瓜種子內(nèi)部的病菌；建立完善的種子采后保存處理規(guī)程。