陳力力，田興貴*，張愛瓊

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.畢節(jié)市動物疫病預(yù)防控制中心，貴州畢節(jié) 551700）

雌激素在精子的產(chǎn)生、成熟和受精中起重要作用，進而影響雄性動物的生殖能力[1]。來曲唑（Letrozole）是新一代芳香化酶抑制劑，它能降低豬內(nèi)源性雌激素的生成且不影響促性腺激素的分泌[2]，進而影響豬睪丸的生長發(fā)育[3]。有研究表明，波形蛋白在維持精子生成、修復(fù)生精管上皮損傷以及恢復(fù)精子生成中起重要作用[4]；波形蛋白細胞骨架改變與內(nèi)皮細胞凋亡存在相關(guān)性[5]；波形蛋白不僅在正常的細胞中表達，在乳腺癌細胞中也有表達，且與細胞的遷移和侵襲相關(guān)[6]，表明波形蛋白與細胞黏附、遷移、生長、凋亡以及睪丸細胞數(shù)和精子產(chǎn)生密切相關(guān)。但雌激素是否通過影響波形蛋白的表達進而影響香豬睪丸細胞的生長發(fā)育有待研究。因此，本研究擬通過來曲唑降低香豬體內(nèi)雌激素含量來研究其對睪丸生精小管細胞中波形蛋白表達及分布的影響，從而進一步了解雌激素對睪丸細胞生長發(fā)育的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理 香豬由貴陽市烏當區(qū)綠生源畜牧科技公司香豬生態(tài)福利養(yǎng)殖場提供。選取4 頭體質(zhì)健康母豬所分娩的12 頭14 日齡雄性香豬，每頭母豬有3 頭雄性豬仔，豬仔平均體重3 kg，隨機將每頭母豬所分娩的雄性小香豬分為3 組，在相同條件下分開飼養(yǎng)母豬及其小豬，即飼養(yǎng)溫度、濕度、光照與環(huán)境一致，每天清掃圈舍，定時投喂飼料，自由飲水。

1.2 藥物及試劑 來曲唑為Sigma 公司產(chǎn)品；波形蛋白抗體（批號為GR3230520-3）和SP（小鼠 ΙgG）-POD（批號為ΝO.20181009）為Abcam 公司產(chǎn)品。

1.3 藥物投喂 對照組不做任何處理；2 個試驗組分別經(jīng)口投喂0.1 mg/kg 和0.2 mg/kg 來曲唑（投喂劑量參考文獻[2]，并稍作修改，即本試驗在其0.1 mg/kg 來曲唑劑量組的基礎(chǔ)上，增加了 0.2 mg/kg 來曲唑劑量組），每3 d 投喂1 次，連續(xù)投喂15 次，在最后一次投喂7 d后經(jīng)外科手術(shù)無菌取出左側(cè)睪丸。

1.4 睪丸組織石蠟切片制作 將經(jīng)外科手術(shù)取出的無菌新鮮左側(cè)睪丸橫切后放入4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)70%酒精20 min，80%、95%、95%、100%、100%酒精各30 min 處理進行脫水，用二甲苯處理2 次，每次5 min進行透明，隨后在石蠟中浸泡2 次，每次30 min，從浸蠟盒中將其取出放入正方體小盒子底部，向其中倒入液態(tài)石蠟，室溫冷卻凝固，進行包埋，制成組織蠟塊。待石蠟固定后將豬睪丸組織蠟塊取出晾干、修塊，放在旋轉(zhuǎn)式切片機上固定好，調(diào)整好角度后均勻的切成5 μm厚的連續(xù)切片，用鑷子或蘸水牛角針挑起單個的蠟片帶，放入40℃溫水中自然展平，用經(jīng)酸浸泡、清洗、酒精浸泡、防脫劑處理過的載玻片輕輕撈起，并垂直放入載玻片架子中，將其放在37℃恒溫箱中烘烤過夜。每隔5張取1 張切片做免疫組織化學(xué)檢測。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測 將做好的切片染色后進行免疫組織化學(xué)檢測。首先將切片從烤箱中取出，室溫放置30 min，把切片放入二甲苯Ι 5 min、二甲苯ΙΙ 5 min、100%酒精Ι 2 min、100%酒精ΙΙ 2 min、95%酒精2 min、80%酒精2 min、70%酒精2 min、蒸餾水5 min 中進行脫蠟與水化處理；隨后將切片平鋪于濕盒內(nèi)，每張切片加10 μL 3%過氧化氫，室溫下孵育1 h 后拿出，放入載玻架中，用PBS（pH7.4）沖洗3 遍，每次3 min，對內(nèi)源性過氧化物酶滅活；其次將切片放入裝有檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）的燒杯中，用微波爐將其緩沖液加熱直至沸騰，關(guān)掉電源，間隔5～10 min，反復(fù)1～2 次，冷卻后PBS（pH7.4）沖洗2 遍，每次3 min，對抗原進行修復(fù)；接著將切片平鋪于濕盒內(nèi)，每張切片加10 μL 正常血清工作液，在室溫下孵育1 h，傾去上清，勿洗，對非特異性抗原進行封閉，然后將波形蛋白抗體用稀釋液按1:70 的比列稀釋，每張切片加10 μL，放入冰箱4℃過夜，進行一抗孵育，一抗孵育結(jié)束后將切片平鋪于濕盒內(nèi)，將羊抗小鼠ΙgG 濃縮液用稀釋液按1:100稀釋成工作液，每張切片加10 μL，室溫孵育1 h，將切片拿出放入載玻架中，用PBS（pH7.4）沖洗3 遍，每次2 min，緊接著將切片平鋪于濕盒內(nèi)，將鏈霉親和素濃縮液用稀釋液按1:100 稀釋成工作液，每張切片加10 μL，室溫孵育1 h，將切片拿出放入載玻架中，用PBS（pH7.4）沖洗3 遍，每次2 min。最后，將切片平鋪于濕盒內(nèi)，將PBS（pH 7.4）按1 mL PBS 加入50 μL 20×DAB 顯色液A、50 μL 20×DAB 顯色液B，充分混合后，每張切片加10 μL，室溫顯色，光學(xué)顯微鏡下控制時間，一般5～10 min，將切片拿出放入載玻架中，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，隨即將切片經(jīng)蘇木素染色3 min、蒸餾水5 min、70% 酒精2 min、80% 酒精2 min、95%酒精2 min、100% 酒精Ι 2 min、100% 酒精ΙΙ 2 min、二甲苯Ι 5 min、二甲苯ΙΙ 5 min 進行蘇木素復(fù)染處理，待干燥后中性樹脂封片鏡檢。

1.6 顯微鏡檢與細胞計數(shù) 在Νikon 80i 光學(xué)顯微鏡40倍物鏡下計數(shù)每張睪丸組織切片上的6 個正圓形生精小管中睪丸細胞總數(shù)和睪丸生精小管細胞波形蛋白的陽性細胞數(shù)，同時進行組織切片拍照。計數(shù)睪丸生精小管內(nèi)細胞總數(shù)、波形蛋白表達陽性細胞總數(shù)以及波形蛋白在睪丸生精小管細胞部分細胞質(zhì)和整個細胞質(zhì)表達陽性細胞數(shù)?？傟栃月蕿椴ㄐ蔚鞍妆磉_陽性細胞總數(shù)與睪丸生精小管內(nèi)細胞總數(shù)的百分比，部分細胞質(zhì)表達陽性率為波形蛋白在睪丸生精小管細胞部分細胞質(zhì)表達陽性細胞數(shù)與睪丸生精小管內(nèi)細胞總數(shù)的百分比；整個細胞質(zhì)表達陽性率為波形蛋白在睪丸生精小管細胞整個細胞質(zhì)表達陽性細胞數(shù)與睪丸生精小管內(nèi)細胞總數(shù)的百分比。

1.7 統(tǒng)計分析 利用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，獨立樣本t檢驗，統(tǒng)計結(jié)果以平均值± 標準誤表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫組織化學(xué)測定結(jié)果 如圖1 所示，波形蛋白在香豬睪丸生精小管細胞胞質(zhì)中表達，且在睪丸生精小管細胞基底部圍繞其細胞核成環(huán)狀，隨著其胞質(zhì)的延伸呈放射狀伸向睪丸生精小管管腔，隨著來曲唑劑量的增加，波形蛋白表達增強，向管腔的放射狀加長；且波形蛋白在睪丸生精小管細胞內(nèi)染色部分存在差異，呈現(xiàn)出2 種情況，即細胞質(zhì)部分區(qū)域表達以及整個細胞質(zhì)都有表達。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測來曲唑?qū)ο阖i睪丸生精小管細胞波形蛋白的影響

2.2 顯微鏡檢與細胞計數(shù)結(jié)果 在顯微鏡下觀察波形蛋白在睪丸生精小管細胞胞漿中表達，細胞質(zhì)染成棕黃色。由表1 可知，與對照組相比，0.1 mg/kg 組和0.2 mg/kg組香豬睪丸生精小管細胞總數(shù)減少（P＜0.01），但香豬睪丸生精小管細胞中表達波形蛋白細胞比率上升（P＜0.01）；且0.2 mg/kg 組睪丸生精小管波形蛋白在睪丸生精小管細胞部分細胞質(zhì)表達陽性率均高于0.1 mg/kg組（P＜0.01）；隨著來曲唑劑量的增加，波形蛋白在睪丸生精小管細胞整個細胞質(zhì)表達陽性率呈先上升再下降趨勢（P＜0.01）?？偟膩碚f，隨著來曲唑劑量的增加香豬睪丸生精小管細胞中表達波形蛋白細胞比率極顯著上升。

表1 來曲唑?qū)ο阖i睪丸生精小管細胞總數(shù)及波形蛋白表達陽性率的影響

3 討論

波形蛋白在睪丸支持細胞和間質(zhì)細胞中構(gòu)成其細胞骨架成分，對于維持支持細胞的穩(wěn)定性及完整性具有重要作用，它主要分布在血液、骨骼、腹膜和睪丸等中胚層來源的組織中[7]。采用免疫組織化學(xué)方法研究顯示波形蛋白在新生犢牛睪丸生精管、直細精管、睪丸網(wǎng)和小管間組織中分布，且主要定位于支持細胞核周位置[8]，在豪豬睪丸支持細胞和間質(zhì)細胞中均有波形蛋白表達[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，波形蛋白在香豬睪丸生精小管細胞胞質(zhì)中也有表達。Tsutsumi 等[10]將芳香化酶抑制劑注入雄性大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)大鼠睪丸生殖細胞退化和附睪內(nèi)梭形精子細胞數(shù)顯著減少。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)經(jīng)口投喂來曲唑后幼年香豬睪丸生精小管內(nèi)細胞總數(shù)減少[11]，而在經(jīng)腹腔注射一定劑量己烯雌酚（0.3、3 mg/kg）后能促使睪丸生殖細胞數(shù)顯著增多，而使睪丸支持細胞數(shù)量顯著減少[12]；最新資料顯示，來曲唑通過降低山羊睪丸中雌二醇含量影響其生長和繁殖能力[13]，因此筆者推測來曲唑通過降低內(nèi)源性雌激素來影響香豬睪丸細胞的生長發(fā)育，且主要導(dǎo)致生殖細胞凋亡和支持細胞增加。同時，本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)香豬睪丸支持細胞的增殖主要發(fā)生在1 月齡前[14]，說明經(jīng)來曲唑作用后香豬睪丸支持細胞的增殖期可能延長。

研究表明，波形蛋白在損傷生精上皮的修復(fù)與恢復(fù)精子產(chǎn)生有關(guān)，這是由于波形蛋白在控制細胞生長與分化中起重要作用[4]，同時波形蛋白表達減少會導(dǎo)致精子產(chǎn)生受損，當波形蛋白的分布發(fā)生改變會引起生精細胞凋亡增加[15]，波形蛋白在豬睪丸細胞中表達并與睪丸的生長發(fā)育有關(guān)[16]。鄧茂先等[17]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境雌激素雙酚A 通過抑制基因轉(zhuǎn)錄干擾波形蛋白合成，從而影響支持細胞骨架的正常形成，導(dǎo)致細胞形態(tài)改變；任軍慧等[18]研究發(fā)現(xiàn)，青春期大鼠受己烯雌酚（DES）持續(xù)作用后，成年時睪丸支持細胞和間質(zhì)區(qū)的波形蛋白表達量顯著下降，且損傷呈劑量效應(yīng)關(guān)系。這些結(jié)果說明波形蛋白在睪丸細胞的生長發(fā)育過程中起重要作用，其可能是通過調(diào)節(jié)睪丸細胞的骨架成分來發(fā)揮作用。本研究中投喂來曲唑后波形蛋白在香豬睪丸生精小管細胞部分表達陽性率上升，表明來曲唑可通過降低香豬體內(nèi)雌激素含量，促進波形蛋白的表達，進而影響睪丸生精小管細胞的生長發(fā)育。

4 結(jié)論

綜上所述，來曲唑降低香豬體內(nèi)雌激素水平后會導(dǎo)致睪丸生精小管內(nèi)細胞總數(shù)減少，使香豬睪丸生精小管細胞波形蛋白陽性表達率增加，說明來曲唑可能促進香豬睪丸生精小管細胞中波形蛋白的表達，進而影響睪丸生精小管支持細胞與生殖細胞的生長和分化成熟過程，但其作用機制需進一步研究。