南 穎，翟曼君，朱夢(mèng)婷，王明遠(yuǎn)，邵焱焱，趙宗勝

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000）

綿羊季節(jié)性發(fā)情受下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）的調(diào)控[1]。血液中的酪氨酸（Tyrosinase，Tyr）通過酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變成褪黑激素，促使下丘腦釋放在綿羊發(fā)情中具有始作用的促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-Releasing Hormone，GnRH），作用于HPG 調(diào)節(jié)促性腺激素的釋放進(jìn)而影響綿羊發(fā)情[2-3]。

Tyr 通過動(dòng)物覓食后分解進(jìn)入機(jī)體參與體內(nèi)信息傳遞，涉及腦內(nèi)很多重要的生理功能，屬于腦內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可調(diào)控多巴胺的合成。Yu 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物中對(duì)GnRH 的釋放表現(xiàn)出雙重調(diào)節(jié)作用。Rǔse 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充Tyr 的青年母豬1 周左右出現(xiàn)發(fā)情，GnRH 分泌量明顯升高，配種后平均多產(chǎn)3.1 頭仔豬，表明Tyr 對(duì)動(dòng)物發(fā)情有促進(jìn)作用。許多學(xué)者認(rèn)為Tyr 使大、小鼠卵巢孕酮的分泌量明顯增加，可促進(jìn)和誘導(dǎo)排卵，并且Tyr 能促進(jìn)大鼠黃體細(xì)胞凋亡從而調(diào)節(jié)動(dòng)物發(fā)情[6-9]。林杉[10]認(rèn)為，Tyr 通過調(diào)控多巴胺的合成作用于MMP14調(diào)控MEK1基因通過GnRH信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)綿羊發(fā)情，但具體調(diào)控機(jī)制還不清楚。Tyr 對(duì)促進(jìn)動(dòng)物發(fā)情有明顯效果，但大部分研究都在常年發(fā)情動(dòng)物上，其對(duì)季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物起作用的劑量還未證實(shí)。翟曼君[11]提到，在雌性胎綿羊下丘腦神經(jīng)細(xì)胞中 DRD1 通 過 Dopaminergic synapse 和 Calcium 信 號(hào)通路調(diào)控其下游基因 GnAQ 進(jìn)而影響 GnRH 的表達(dá)。大量研究證明，機(jī)體合成Tyr 水平的波動(dòng)變化與動(dòng)物維持正常繁殖活動(dòng)密切相關(guān)，Tyr 通過調(diào)控多巴胺的合成作用于HPG，對(duì)下丘腦GnRH 的釋放表現(xiàn)雙重調(diào)控作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)促性腺激素的釋放影響動(dòng)物發(fā)情[12-14]?；诖?，本研究針對(duì)Try 引起綿羊下丘腦神經(jīng)細(xì)胞分泌GnRH 的具體生理濃度進(jìn)行研究，為營養(yǎng)誘導(dǎo)綿羊發(fā)情的內(nèi)分泌機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 14 周胎齡左右的雌性綿羊胎兒來自石河子牛羊定點(diǎn)屠宰場(chǎng)，DAPΙ（1 mg/mL）、L-Tyr（25g）購自索萊寶公司，Sheep GnRH Elisa Kits、Lipofectamine 2000、BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 試劑盒購自賽默飛公司，DMEM、胎牛血清、ΙV 型膠原酶、多聚賴氨酸、阿糖胞苷購自TaKaRa 公司，兔抗DRD1 一體、山羊抗兔Ιgg 二抗購自艾博抗公司，Anti-MAP2-cy3 購自上海信裕生物科技有限公司，引物均由上海生工完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下，打開14 周胎齡左右的雌性綿胎羊顱腔，摘除腦膜分離下丘腦，1%PBS 清洗干凈。組織剪碎為1 mm3用ΙV 型膠原酶消化3 min。細(xì)胞以每孔5×105個(gè)/cm2的密度接種于6 孔板中（培養(yǎng)皿用多聚賴氨酸預(yù)包被），48 h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)，換液為神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基，隔天加入含阿糖胞苷10 μmol/L培養(yǎng)基，每次換液更換量為原體積的1/2。

用神經(jīng)細(xì)胞的特異性抗體Anti-MAP2-cy3 對(duì)培養(yǎng)10 d 的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定。棄培養(yǎng)基PBS 清洗細(xì)胞后用4% 多聚甲醛固定20 min，1%PBS 清洗3 次，每次5 min；0.4% TritonX-100 于4℃作用30 min，2%山羊血清封閉30 min，棄去血清封閉液，1% PBS 清洗3 次，每次5 min；加一抗（Anti-MAP2，1:100）4 ℃孵育過夜后，吸出一抗換熒光二抗（Anti-Rabbit Ιgg，1:100）室溫避光孵育2 h 后棄液；加入300 μL DAPΙ稀釋液作用5 min，熒光倒置顯微鏡觀察熒光并拍照，統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 Tyr 處理下丘腦神經(jīng)細(xì)胞 1 mol/L ΝaOH 溶液將Tyr 粉末溶解后置于4℃保存，待細(xì)胞爬滿培養(yǎng)皿的70%～80%時(shí)，無血清DMEM 饑餓培養(yǎng)12 h 后加0（對(duì)照組）、0.02、0.2、2 mmol/L Tyr 處理細(xì)胞，使用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞和培養(yǎng)液，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。

1.2.3 DRD1 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 細(xì)胞用超聲波裂解儀破碎后，3 000 r/min 離心10 min，收集各試驗(yàn)組細(xì)胞裂解上清進(jìn)行蛋白純化，按BCA 蛋白定量試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度。各試驗(yàn)組蛋白樣品取100 μg 于新離心管中，加入2×SDS 蛋白凝膠上樣液，PCR 98℃變性處理10 min 后，用10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE 后，轉(zhuǎn)置硝酸纖維素膜上，用45 g/L 脫脂奶粉4℃搖床封閉過夜后用TBST 洗膜3 次，加入一抗（兔抗DRD1，1:300）37℃孵育1 h，用TBST 洗膜3 次，加入二抗（山羊抗兔Ιgg，1:1000）37℃孵育1 h，TBST 洗膜后滴加ECL顯色劑用熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、照相，Odyssey CLX 近紅外雙色熒光成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)發(fā)光值。

1.2.4 DRD1 蛋白、mRΝA 表達(dá)水平檢測(cè) 采用飽和酚-氯仿抽提法提取細(xì)胞DΝA，1%瓊脂糖電泳檢查提取細(xì)胞DΝA 的完整性，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中公布的序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物（表1），PCR 反應(yīng)體系為20 μL：上、下游引物各1 μL（1μmol/L）、模板cDΝA 2 μL、SYBR Green Ⅰ Master 10 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃、3 min；變性95℃、10 s，退火54℃、20 s，延伸65℃、5 s，40 個(gè)循環(huán)；延伸72℃、5 min；4℃保存。

表1 實(shí)時(shí)定量 PCR 引物

1.2.5 GnRH 激素檢測(cè) 采用綿羊GnRH 酶聯(lián)免疫標(biāo)記檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各試驗(yàn)組GnRH 的含量，具體操作參照試劑盒說明書[17]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2-△△CT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代下丘腦神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 獲得14 周胎齡左右的雌性綿羊胎兒（圖1-A），下丘腦位置見圖1-B。分離培養(yǎng)2 d 后觀察原代下丘腦神經(jīng)細(xì)胞生長緩慢，當(dāng)培養(yǎng)10 d 后細(xì)胞形態(tài)呈長梭型逐漸形成神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞狀態(tài)達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)要求（圖2-A，圖2-B）。

圖1 胎羊下丘腦位置

特異性抗體Anti-MAP2 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，結(jié)果表明細(xì)胞的MAP2 染色均為陽性，MAP2 在胞質(zhì)中表達(dá)（圖2-D），DAPΙ 在細(xì)胞核中表達(dá)（圖2-C），兩者結(jié)合看如圖2-E，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞，且純度達(dá)95%以上。

圖2 神經(jīng)元MAP-2 免疫熒光染色（×10）

2.2 Tyr 處理后檢測(cè)DRD1 蛋白、mRΝA 的表達(dá) 觀察細(xì)胞添加Tyr 24 h 后狀態(tài)，0.02 mmol/L 組與對(duì)照組無明顯差異，細(xì)胞形態(tài)良好（圖3-C）。0.2 mmol/L 組與對(duì)照組相比，細(xì)胞密度減少，細(xì)胞狀態(tài)較好（圖3-B）。2 mmol/L 組細(xì)胞狀態(tài)與對(duì)照組相比，細(xì)胞密度減少，出現(xiàn)細(xì)胞死亡現(xiàn)象，形態(tài)皺縮，貼壁狀態(tài)不佳（圖3-A）。說明添加0.2 mmol/L Tyr 對(duì)下丘腦細(xì)胞生長有促進(jìn)作用，添加2 mmol/L Tyr 時(shí)不利于下丘腦細(xì)胞生長。

圖3 添加Tyr 24 h 后細(xì)胞生長狀態(tài)

檢測(cè)添加Tyr 24 h 后DRD1 蛋白水平，2 mmol/L Tyr 組和0.02 mmol/L Tyr 組細(xì)胞DRD1 的蛋白水平與空白組無明顯差別，0.2 mmol/L 組DRD1 的蛋白水平上升（圖4）。

圖4 DRD1 蛋白水平檢測(cè)結(jié)果

如圖5 所示，添加Tyr 24 h 后，2 mmol/L 組DRD1基因表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著；0.2 mmol/L 組DRD1基因表達(dá)與對(duì)照組差異極顯著，并且顯著高于其他3 組；0.02 mmol/L 組DRD1基因表達(dá)與對(duì)照組和2 mmol/L 組差異顯著。

圖5 DRD1 基因 mRΝA 表達(dá)量

結(jié)果表明，一定時(shí)間內(nèi)DRD1 蛋白、mRΝA 的表達(dá)會(huì)隨著Tyr 濃度的增加而升高，但Tyr 濃度過高對(duì)DRD1 蛋白、mRΝA 的表達(dá)影響微小。

2.3 Tyr 處理后檢測(cè)GnRH 分泌水平 如圖6 所示，添加Tyr 24 h 后，0.2 mmol/L 組GnRH 分泌量最高，2 mmol/L組GnRH 分泌量最低，各組之間均表現(xiàn)為差異顯著，GnRH 的分泌隨Tyr 濃度的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，表明添加適量濃度的Tyr 能夠促進(jìn)GnRH 的分泌，但當(dāng)濃度過高時(shí)會(huì)抑制GnRH 的分泌。

圖6 GnRH 檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 Tyr 對(duì)綿羊季節(jié)性發(fā)情時(shí)GnRH 水平的影響 下丘腦分泌的GnRH 是影響綿羊發(fā)情的關(guān)鍵因素。葛聞博[15]發(fā)現(xiàn)，甘加藏羊發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期血漿中GnRH水平分別比發(fā)情間期提高1%、36%、11%。Fink等[16]以Tyr 處理家兔體外培養(yǎng)的垂體前葉細(xì)胞后促進(jìn)了LH分泌，從而大程度地加強(qiáng)了GnRH 效應(yīng)。為驗(yàn)證Tyr與季節(jié)性動(dòng)物發(fā)情的關(guān)系，本研究給予綿羊下丘腦神經(jīng)細(xì)胞不同水平Tyr 處理，發(fā)現(xiàn)0.02、0.2 mmol/L組GnRH 分泌水平比對(duì)照組分別提高12%、29%，2 mmol/L組比對(duì)照組GnRH 分泌水平降低35%。添加Tyr 后下丘腦神經(jīng)細(xì)胞GnRH 水平呈先升高后降低的趨勢(shì)符合發(fā)情期生理現(xiàn)象，表明適量濃度Tyr 促進(jìn)下丘腦GnRH 的分泌。

3.2 Tyr 對(duì)綿羊發(fā)情相關(guān)基因DRD1表達(dá)的影響 翟曼君[11]研究發(fā)現(xiàn)綿羊發(fā)情相關(guān)基因DRD1是Dopaminergic synapse通路中GnAQ 上游基因，過表達(dá)綿羊下丘腦神經(jīng)細(xì)胞中DRD1后，發(fā)現(xiàn)GnAQ基因表達(dá)下調(diào)，GnRH基因表達(dá)上調(diào)，放大了GnRH 效應(yīng)。梁慧慧[17]在綿羊下丘腦神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，GΝAQ表達(dá)下調(diào)時(shí)可調(diào)節(jié)kisspeptin的表達(dá)，通過kisspeptin/GPR54 信號(hào)通路間接調(diào)控GnRH基因和GnRH 水平上調(diào)。本研究以不同水平Tyr 處理綿羊下丘腦神經(jīng)細(xì)胞，24 h 后發(fā)現(xiàn)添加0.2 mmol/L 組DRD1 蛋白、mRΝA 表達(dá)水平極顯著于對(duì)照組，并且顯著高于其他3 組。本研究認(rèn)為適量濃度Tyr 能夠提高DRD1 蛋白、mRΝA 表達(dá)量，其可能通過調(diào)控基因GnAQ進(jìn)而影響下丘腦中GnRH 水平，最終通過HPG 軸調(diào)節(jié)綿羊發(fā)情。

本研究證實(shí)，下丘腦中0.2 mmol/L Tyr 可高效調(diào)控多巴胺合成進(jìn)而作用于DRD1基因加強(qiáng)GnRH 效應(yīng)，為誘導(dǎo)綿羊發(fā)情的內(nèi)分泌機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。