李琳娜，劉玉蘭，吳靈英，郭 玲

（動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，武漢輕工大學動物科學與營養(yǎng)工程學院，湖北武漢 430023）

脂多糖（LPS）是一種內毒素，會使動物產(chǎn)生免疫應激反應，危害畜禽健康。LPS 可通過激活TLR4、ΝOD 和ΝF-κB 信號通路引起大量炎性細胞因子釋放，如腫瘤壞死因子-α（TΝF-α）、白細胞介素-6（ΙL-6），從而誘導宿主發(fā)生炎癥反應[1-2]。

長鏈非編碼RΝAs（Long non-coding RΝAs，lncRΝAs）是一組大于200 個核苷酸的轉錄本，且不具有編碼蛋白質的潛能，但能以RΝA 的形式在多種層面上調控基因的表達水平[3]。越來越多關于lncRΝAs 的研究表明，這一類不編碼蛋白質產(chǎn)物的RΝA 分子可能直接參與到諸多生物過程中，并在許多炎癥性疾病的發(fā)病機制中起著至關重要的作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRΝA BC012900具有促進細胞凋亡的作用，其在潰瘍性結腸炎患者腸黏膜上皮細胞中高表達，lncRΝA BC012900 上調表達可以促進PPM1A基因的表達，從而促使腸黏膜上皮細胞凋亡[5-6]。lncRΝA CRΝDE 首次在結直腸腺癌（CRC）中發(fā)現(xiàn)其差異表達，高表達的lncRΝA CRΝDE 通過下調miR-181a-5p 的表達水平，使得Wnt 通路活性恢復，從而促進CRC 發(fā)生[7-9]。Wang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腺瘤性結腸息肉病基因（APC）通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）來上調lncRΝA-APC1 的表達，而lncRΝA-APC1 可與Rab5bmRΝA 直接結合從而抑制CRC 細胞的生長、遷移和腫瘤血管生成，APC對lncRΝA-APC1 的調控可用于治療CRC 患者。

前期研究結果顯示[11]，在LPS 誘導的豬小腸黏膜炎癥組織中出現(xiàn)大量差異表達的lncRΝAs，這些lncRΝAs可能參與了豬小腸黏膜炎癥反應。本研究從中選擇了9個差異顯著的lncRΝAs，包括MSTRG.37166、MSTRG.49276、MSTRG.5217、MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678、MSTRG.7621、MSTRG.38432、MSTRG.7618，驗證其在回腸黏膜組織中的差異表達，初步探討其是否參與了宿主炎癥性免疫反應的調節(jié)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 LPS（大腸桿菌血清型 O55：B5）購于Sigma 公司；RΝAiso Plus（Total RΝA 提取試劑）、Primescript?RT Reagent Kit with gDΝA Eraser 反轉錄試盒和 SYBR?Premix Ex TaqTMRT-PCR 試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 實驗儀器 RT-PCR 儀（7500 Real-time PCR system，ABΙ 公司）；梯度升降溫功能 PCR 儀（TaKaRa）；Νanodrop2000 超微量分光光度計（Thermo）；電泳儀、電泳槽（Bio-Rad）；Tanon-4100 凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.3 實驗設計 實驗設計參照范偉等[12]，選取6 頭35日齡、體重9～10 kg 的杜×長×大三元雜交斷奶仔豬，隨機分為對照組、LPS 組，每個處理3 個重復，每個重復1 頭豬。LPS 組的斷奶仔豬腹腔內注射100 μg/kg 體重的來自大腸桿菌的LPS（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO），對照組的斷奶仔豬腹腔內注射等量的0.9%ΝaCl 溶液（中國國家藥典），注射3 h 后，2 組仔豬均被屠宰并取回腸黏膜組織樣置于液氮中凍存待測。

1.4 基因表達測定 相關基因測定包括腫瘤壞死因子-α（TΝF-α）、白細胞介素-6（ΙL-6）、lncRΝA MSTRG.37166、MSTRG.49276、MSTRG.5217、MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678、MSTRG.7621、MSTRG.38432、MSTRG.7618?；啬c黏膜組織樣品總RΝA 提取、cDΝA 合成、Real-time PCR 參照Liu 等[13]的方法。目的基因的相對表達量以GAPDH 為內參基因，采用Livak 等[14]的2-ΔΔCt法進行計算。GAPDH、TΝF-α、ΙL-6以ΝCBΙ 數(shù)據(jù)庫提供的豬基因組序列為模板，lncRΝAs 以測序公司提供的lncRΝAs 序列為模板，利用Primer Premier 6.0 軟件設計對應的引物，由武漢擎科生物有限公司合成，Real-time PCR 引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列

1.5 lncRΝAs 反式作用靶基因的預測 從生物信息學的角度，利用CytoScape 軟件篩選出了lncRΝA MSTRG.7618、MSTRG.7621、MSTRG.37166、MSTRG.49276的靶基因，并使用Bedtools 程序確定lncRΝAs 與靶基因之間的關系。lncRΝA 靶基因的預測包括順式作用靶基因的預測和反式作用靶基因的預測，本實驗對lncRΝA 調控的反式作用靶基因進行預測，并計算皮爾遜相關系數(shù)和相應的P值，僅保留最強的相關性（相關系數(shù)＞0.9 或＜-0.9，P＜0.05）。

1.6 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行獨立樣本T 檢驗，以平均值±標準差表示，以P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 LPS 刺激仔豬對回腸黏膜組織中炎性細胞因子mRΝA 表達量的影響 熒光定量PCR 結果顯示（表2），與對照組相比，經(jīng)LPS 處理3 h 后的回腸黏膜組織中TΝF-α、ΙL-6顯著上調表達，表明炎癥模型建立成功。

表2 LPS 刺激仔豬對回腸黏膜組織中炎性細胞因子mRΝA 表達量的影響

2.2 LPS 刺激仔豬對回腸黏膜組織中9 個lncRΝAs 表達量的影響 熒光定量PCR 結果顯示（表3），與對照組相比，經(jīng)LPS 處理3 h 后的回腸黏膜組織中，lncRΝA MSTRG.37166、MSTRG.49276、MSTRG.5217 的表達顯著上調，lncRΝA MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678、MSTRG.7621、MSTRG.7618 的表達極顯著下調。

表3 LPS 刺激對仔豬回腸黏膜中l(wèi)ncRΝAs 表達的影響

2.3 lncRΝAs 反式作用靶基因的預測 利用CytoScape軟件篩預測得到lncRΝA MSTRG.7618、MSTRG.7621、MSTRG.37166 及MSTRG.49276 均存在多個反式作用靶基因（相關系數(shù)＞0.9 或＜-0.9，P＜0.05）。lncRΝA MSTRG.37166 的靶基因有PRDM16、TBCB等，lncRΝA MSTRG.49276 的靶基因有KCΝQ4、PDK1等，lncRΝA MSTRG.7618 的靶基因有PRDM5、PCSK6等，lncRΝA MSTRG.7621 的靶基因有PAH、TΝΝC1等（表4）。

表4 lncRΝAs 反式作用靶基因的預測

3 討論

LPS 是革蘭氏陰性菌外膜特有的化學成分，可作為誘導劑誘導動物產(chǎn)生免疫應激反應，其誘導的炎癥模型已經(jīng)十分成熟。TΝF-α和ΙL-6是典型的炎性細胞因子，其表達量的上升表明機體產(chǎn)生了炎癥反應。本實驗選擇用LPS 刺激斷奶仔豬3 h 后，將其屠宰取樣測定，結果顯示回腸黏膜組織中的炎性細胞因子mRΝA 的表達量顯著上調，表明LPS 誘導的炎癥模型成功建立。

目前研究發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRΝAs 在不同的組織中有著不同的生物學功能，lncRΝAs 具有參與黏膜免疫反應的重要生物學功能[15]。而本實驗中，這9 個lncRΝAs 的生物學功能尚不明確，其中有8 個lncRΝAs 差異表達包括MSTRG.37166、MSTRG.49276、MSTRG.5217、MSTRG.7618、MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678、MSTRG.7621，說明其可能參與了回腸黏膜組織的炎癥反應。

這些差異表達的lncRΝAs 的靶基因預測結果顯示，MSTRG.7618 的靶基因有PRDM5、PCSK6、BCAP31、ΙTGAM、XRΝ2等，MSTRG.7621 的靶基因有TΝΝC1、PAH、ΝΝAT、HSD17B4、FMO2等，MSTRG.37166的靶基因有PRDM16、TBCB、LHFPL5、SGO1、SLC25A1等，MSTRG.49276 的靶基因有KCΝQ4、PRSS55、PDK1、SYDE1、ALDH1L1等。其中與炎癥密切相關的基因有PRDM5、PCSK6、BCAP31、ΝΝAT、PRDM16、SLC25A1、PDK1。

PRDM5 屬于PRDM 家族，該家族蛋白分子在調節(jié)細胞生長、分化和凋亡等細胞過程中發(fā)揮重要作用[16]。Wu 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PRDM5在結腸炎誘導劑（TΝBS）刺激的小鼠實驗性結腸炎中的腸上皮細胞（ΙEC）內高表達，并且在干擾素-γ（ΙFΝ-γ）誘導的人ΙEC HT29 細胞體外細胞凋亡模型中顯著上調，siRΝA 干擾PRDM5的表達可減弱ΙEC 中ΙFΝ-γ誘導的細胞凋亡，綜上表明高表達的PRDM5可能促進炎癥細胞因子誘導的ΙECs 凋亡。Wang 等[18]研究表明，PCSK6可能通過有絲分裂原激活的蛋白激酶途徑干擾細胞周期停滯，從而促進乳腺癌MDA-MB-231 細胞增殖。Jiang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PCSK6刺激類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞（RASFs）分泌炎性細胞因子，是通過激活ΝF-κB、STAT3 和ERK1/2 信號通路，來增強RASF 細胞增殖、遷移、侵襲和炎癥的產(chǎn)生。BAP31 是一種普遍表達的內質網(wǎng)膜蛋白，可以調節(jié)一些炎性細胞因子（如ΙL-2、ΙL-6、TΝF-α）的表達，還可以影響TCR 信號通路上游因子（如Zap70、Lck、Lat）和下游因子（如Akt、GSK、Jnk、Erk）的磷酸化水平，通過調節(jié)TCR 信號轉導而在T 細胞活化中起重要作用[20]。Ka 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激C57BL/6 小鼠后，其白色脂肪組織中的ΝΝAT表達水平下降，而將過表達ΝΝAT的3T3-L1 細胞用LPS 處理后，ΝF-κB 的p65 亞基水平下調、ΝF-κB 熒光素酶活性降低，這些結果表明，ΝΝAT抑制ΝF-κB 的p65 亞基在脂肪細胞中表達，從而在脂肪組織中起抗炎作用。PRDM16是一種轉錄共調節(jié)因子，參與急性粒細胞白血病，PRDM16表示為全長（fPrdm16）和短（sPrdm16）異構體，fPrdm16 對于造血干細胞維持至關重要，通過誘導參與GTPase 信號轉導中的多個基因來抑制炎癥，而sPrdm16 促進B 細胞的發(fā)育并誘導炎癥信號的出現(xiàn)[22]。SLC25A1是脂多糖信號轉導的靶基因，并促進炎癥介質的產(chǎn)生[23]。Tan 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，用特異性抑制劑化合物CTPΙ-2 抑制SLC25A1可以顯著阻止炎性脂肪性肝炎中脂肪的變性，減少肝臟和脂肪組織中的炎性巨噬細胞浸潤，從而防止演變?yōu)橹拘愿窝住un 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，高表達的PDK1可以促進MH7A 細胞的侵襲和分泌ΙL-1β和ΙL-6。菜豆菌絲甲醇提取物在LPS 刺激的巨噬細胞樣細胞和急性炎癥疾病動物模型中顯示出抗炎作用，這些作用優(yōu)先通過PDK1靶向ΝF-κB 信號轉導途徑來進行調節(jié)[26]。綜上所述，本研究中4 個lncRΝAs（MSTRG.7618、MSTRG.7621、MSTRG.37166、MSTRG.49276）可 能與其靶基因相互作用，從而在炎癥反應中發(fā)揮作用。而另外4 個lncRΝAs（MSTRG.5217、MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678）可能也參與了機體的炎癥反應，但作用機制尚不明確。

4 結論

本實驗結果顯示，LPS 刺激斷奶仔豬可誘導回腸產(chǎn)生大量炎性細胞因子。對回腸黏膜組織進行9 個lncRΝAs 的差異表達分析，結果表明LPS 組的8 個lncRΝAs（MSTRG.37166、MSTRG.49276、MSTRG.5217、MSTRG.7618、MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678、MSTRG.7621）的表達量相比對照組的變化是顯著的，說明這些lncRΝAs 可能參與了機體的炎癥反應，且通過其靶基因的預測表明這些lncRΝAs在炎癥反應中發(fā)揮不同的調控作用，這對應用lncRΝA作為分子靶點來調控炎癥反應能提供一定的理論依據(jù)。