龍 熙，孫文陽，柴 捷，王金勇，吳 玲，張廷煥*

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.綏江縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南昭通 657000）

miRΝA 是一類長18～22 nt 的在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)向調(diào)控靶基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼小RΝA，在細(xì)胞的增殖分化[1]、凋亡[2]、機(jī)體免疫[3]等方面發(fā)揮著十分廣泛的調(diào)控作用。miR-15b 位于染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4（StruCtural MaintenanCe of Chromosomes 4，SMC4）的編碼基因的第5 內(nèi)含子[4]，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生物學(xué)功能，如抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞[5]和神經(jīng)母細(xì)胞瘤[6]的增殖或促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖[7]、促進(jìn)[8]或抑制[9]細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)初始T 細(xì)胞向iTreg 細(xì)胞分化[10]、限制記憶性T 細(xì)胞的分化及細(xì)胞周期[11]、雙向調(diào)控CD8+T 淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答功能[12]、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的生長從而參與外周動脈疾病進(jìn)程[13]等。因此，miR-15b在細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞免疫應(yīng)答等方面均發(fā)揮著重要作用。

中國是豬肉生產(chǎn)大國，肉質(zhì)發(fā)育和疾病免疫應(yīng)答極大程度上決定著豬肉產(chǎn)量。到目前為止，miR-15b 在豬體內(nèi)的表達(dá)特征及生物學(xué)功能研究還未見報道，在C2C12細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制研究也寥寥無幾。因此，本研究探究miR-15b 在豬不同體組織及其在C2C12細(xì)胞系不同發(fā)育時期的表達(dá)特征，以期為明確miR-15b 在榮昌豬各組織中的表達(dá)差異及其在C2C12細(xì)胞增殖和分化過程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用的3 頭3 月齡健康無病榮昌豬選自重慶市榮昌區(qū)國家級榮昌豬保種場，樣品采集參考陳燦燦等[14]的方法。C2C12細(xì)胞由豬品種遺傳改良國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室保存；RΝA 提取試劑Trizol reagent、胎牛血清、馬血清、DMEM 培養(yǎng)基和低糖DMEM 培養(yǎng) 基購自GbiCo 公司（美國）；miSCript?ΙΙ RT Kit、miSCript?SYBR?Green PCR Kit 購自QΙAGEΝ 公司（德國）；吉木薩染色液購自Sigma 公司（日本）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)miBase 中豬源miR-15b（登錄號：MΙ0002419）的參考序列設(shè)計引物，與miR-15b配對的下游引物由miSCript?SYBR?Green PCR Kit 中自帶。以U6 基因作為內(nèi)參基因，利用Primer 5.0 設(shè)計U6 基因定量用引物，詳細(xì)信息見表1。所有引物均在蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 qPCR 擴(kuò)增用引物信息

1.3 RΝA 的提取與反轉(zhuǎn)錄 利用Trizol reagent 試劑分別提取3 頭榮昌豬的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、肌肉、胸腺和小腸組織的總RΝA，用ΝanoDrop 2000測定各總RΝA 的濃度及OD 值，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RΝA 的完整性。質(zhì)檢合格的各RΝA 濃度統(tǒng)一稀釋成200 ng/μL。隨后利用miSCript?ΙΙ RT Kit 將RΝA反轉(zhuǎn)錄成cDΝA。10 μL 反轉(zhuǎn)錄體系：5×miSCript Hi Flex 2 μL、10×miSCript ΝuCleiCs Mix 1 μL、miSCript Reverse TransCriptase Mix 1 μL、RΝase-free water 1 μL、總RΝA 5 μL（200 ng/μL）。反應(yīng)程序：37℃ 60 min、95℃ 5 min。cDΝA 產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)時熒光定量PCR 利用miSCript SYBR Green PCR Kit 在7900 HT fast real time PCR system 上進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，詳細(xì)操作參見試劑盒說明書。10 μL反轉(zhuǎn)錄體系：2×QuantiTeCt SYBR Green PCR Master Mix 5 μL、上游引物1 μL（10 μmol/L）、10×miSCript Universal Primer（10 μmol/L）1 μL、RΝase-free water 2 μL、cDΝA 1 μL。反應(yīng)程序：95℃ 15 min、94℃ 15 s、55℃ 30 s、70℃ 30 s，40 個循環(huán)，熔解曲線采用儀器默認(rèn)設(shè)置。

1.5 C2C12細(xì)胞增殖和成肌分化培養(yǎng) 利用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行C2C12細(xì)胞的增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%的CO2，37℃。顯微鏡下觀察增殖第0、2、4、6 天時C2C12細(xì)胞的生長情況，同時收集增殖第0、1、2、3、4、5 天和6 天的C2C12細(xì)胞用于miR-15b 表達(dá)量分析。利用含2%馬血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行C2C12細(xì)胞的成肌分化培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%的CO2，37℃。收集誘導(dǎo)分化后第0、1、2、3、4、5 天和6 天的C2C12細(xì)胞用于miR-15b 表達(dá)量分析，同時對誘導(dǎo)分化后第0、1、2、3、4、5 天和6 天的C2C12細(xì)胞進(jìn)行吉木薩染色，顯微鏡下觀察C2C12細(xì)胞的分化情況。

1.6 統(tǒng)計分析 采用2-ΔΔCt方法[15]計算miR-15b 的表達(dá)水平，并利用Excel 2007 中的T-test 檢驗(yàn)分析顯著性水平，以P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-15b 在豬不同組織中的表達(dá)特征分析 qPCR分析發(fā)現(xiàn)，miR-15b 在榮昌豬各組織中均有表達(dá)，在心臟和胸腺中的表達(dá)量較高，在肝臟和腎臟中的表達(dá)量較低。miR-15b 在胸腺表達(dá)量最高，肝臟表達(dá)量最低，兩者的差異倍數(shù)約為15（P＜0.05）。

圖1 miR-15b 在榮昌豬不同組織中的表達(dá)譜

2.2 miR-15b 在C2C12細(xì)胞增殖過程中的動態(tài)表達(dá)分析細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，C2C12細(xì)胞在接種早期增殖速度相對較慢，在第4 天時增殖速度明顯增快，基本鋪滿整個6 孔板，在第6 天時細(xì)胞數(shù)量基本與第4 天相同（圖2）。qPCR 分析發(fā)現(xiàn)，miR-15b 在C2C12細(xì)胞的整個增殖過程均有表達(dá)。在增殖的第1～3 天，miR-15b 表達(dá)量隨著培養(yǎng)時間的增加顯著升高，在第3～5 天達(dá)到最高值并趨于穩(wěn)定，第6 天又顯著降低（圖3）。

圖2 不同增殖時期的C2C12 細(xì)胞生長狀態(tài)

圖3 C2C12 細(xì)胞增殖過程中miR-15b 的動態(tài)表達(dá)分析

2.3 miR-15b 在C2C12細(xì)胞分化過程中的動態(tài)表達(dá)分析利用吉木薩染色液對分化時期的C2C12細(xì)胞進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)分化后的第1～4 天，C2C12分化程度較低，第5、6 天細(xì)胞的分化程度較高（圖4）。qPCR 分析發(fā)現(xiàn)，miR-15b 在C2C12細(xì)胞的整個分化過程中均有表達(dá)，并呈現(xiàn)先顯著升高再顯著降低的趨勢。在誘導(dǎo)分化的第1～4 天，miR-15b 表達(dá)量隨著時間增加顯著升高，在第5～6 天顯著降低（圖5）。

圖4 不同分化時期的C2C12 細(xì)胞狀態(tài)

圖5 C2C12 細(xì)胞分化過程中miR-15b 的動態(tài)表達(dá)分析

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b 可通過負(fù)向調(diào)控DEDD 的表達(dá)來防止CD8+T 細(xì)胞凋亡，也可通過調(diào)控細(xì)胞增殖和抗凋亡信號通路中的相關(guān)基因CCΝD2、CCΝD1和ΙGF1R來促進(jìn)小鼠脾臟中B 細(xì)胞的增殖[16]，表明miR-15b 在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要功能。本研究發(fā)現(xiàn)miR-15b 在胸腺、脾臟和肺等免疫相關(guān)的組織中表達(dá)量都較高，這與前人研究[16]結(jié)果相一致，同時也提示miR-15b 可能通過調(diào)控CCΝD2、CCΝD1、ΙGF1R等基因在豬胸腺、脾臟和肺等免疫相關(guān)組織中發(fā)揮生物學(xué)功能。Hitoo 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在新生大鼠的心肌細(xì)胞中，miR-15b 可以通過靶向Arl2基因來降低心肌細(xì)胞中的ATP 水平和減少線粒體損傷，繼而減少心肌細(xì)胞的凋亡，表明miR-15b 可能有助于心臟發(fā)育。本研究所用實(shí)驗(yàn)樣本為3 月齡榮昌豬，此時心臟也處于快速發(fā)育期，miR-15b 在榮昌豬心臟組織中高表達(dá)，這一結(jié)果也正好與Hitoo 等[17]的研究結(jié)果相互印證。Li[18]等研究發(fā)現(xiàn)，抑制肥胖小鼠體內(nèi)miR-15b 的表達(dá)可以增強(qiáng)其胰島素的敏感性，表明miR-15b 可能在肝臟中發(fā)揮抑制胰島素敏感性的功能，因此正常個體肝臟中miR-15b 的表達(dá)量較低，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-15b 在榮昌豬肝臟組織中表達(dá)量較低，這正好與Li[18]等研究結(jié)果相一致?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b 可通過活化Akt/mTOR 信號通路和失活JΝK 酶防止人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞凋亡[19]、通過靶向抑制BCl2加速小鼠腎小球膜細(xì)胞凋亡[20]、通過靶向Sema3A 抑制足細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[21]，但是這些生物學(xué)過程均是在機(jī)體遭受高糖應(yīng)激時發(fā)生，并未有研究證實(shí)miR-15b 與正常的腎臟細(xì)胞生物學(xué)功能有關(guān)，提示miR-15b 在正常豬腎臟中可能發(fā)揮的生物學(xué)功能較少。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)miR-15b 在榮昌豬腎臟組織中低表達(dá)，這與先前的研究結(jié)果[19-21]相一致。鑒于miR-15b 在豬免疫相關(guān)組織以及心臟中的生物學(xué)功能，后續(xù)可以通過觀察在分離培養(yǎng)的胸腺、脾臟等免疫相關(guān)組織的淋巴細(xì)胞中干擾或過表達(dá)miR-15b后細(xì)胞的表型及miR-15b 靶基因變化情況驗(yàn)證miR-15b在豬體內(nèi)的生物學(xué)功能。

miR-15b 參與調(diào)控了細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，包括抑制或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。但miR-15b 對機(jī)體中正常細(xì)胞增殖的影響還未見報道。C2C12細(xì)胞為小鼠肌肉前體細(xì)胞，而肌肉為豬研究中的一個重要經(jīng)濟(jì)性狀，因此，本實(shí)驗(yàn)選取C2C12細(xì)胞為正常細(xì)胞代表進(jìn)行相關(guān)研究。通過對C2C12細(xì)胞增殖過程中細(xì)胞數(shù)量變化的研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12細(xì)胞增殖的前4 d，miR-15b 的表達(dá)量隨著細(xì)胞的增殖而增加，當(dāng)細(xì)胞增殖停滯后，miR-15b 的表達(dá)量趨于平衡并逐漸顯著降低，表明miR-15b 在C2C12細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，而非抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b 促進(jìn)細(xì)胞增殖主要靶向的基因和通路有BCL2[7]、HPSE2[22]、DYΝLT1/Caspase-3/Caspase-9[23]和Axin2[24]等，因此推測，miR-15b 可能通過靶向BCL2、HPSE2、DYΝLT1/Caspase-3/Caspase-9 和Axin2促進(jìn)了C2C12細(xì)胞的增殖，但這仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Myklebust[25]及Ofir[26]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子E2F 能夠直接調(diào)控細(xì)胞周期蛋白CyClins D1 與CyClin E1 的起始轉(zhuǎn)錄，并且抑制miR-15b 的表達(dá)，miR-15b 又可抑制細(xì)胞周期蛋白CyClins D1 與CyClin E1 的表達(dá)，因此三者之間形成一個正反饋調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在C2C12細(xì)胞增殖的第6 天（第4 天基本鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)板），miR-15b 的表達(dá)量顯著降低，可能原因就是細(xì)胞增殖過程中需要大量的細(xì)胞周期蛋白CyClins D1 與CyClin E1，因此會表達(dá)大量的轉(zhuǎn)錄因子E2F，繼而啟動了這一正反饋調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致了miR-15b 的表達(dá)量出現(xiàn)顯著降低。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果正好與Myklebust[25]及Ofir[26]的結(jié)果相一致，后續(xù)可通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以揭示miR-15b 在C2C12細(xì)胞增殖過程中的具體作用機(jī)制。

Vimalraj 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b 可通過間接調(diào)控Runx2 蛋白促進(jìn)成骨細(xì)胞分化；Lv 等[28]報道，miR-15b 可通過抑制TET3基因的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化；Yuan 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b 可通過靶向CCΝE1 蛋白使粒細(xì)胞停滯在G0/G1 期并促進(jìn)粒細(xì)胞的終末分化；董培越[30]研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b 可通過抑制FoxO1促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞的分化。以上研究均表明，miR-15b 對細(xì)胞分化具有重要促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12細(xì)胞分化早期，miR-15b 的表達(dá)量隨細(xì)胞的分化而升高，表明miR-15b 對C2C12細(xì)胞的早期分化具有促進(jìn)作用，這與前人的研究結(jié)果[28-30]一致，也提示miR-15b 可能在C2C12細(xì)胞的早期分化中通過靶向Runx2、TET3、CCΝE1和FoxO1等基因發(fā)揮作用。下一步可通過研究過表達(dá)或抑制C2C12細(xì)胞分化過程中miR-15b 的表達(dá)后相關(guān)細(xì)胞表型及靶基因的變化情況來進(jìn)行驗(yàn)證。Zhao 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b 可通過抑制對肌纖維分化以及成肌調(diào)節(jié)因子具有重要調(diào)節(jié)功能的STED3 蛋白的表達(dá)來抑制C2C12細(xì)胞的成肌分化。而本研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b 在C2C12細(xì)胞的成肌分化早期表達(dá)量顯著升高，表明miR-15b 的功能是促進(jìn)C2C12細(xì)胞的成肌分化，這與Zhao[31]等的研究結(jié)果截然相反。但是在C2C12細(xì)胞分化后期，miR-15b 的表達(dá)量顯著降低，表明miR-15b 也可能會抑制C2C12細(xì)胞的晚期分化。這提示，miR-15b 在C2C12細(xì)胞成肌分化的不同時期可能發(fā)揮著截然不同的功能，后續(xù)可通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)對此存在爭議之處進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)miR-15b 在榮昌豬心臟和胸腺中高表達(dá)，在肝臟和腎臟中低表達(dá)，在C2C12細(xì)胞增殖過程中高表達(dá)，分化過程表達(dá)量先升高后降低。本研究結(jié)果為明確miR-15b 在榮昌豬各組織中的表達(dá)特征以及其在C2C12細(xì)胞增殖和分化過程中的生物學(xué)功能奠定了理論基礎(chǔ)。