袁 雪 袁 濤 劉少丹

(1.北京林業(yè)大學園林學院 國家花卉工程技術研究中心 城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室 林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室 花卉種質創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室 北京 100083； 2.洛陽國際牡丹園 洛陽 471011)

牡丹(PaeoniaSect.Moutan)是芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)植物的統(tǒng)稱，原產中國，觀賞價值高。絕大多數(shù)牡丹品種每年僅春季開花一次，單株花期約7～10天?；ㄆ诙潭惺悄档さ膱@林應用中亟待解決的問題之一。原產溫帶的木本植物有一年多次開花現(xiàn)象，如常春二喬玉蘭(Magnoliasoulangeana‘Changchun’)(蔣政等， 2019)、紫薇(Lagerstroemiaindica)(孫曉萍等， 2016)、海棠‘雪球’(Malus‘Snowdrift’)(劉嘉儀， 2017)等。許多牡丹品種有秋發(fā)現(xiàn)象，部分品種春秋兩季都可開花(陳新露， 2000)，培育一年多次開花品種是解決牡丹花期短而集中的方向之一。

赤霉素(GA)能夠全部或部分代替低溫打破植物芽體休眠(Chandleretal.， 1994； Pharisetal.， 1985)。赤霉素的種類較多，其中GA3在實際生產中被廣泛使用，尤其是在牡丹冬季溫室催花中廣泛應用。試驗證明，GA3具有有效促進芽體休眠解除，提早開花、促進枝葉生長，提高催花成花率、增大花徑等作用(張秀新， 2004； 任小林等， 2004； 張文娟， 2005； 遲東明等， 2007)。一年多次開花牡丹當年分化的花芽能不經冬季低溫自然萌動并二次開花； GA3處理也被證明能夠促進牡丹秋季開花(王榮， 2007； 全璨璨， 2009)。

真核生物中DNA甲基化(DNA methylation)對基因表達有重要的調控作用。植物DNA甲基化模式的改變可以影響植物的花期、育性、花葉形態(tài)發(fā)育等重要生命活動。Finnegan等(1998)認為，DNA去甲基化可促進提早開花，且這一作用與DNA甲基化水平的降低成正比，低溫和去甲基化促進開花的作用是加性的。李波等(2015)和王子成等(2009)的研究也有類似結果： 降低DNA甲基化水平可促進植物芽體休眠的解除、提前萌發(fā)和開花； 張濤等(2018)還發(fā)現(xiàn)，誘導牡丹DNA甲基轉移酶基因PsDRM表達水平下降和DNA去甲基化酶基因PsROS1表達水平增加以降低DNA甲基化水平，可能是外施GA3促進牡丹芽休眠解除的作用方式之一。

本文以洛陽地區(qū)穩(wěn)定的一年二次開花牡丹品種‘戶川寒’(Paeoniasuffruticosa‘Togawakan’)為研究對象，對春季正常開花后的植株在秋季(9月中旬)進行脫葉及赤霉素(GA3)、赤霉素抑制劑多效唑(PP333)處理，觀察處理后植株形態(tài)變化、測定花芽萌動過程中激素及糖分含量變化、分析基因組DNA甲基化敏感擴增多態(tài)性(methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP)，以探究牡丹秋季開花過程中赤霉素和DNA甲基化的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在河南洛陽以露地栽培、無病蟲害、開花正常、長勢優(yōu)良的40株10年以上生‘戶川寒’為試驗材料?！畱舸ê癁槿毡酒贩N，在洛陽于4月、11月二次開花，花單瓣型，深紅色，雌雄蕊正常(圖1)。

1.2 田間處理

2019年9月將同年度4月自然開花后常規(guī)養(yǎng)護的試驗材料進行分組及處理，每組10株，處理及采樣時間見表1。

表1 試驗處理及采樣時間①Tab.1 The schedule of experimental treatment and sampling

1)對照： 無脫葉、無藥劑處理。

2)處理A： 2019年9月16日，全株脫葉(人工摘除全部葉柄及葉片)。

3)處理B： 2019年9月16日，全株脫葉； 9月19日開始，連續(xù)3天(9月21日為止)每天用650 mg·L-1GA3(分析純，源葉生物科技有限公司，上海)水溶液浸濕的脫脂棉包裹全株所有芽處理1次。

4)處理C： 2019年9月16日，全株脫葉； 9月19日開始，連續(xù)3天(9月21日為止)每天用500 mg·L-1PP333(分析純，北京華越洋生物科技有限公司，北京)水溶液浸濕的脫脂棉包裹全株所有芽處理1次。

1.3 試驗期間氣溫

如圖2， 2019年洛陽從6月初至9月中旬，除3次短時間大幅度的氣溫變化外，最高氣溫穩(wěn)定在30 ℃左右，最低氣溫20 ℃以上； 9月中旬后最高氣溫逐漸降至30 ℃以下，最低氣溫降至15 ℃左右，并保持下降趨勢，9月下旬至10月上旬最高氣溫下降至20 ℃左右，最低氣溫降至10 ℃左右； 10月中旬出現(xiàn)最高氣溫小低谷(16 ℃)，之后氣溫短暫回升后持續(xù)下降，至12月2日，最低氣溫降至0 ℃以下(https:∥weather.com/zh-CN/weather/today)。

圖2 試驗期間日最高氣溫與最低氣溫Fig. 2 The daily maximum and minimum temperatures during the experiment

1.4 激素含量測定

2019年9月至10月，分別按表1采樣日期于9:00—11： 00，在各試驗組隨機選取枝條上部3枚長勢健壯的芽(去除芽鱗后儲存)或3個萌動后新生花蕾及葉片，標記后-80 ℃保存。酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)測定激素(GA3、GA4、ABA、IAA)含量，每樣本設定3個生物學重復。具體操作參照Zhao等(2006)，略有改動。

1.5 可溶性糖和淀粉含量測定

與激素含量測定樣品采集方式、時間相同，用蒽酮比色法測定糖類指標(可溶性糖、淀粉)，方法參照李合生(2000)，略有改動。

1.6 DNA甲基化敏感多態(tài)性分析

1)接頭和引物準備 MSAP分析采用的接頭序列、預擴增引物見表2，選擇性擴增引物組合見表3。接頭和引物均由Thermo scientific(上海)公司合成。試驗所用KAPA Taq HotStart擴增試劑購自TaKaRa(大連)公司, T4 DNA連接酶購自New England Biolabs(北京)公司、限制性內切酶購自Thermo Fisher Scientific(上海)公司。

表2 MSAP接頭序列和預擴增引物序列Tab.2 MSAP adapters sequences and pre-amplification primer sequences

表3 MSAP選擇性擴增引物序列Tab.3 MSAP selective amplification primer sequences

2)酶切連接 取2 μL 10× T4 Buffer，1 μL E接頭，1 μL M接頭，0.41 μLEcoRⅠ，0.3 μLMseⅠ，0.3 μL T4 DNA連接酶，4樣品DNA，加ddH2O補齊至15 μL，在37 ℃下酶切12 h，產物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)預擴增 PCR反應體系20 μL，包括2 μL 10×BufferⅠ，0.8 μLEcoRⅠ預擴增引物(10 mmol·L-1)，0.8 μLHpaⅡ/MspⅠ預擴增引物(10 mmol·L-1)，1.8 μL dNTP(10 mmol·L-1)，0.2 μL Hs Taq酶(5 U·μL-1)，2 μL酶切連接產物，12.4 μL ddH2O； PCR反應程序設定為95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)； 72 ℃ 5 min； 產物15 ℃保存。

4)選擇性擴增 反應體系20 μL，包括2 μL 10×Buffer I，0.8 μLEcoRⅠ選擇性擴增引物(10 mmol·L-1)，0.8 μLHpaⅡ/MspⅠ選擇性擴增引物(10 mmol·L-1)，1.8 μL dNTP(10 mmol·L-1)，0.2 μL Hs Taq酶(5 U·μL-1)，2 μL酶預擴增產物，12.4 μL ddH2O； PCR反應程序設定為95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)； 72 ℃ 5 min； 產物15 ℃保存。

5)3730XL測序儀(ABI公司，美國)檢測 96孔板中每孔加入ROX-1200分子量內標(北京閱微基因技術有限公司，北京)和甲酰胺混合液(體積比0.5∶8.5)9 μL，PCR產物1.0 μL。95 ℃變性3 min，上機檢測。

6)將檢測得到的原始數(shù)據文件導入到Genemapper4.0中分析。導出結果后Excel制表。

分別用EcoRⅠ/HpaⅡ、EcoRⅠ/MspⅠ組合對樣品基因組DNA酶切后，得到的樣品DNA甲基化狀態(tài)可分為4種模式：

模式Ⅰ(無甲基化： DNA雙鏈上的CCGG位點未發(fā)生甲基化)，EcoRⅠ+HpaⅡ 和EcoRⅠ+MspⅠ酶切都有帶，記為1，1(1表示有帶，0表示無帶)；

模式Ⅱ(半甲基化： DNA雙鏈中僅一條單鏈上CCGG位點甲基化)，EcoRⅠ+HpaⅡ酶切有帶，而EcoRⅠ+MspⅠ酶切無帶，記為1，0；

模式Ⅲ(全甲基化： DNA雙鏈上的CCGG序列中內側CG位點處于全甲基化狀態(tài))，EcoRⅠ+HpaⅡ酶切無帶，而EcoRⅠ+MspⅠ酶切有帶，記為0，1；

模式Ⅳ(全甲基化： DNA雙鏈上CCGG位點外部胞嘧啶甲基化或DNA雙鏈內外胞嘧啶都甲基化)，EcoRⅠ+HpaⅡ 和EcoRⅠ+MspⅠ酶切都無帶，記為0，0。

模式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ DNA 甲基化狀態(tài)根據單個DNA樣品電泳結果即可檢測，而檢測模式Ⅳ甲基化狀態(tài)則需比較2個或多個DNA 樣品甲基化差異。

2 結果與分析

2.1 芽萌動率及形態(tài)變化

牡丹‘戶川寒’能夠穩(wěn)定于一年春秋二次正常開花，但秋季芽萌動極不整齊且花期晚(11月上旬)，同株上不同萌動和發(fā)育期的芽并存(圖3)，萌動晚的花芽形成花蕾后若遭遇低溫，即使花器官已分化完全也不能開放。

圖3 同一時間同株牡丹‘戶川寒’花芽的不同發(fā)育狀態(tài)Fig. 3 Different developmental states of P. suffruticosa ‘Togawakan’ flower buds on the same plants at the same time對照組同株花芽發(fā)育不整齊。0-3號為休眠芽， 2020年春季開花； 4-9號花芽已萌動， 2019年11月陸續(xù)開花。2019年11月5日攝于洛陽國際牡丹園。In the control group, flower buds in different developmental states appeared in one plant. No. 0-3 were dormant buds, which flowered in spring in 2020. The buds of No. 4-9 have begun to burst and flower successively in November 2019. All figures were taken on Nov. 5, 2019 in the Luoyang International Peony Garden.

牡丹‘戶川寒’4個試驗組都有芽萌動、開花(圖4)，花型正常，胚珠、花藥外觀正常。對照組萌動慢，10月18日自然萌動(自然落葉后)，11月27日陸續(xù)進入花期。處理B萌動最快且開花最早，11天(9月27日)萌動率達81.4%，17天(10月3日)已100%萌動，并于42天(10月28日)進入初花期。處理A開花時間及最終萌動率與處理C相似，但在早期萌動更快(圖4、圖5)。

圖4 不同處理芽的萌動率Fig. 4 Sprouting rate of different treatments誤差線表示標準差(n=3)，同一時期不同字母表示在P<0.05水平差異顯著(單因素ANOVA檢驗)。下同。Error bars indicate SD(n=3), and the different letters for each day indicate significant differences at P<0.05(one-way ANOVA with post-hoc Duncan’s test). The same below.

圖5 不同處理對芽萌動的影響Fig. 5 The effect of different treatments on sprouting圖中葉柄示意留存葉片，9月16日對處理A、B、C全株脫葉(當日照片攝于脫葉前)。9月16日后僅對照尚留葉片，10月10日后植株自然落葉，不再有葉片。處理B 9月27日開始萌動，處理A 10月3日開始萌動，處理C 10月10日開始萌動，對照11月7日才開始萌動。各組萌動后逐漸成花。The petiole in the figure shows the retained leaves. On September 16, treatment A, B and C were defoliated for the whole plant (the photos were taken before defoliation on the same day). Therefore, after September 16, leaves were left only in the control; after October 10, the plant naturally defoliated, no more leaves were left. Treatment B burst from September 27, treatment A burst from October 3, treatment C burst from October 10, and the control did not burst until November 7. Flowers gradually developed after bursting in each group.

2.2 芽(或花)的發(fā)育情況

與芽萌動相呼應，處理B萌動最快且萌動率最高，芽(芽萌動后為花蕾)直徑和長度最早出現(xiàn)大幅度增加，17天(10月3日)起直徑和長度都明顯大于其他組，到42天(10月28日)初花期時，花蕾平均直徑為(1.9±0.1)cm，花枝平均長度為(22.7±1.8)cm。處理A萌動早于處理C，芽(花蕾)直徑方面，處理C在21天(10月10日)后顯著大于處理A(圖6A)； 而芽(花蕾)長度方面，處理A與處理C差異始終不顯著(圖6B)。

圖6 不同處理對芽(花蕾)發(fā)育的影響Fig. 6 The effect of different treatments on the bud growth

2.3 芽體內激素含量變化

如圖7所示，牡丹‘戶川寒’4個試驗組GA3、GA4含量變化趨勢相似。脫葉(9月16日)使得芽體內GA3、GA4含量在短時間內降低，但在11天(9月27日)驟升并于17天(10月3日)時達到最大值后迅速降低(處理A)。外施GA3(9月21日處理結束)使芽體內由于脫葉造成的低水平GA3、GA4含量逐漸升高，至24天(10月3日)時達到最大值(處理B)。說明脫葉后的短時間內，芽體內GA3、GA4含量降低，但之后迅速增加，脫葉后施加GA3能加大芽體內GA3、GA4增長強度并延長增長時間。施加PP333也使脫葉造成的低水平GA3、GA4含量升高，但升幅遠小于施加GA3的處理； 在處理一段時間后2種激素含量都有不同程度降低(低于僅脫葉的處理A)。說明脫葉后施加PP333能在短時間內使芽體內GA3、GA4含量增加，但隨后可能會抑制GA合成。

圖7 不同處理對芽體內激素水平的影響Fig. 7 The effect of different treatments on the phytohormone contents in buds

脫葉(處理A)使牡丹‘戶川寒’ABA含量相較對照明顯下降，但在后期(10月18日起)含量上升超過對照。外施GA3在短時間內使芽體內ABA含量降低更劇烈，并維持低水平狀態(tài)直至24天(10月10日)。施加PP333會使ABA含量出現(xiàn)驟升后下降。

對照組在3天(9月19日)時，IAA含量升高，6天(9月22日)時含量降低且一直維持低水平； 處理A使IAA含量下降，除3天時有大幅上升外，始終保持在較低水平直至42天(10月28日)； 施加GA3(處理B)延緩了IAA含量的持續(xù)降低，但后期IAA含量仍上升； 施加PP333(處理C)使IAA含量增加并始終高于對照和處理A。

2.4 芽體內淀粉和可溶性糖含量變化

由圖8可知，對照組試驗過程中可溶性糖含量增加而淀粉含量減少。3個處理組可溶性糖含量變化趨勢在試驗前期大致相同，都在11天(9月27日)達到含量的小高峰，而后迅速降低，在17天(10月3日)達到小低谷，其后處理A、處理B含量先上升后下降，而處理C則一直保持下降趨勢。在試驗前期3個處理組淀粉含量變化趨勢大致相同，11天之前各組含量都相對穩(wěn)定，僅有小幅升高或降低，17天時大幅降低分別達到各組最小值，之后處理A、C淀粉含量先上升后下降，而處理B含量上升后基本保持穩(wěn)定； 到42天(10月28日)，3個處理組淀粉含量相對1天(9月17日)時都有不同程度降低。

圖8 不同處理對芽體內可溶性糖和淀粉含量的影響Fig. 8 The effect of different treatments on the contents of soluble sugar and starch in buds

2.5 DNA甲基化敏感多態(tài)性分析

2.5.1 GA3對開花過程中甲基化水平的影響 試驗共選用3個EcoRⅠ和6個HpaⅡ/MspⅠ 選擇性擴增引物構成的10個引物組合(表3)，對牡丹‘戶川寒’秋季試驗樣品利用MSAP檢測分析其DNA甲基化狀態(tài)。

結果如表4所示。不同時期不同處理均檢測到2 330個CCGG位點，平均每個引物組合檢測到的甲基化位點數(shù)為233個?？傮w來看，脫葉后(1天)處理組DNA半甲基化水平相較對照明顯升高，之后逐漸降低； 而處理組與對照組完全甲基化水平呈現(xiàn)與其半甲基化水平相反的變化趨勢，使得處理組總甲基化水平與對照組相差較小。施加GA3(6天)后，處理B相對處理A半甲基化水平降低，但仍高于對照，而完全甲基化水平升高，但低于對照； 施加PP333(6天)后，處理C與處理A半甲基化、完全甲基化水平都基本保持同步變化，二者差異較??； 4組總體甲基化水平相近。處理B萌動率達50%以上時(11天)，其半甲基化率達到最小值(9.4%)，但仍高于對照且低于其他2個處理組； 其完全甲基化率和總甲基化率均達到最大值(61.8%、71.2%)，且高于其他3組。處理C萌動率達50%以上時(32天)，其半甲基化率(11.5%)低于其他3組而完全甲基化率(46.9%)和總甲基化率(66.7%)均高于其他3組。

2.5.2 GA3對秋季開花過程中甲基化模式的影響 10對引物在各處理不同時期的樣本中共擴增產生4種模式，進一步可分為16個亞類。表5至表8分別為對照不同時期及處理A、處理B、處理C相對對照1天時各時期的甲基化模式變化統(tǒng)計。表中模式A為甲基化狀態(tài)未發(fā)生變化的位點，包括4個亞類； 模式B為與對照1天相比甲基化水平下降的位點，即這些位點發(fā)生了去甲基化(demethylation)，包括5個亞類； 模式C為與對照1天相比甲基化水平上升的位點，即這些位點發(fā)生了超甲基化(hypermethylation)，包括5個亞類； 模式D是與對照1天相比甲基化水平變化無法確定的位點，即不定型，包括2個亞類。

對比表5與表6、表7、表8，對照組各時期模式A位點比例較高(61.8%～70.4%)，而處理組模式A位點比例僅3天時為63.3%，其余各時期不足60%； 另一方面，對照組和處理組甲基化狀態(tài)為不定型(即模式D)的位點比例較低(對照僅1.2%～1.5%，處理組為1.5%～2.4%)； 說明處理組甲基化比對照組甲基化變化更活躍，集中在去甲基化(模式B)和超甲基化(模式C)。

試驗開始后，牡丹‘戶川寒’對照DNA去甲基化位點數(shù)逐漸升高，3、6、11、17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點數(shù)分別為275、342、317、348、335、373、410，分別占總位點數(shù)的11.8%、14.7%、13.6%、14.9%、14.4%、16.0%、17.6%； 發(fā)生超甲基化的位點數(shù)先升高，17天以后降低，17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點數(shù)分別為508、473、439和435，分別占總位點數(shù)的21.8%、20.3%、18.8%和18.7%(表5)。

處理A在0天脫葉，1天后去甲基化位點數(shù)開始增加，1、3、6、11、17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點數(shù)分別為527、454、440、471、468、489、451和626，分別占總位點數(shù)的22.6%、19.5%、18.9%、20.2%、20.1%、21.0%、19.4%和26.9%，均高于對照相應時期去甲基化的位點數(shù)； 發(fā)生超甲基化的位點數(shù)先升高，17天以后降低，17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點數(shù)分別為608、541、538和468，分別占總位點數(shù)的26.1%、23.2%、23.1%和20.1%(表6)。

處理B 0天脫葉，5天外施GA3處理，處理后去甲基化位點數(shù)總體曲折上升，6、11、17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點數(shù)分別為485、439、467、433、485和501，分別占總位點數(shù)的20.8%、18.8%、20.0%、18.6%、20.8%和21.5%，均高于對照相應時期發(fā)生去甲基化的位點數(shù)(表7)。

處理C在0天脫葉，5天外施PP333處理，處理后去甲基化位點數(shù)除11天時驟升至605外，其余時期總體保持緩慢增加趨勢，6、11、17、24、32、42天發(fā)生去甲基化的位點數(shù)分別為481、605、445、476、534和428，分別占總位點數(shù)的20.6%、26.0%、19.1%、20.4%、22.9%和18.4%，均高于對照相應時期發(fā)生去甲基化的位點數(shù)(表8)。

3 討論

研究表明，牡丹二次開花與GA關系密切。周華(2015)分析轉錄組數(shù)據，認為GA途徑與光周期途徑、春化途徑共同參與誘導牡丹‘海黃’秋季二次開花。PP333是園藝作物常用的GA合成抑制劑，有控制營養(yǎng)生長(潘瑞熾， 2012)、影響植物的光合作用、呼吸作用、礦質營養(yǎng)代謝、碳水化合物的代謝與分配、延緩植物衰老等生理效應(宋海鳳等， 2015； 呂雙慶等， 2005)。

3.1 脫葉、激素與秋季開花

GA3能有效解除牡丹芽體休眠，提早開花、促進枝葉生長，提高成花率和切花品質、增大花徑、促進牡丹二次開花等(任小林等， 2004； 張秀新， 2004； 張文娟， 2005； 遲東明等， 2007)； GA4能促進植物芽體休眠解除(Rinneetal.， 2011； 溫璐華等， 2015)，ABA能抑制開花，較高濃度的IAA能夠促進開花，內源激素對芽體休眠的影響是以激素平衡為標準的(陳新露， 2000； 張秀新， 2004)。因此，本研究對不同處理GA3、GA4、ABA及IAA含量進行了測定與分析。

牡丹‘戶川寒’能夠穩(wěn)定于一年春秋二次正常開花，但秋季芽萌動極不整齊且花期晚(11月上旬)，同株上不同萌動和發(fā)育期的芽并存(圖3)，萌動晚的花芽形成花蕾后若遭遇低溫，即使花器官已分化完全也不能開放； 本試驗不僅促進了花芽萌動且提高了萌動整齊度(圖4)。僅脫葉、脫葉后施GA3、脫葉后施PP333都促進了‘戶川寒’秋季較快較整齊地萌芽和生長，各處理組開花進程依次為： 脫葉后施加GA3組>脫葉組>脫葉后施加PP333組。說明秋季脫葉促進了芽萌動和生長，施加GA3則疊加促進效應，PP333會部分抵消脫葉的促進效應。脫葉發(fā)揮了短時間對GA3、GA4含量的抑制作用后，芽內GA3、GA4的含量升高而ABA含量下降，施加GA3后加強了GA3、GA4含量升高和ABA含量下降的強度，且延長了GA3、GA4含量上升期，而施加PP333表現(xiàn)出相反的作用； 此外，試驗后期對照組開花時GA3、GA4含量升高而ABA下降。Xue等(2018)認為外施GA3能使植株通過外源吸收和自身內源合成的方式積累GA3，從而抑制ABA功能，使牡丹品種‘紫羅蘭’二次開花。本試驗結果也支持這一論斷。

3.2 可溶性糖、淀粉與秋季開花

可溶性糖與淀粉都屬于非結構性碳水化合物(non-structural carbohydrate, NSC)，是植物生長過程中重要的能量供應物質和植物參與碳吸收與消耗的重要指標(Lietal.， 2002； Raessleretal.， 2010)。一方面，外施赤霉素和脫葉使NSC重新分配誘導牡丹開花(Xueetal.， 2019)，另一方面，多效唑在牡丹及其他植物中也被證明能夠使NSC含量增加(黃睿， 2007； 張華等， 2018)。在一些植物中，淀粉轉化為可溶性糖被認為是開花的影響因素之一(鄭國生等， 2009； 高志民， 2007； 曲波等， 2010)。在本試驗中，芽萌動前各試驗組可溶性糖含量明顯上升，而萌動后一段時間內淀粉和可溶性糖大量消耗，說明芽萌動前需高濃度可溶性糖以滿足萌芽時的消耗。

3.3 DNA甲基化與秋季開花

DNA甲基化水平的改變在植物生長發(fā)育過程中起著調控重要功能基因表達、基因組防御以及細胞發(fā)育與分化等方面的重要作用。一般認為，過度甲基化會阻礙轉錄因子復合體與DNA結合從而抑制基因的表達，而去甲基化則有利于基因表達(Richards， 1997； Lukensetal.， 2007)。因此，研究不同處理下牡丹秋季萌動開花過程中DNA甲基化的狀態(tài)變化，有助于從基因層面揭示牡丹秋季萌動開花與不同處理間的聯(lián)系。本研究中，試驗開始時牡丹‘戶川寒’都還處于生長期(未落葉)，處理組于9月16日(0 d)時進行人工脫葉，對照組10月中旬自然落葉，之后自然萌動(圖5)，即幾乎不經歷休眠期，‘戶川寒’在落葉后新芽萌動生長。MSAP檢測結果顯示，在整個試驗期間‘戶川寒’DNA總甲基化的變化范圍為57.3%～72.4%，開始萌動前達到DNA甲基化的最高水平，之后逐漸下降。這與蓋樹鵬等(2012)研究低溫解除牡丹品種‘魯荷紅’(P.suffruticosa‘Luhehong’)休眠過程中的發(fā)現(xiàn)相似： 在低溫18天時(內休眠解除)DNA甲基化水平升至最高，之后下降。說明內休眠解除時植株體內的分子調控發(fā)生了重大變化，推測DNA甲基化可能是參與調控牡丹芽體萌動的關鍵因素。

前人研究認為低溫促進植物成花可能是通過調控DNA去甲基化實現(xiàn)的(Or， 2009； Lízaletal.， 2001； 蓋樹鵬等， 2012)； 藍莓(Vacciniumcorymbosum)芽休眠解除和萌發(fā)可能也與基因組去甲基化使得基因組甲基化水平降低有關(李波等， 2015)。由于本試驗涉及處理和時期較多，故僅以對照1天時的甲基化狀態(tài)為基準，比較牡丹‘戶川寒’各處理不同時期甲基化狀態(tài)。結果發(fā)現(xiàn)，處理組甲基化狀態(tài)變化更活躍，集中在去甲基化(模式B)和超甲基化(模式C)。各處理組去甲基化率隨時間推移增加，且都高于對照組同一時期的去甲基化率。處理組芽萌動和發(fā)育快，萌動率和開花整齊度高，說明牡丹‘戶川寒’萌動開花可能受DNA去甲基化調控。

4 結論

牡丹‘戶川寒’能夠在秋季自然萌動開花，脫葉能促進內源GA3合成，結合外施GA3的疊加效應，體內GA3增加并抑制ABA，促進其秋季提前萌動二次開花，且花期整齊，外施PP333一定程度抵消了脫葉引起的內源GA3的合成促進作用。芽從萌動到開花伴隨著大量糖類物質消耗，高濃度的可溶性糖含量可能有利于芽的萌動。牡丹‘戶川寒’可自我調控相關DNA序列 CG 位點的甲基化狀態(tài)，從而誘導其花芽在秋季萌動，施加處理可能會提前觸發(fā)這一調控過程，其中DNA去甲基化率高更可能促進秋季萌動、開花。