郇曉雪，劉曉宇*，房樂(lè)，杜傳印，李廣強(qiáng)，耿超，李向東，田延平

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東濰坊煙草公司，山東 濰坊 261061；3.棗莊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村事業(yè)發(fā)展中心，山東 棗莊 277899）

煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）是豇豆花葉病毒科（Comoviridae）線蟲(chóng)傳多面體病毒屬（Nepovirus）代表種［1，2］，1927年首次發(fā)現(xiàn)于美國(guó)。目前TRSV已在50多個(gè)國(guó)家發(fā)生，是我國(guó)公布的二類(lèi)進(jìn)境檢疫有害生物［3］。其粒子為球形，基因組含兩條線形正義ssRNA，其中RNA1編碼復(fù)制酶，RNA2編碼運(yùn)動(dòng)蛋白（MP）和外殼蛋白（CP）［4，5］。

TRSV寄主范圍廣泛，能夠侵染大豆（Glycine max）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）以及煙草（Nicotiana tabacum）等54科300多種植物［6－9］，可通過(guò)種子、嫁接以及介體傳播。TRSV的傳播介體包括美洲劍線蟲(chóng)（Xiphinema americanum）［10－12］、煙薊馬（Thrips tabaci）、煙草跳甲（Epitrix hirtipennis）、蚜蟲(chóng)（Myzus persicae）等［13－15］。張滿良等［16］報(bào)道了TRSV在渭北地區(qū)煙草上的危害，證明該病毒可通過(guò)蚜蟲(chóng)和種子傳播，但不同煙草品種的種子帶毒率有差異。種子和無(wú)性繁殖材料是TRSV遠(yuǎn)距離傳播的重要方式［17］。2003—2008年我國(guó)2次在進(jìn)口大豆中檢測(cè)到TRSV［18］。2007年聞偉剛等［19］從美國(guó)進(jìn)口大豆中檢測(cè)到TRSV。2009、2010年文朝慧等［20，21］分別在荷蘭蘿卜種子和番茄種子中檢測(cè)到TRSV。

TRSV的準(zhǔn)確檢測(cè)是對(duì)檢疫工作的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。血清學(xué)方法和RT－PCR方法是鑒定該病毒的重要手段［22］。但血清學(xué)檢測(cè)存在一定的不足，雖然絕大多數(shù)TRSV分離物具有相同的血清學(xué)關(guān)系，但發(fā)現(xiàn)至少存在4種具有不同血清學(xué)關(guān)系的株系，而且TRSV與該屬亞組的馬鈴薯黑環(huán)斑病毒存在血清學(xué)相關(guān)性［14］。IC－RT－PCR結(jié)合了血清學(xué)和RT－PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，但血清學(xué)上的交叉反應(yīng)和潛在的錯(cuò)檢漏檢也給TRSV準(zhǔn)確檢測(cè)帶來(lái)隱患。李桂芬等［23］研制的DAS－ELISA試劑盒檢測(cè)純化病毒靈敏度為15.625 ng／mL。對(duì)種子等病毒含量低的植物材料，利用該方法可能存在漏檢情況。煙草種子可攜帶TRSV，但利用ELISA方法不能準(zhǔn)確檢測(cè)出種子帶毒情況［16］。

RT－PCR是檢測(cè)植物病毒應(yīng)用最為廣泛的方法之一，在新發(fā)病毒或無(wú)特異性抗體的病毒檢測(cè)中的作用尤為突出。楊翠云等［24］利用膠體金免疫層析試紙結(jié)合RT－PCR方法建立了TRSV檢測(cè)方法，靈敏度與DAS－ELISA類(lèi)似。魏梅生等［25］建立了磁免疫層析試紙條方法檢測(cè)TRSV，檢測(cè)提純病毒靈敏度為1μg／mL。楊偉東［26，27］、鄭耘［28］等建立的基于RT－Realtime PCR、IC－RTRealtime PCR以及DB－RT－Realtime PCR檢測(cè)方法，靈敏度分別為0.5 ng、25 ng和2 500 ng葉組織。易汪雪等［29］建立了單管實(shí)時(shí)熒光RTPCR，可檢測(cè)到的大豆種子中的TRSV濃度為0.35 pg／mL。應(yīng)淑敏、張吉紅［30，31］等利用LAMP檢測(cè)TRSV，靈敏度為普通RT－PCR的10倍。郭立新等［32］研究發(fā)現(xiàn)RT－LAMP檢測(cè)靈敏度與常規(guī)RT－PCR技術(shù)靈敏度相當(dāng)。以上表明引物的特異性、擴(kuò)增條件等因素影響擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度。

建立高靈敏度和特異性的檢測(cè)體系是防控TRSV的重要保障。該技術(shù)在新冠病毒核酸檢測(cè)篩選新冠病毒陽(yáng)性患者過(guò)程中起了舉足輕重的作用［33］。本研究對(duì)引物特異性、退火溫度及dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，以期建立針對(duì)TRSV的RT－PCR檢測(cè)體系，為準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)TRSV提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物為攜帶煙草環(huán)斑病毒的普通煙株，在溫室中培養(yǎng)。溫度為22℃，光照16 h，黑暗8 h。

1.2 RT－PCR引物設(shè)計(jì)

NCBI（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）上獲取目前已知的全部煙草環(huán)斑病毒共20個(gè)全基因組序列（截至2021年1月17日），利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析，獲得煙草環(huán)斑病毒基因組中保守區(qū)域，在序列保守區(qū)域內(nèi)利用軟件Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)特異性引物［34］（表1）。

表1 本研究所用引物

1.3 植物總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

將新鮮或超低溫保存的攜帶煙草環(huán)斑病毒的煙草葉片樣品迅速轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽內(nèi)，充分研磨后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的2.0 mL離心管中，加入1.0 mL TransZol（TransGen Biotech），具體提取步驟參考TransZol說(shuō)明書(shū)。提取的RNA 保存－80℃?zhèn)溆谩?/p>

利用Scandrop儀器測(cè)定RNA濃度：取500 ng植物總RNA，移至RNase free PCR管中，加入50 ng隨機(jī)引物，加水至10μL，70℃條件下變性10 min后迅速在冰上靜置2 min。在上述PCR管中加入4μL 5×M－MLV Buffer（TaKaRa），1μL 10 mmol／L dNTPs，0.5μL RNase Inhibitor（TaKa-Ra），0.5μL RTase M－MLV，4μL RNase free ddH2O。30℃預(yù)處理10 min后，42℃反應(yīng)1 h，75℃10 min終止反應(yīng)，獲得的cDNA用于后期PCR擴(kuò)增。

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer 2.0μL、dNTPs（2.5 mmol／L）1.0μL、F引物0.5μL、R引物0.5μL、Taq DNA聚合酶（TaKaRa）0.3μL、模板cDNA 1.0μL，ddH2O補(bǔ)齊到20μL。PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s（退火溫度參考表1），72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳（120 V 30 min），溴化乙錠（EB）染色，凝膠成像系統(tǒng)觀測(cè)電泳結(jié)果并拍照保存。

1.5 擴(kuò)增條件優(yōu)化和靈敏度檢測(cè)

為了獲得最佳的擴(kuò)增效果，依次對(duì)退火溫度和dNTPs、引物以及Taq DNA聚合酶最佳工作濃度進(jìn)行優(yōu)化。退火溫度設(shè)置成8個(gè)梯度：45、46、48、51、53、55、58、60℃；在獲得最佳退火溫度的基礎(chǔ)上，對(duì)dNTPs工作濃度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置10個(gè)dNTPs濃度梯度：0.010、0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175、0.200、0.225 mmol／L；進(jìn)一步將引物終濃度設(shè)置成7個(gè)梯度：0.03、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50μmol／L；在以上優(yōu)化的PCR條件基礎(chǔ)上，將Taq DNA聚合酶終濃度設(shè)置成10個(gè)梯度：0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.055 U／μL，最終獲得最優(yōu)的擴(kuò)增條件。

在靈敏度試驗(yàn)過(guò)程中，利用超微量分光光度計(jì)（Scandrop）測(cè)定提取的病葉總RNA濃度，分別取1 200.00、300.00、90.00、30.00、9.00、3.00、0.90、0.30、0.09 ng和0.03 ng植物總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄總體系為10μL。利用優(yōu)化后的條件進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物的篩選

針對(duì)TRSV基因組的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)6對(duì)特異性引物，以感病植株cDNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，6對(duì)特異性引物都能從感染TRSV的病株中擴(kuò)增出特異性目的條帶，不同引物對(duì)的擴(kuò)增結(jié)果差異明顯（圖1）。1－1F／1－1R引物末端保守性高，且GC含量相對(duì)較低，非特異性結(jié)合少，所以選擇擴(kuò)增結(jié)果相對(duì)較好的1－1F／1－1R進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 RT－PCR檢測(cè)體系建立和優(yōu)化

對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果（圖2A）表明，在設(shè)定的溫度范圍內(nèi)，引物對(duì)1－1F／1－1R均能擴(kuò)增出特異性目的條帶，表明引物具有較好的特異性，退火溫度對(duì)擴(kuò)增影響不大，后續(xù)研究選擇53℃。

對(duì)dNTPs濃度進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果（圖2B）表明，不同dNTPs濃度下均能擴(kuò)增出特異性目的條帶，但在大于0.075 mmol／L時(shí)，擴(kuò)增效果最佳。

對(duì)引物終濃度進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果（圖2C）表明，當(dāng)引物終濃度小于0.20μmol／L或大于0.30 μmol／L時(shí)出現(xiàn)微弱的非特異性條帶，引物終濃度為0.30μmol／L時(shí)擴(kuò)增效果最佳。

對(duì)Taq DNA聚合酶終濃度進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果（圖2D）表明，當(dāng)Taq DNA聚合酶終濃度大于0.035 U／μL時(shí)，均具有較好的擴(kuò)增效果。

圖2 RT－PCR檢測(cè)體系的建立和優(yōu)化

根據(jù)篩選獲得的條件，最終將擴(kuò)增條件確定為退火溫度53℃、dNTPs終濃度為0.075mmol／L、引物終濃度為0.30μmol／L、Taq DNA聚合酶終濃度為0.035 U／μL。

2.3 RT－PCR檢測(cè)體系靈敏度測(cè)定

分別取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.0μL（起始植物總RNA量的1／10）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，當(dāng)TRSV病毒RNA總量大于等于0.090 ng時(shí)，引物對(duì)1－1F／1－1R可檢測(cè)出TRSV（圖3）。

圖3 TRSV RT－PCR檢測(cè)體系靈敏度測(cè)定

3 討論與結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了不同特異性引物對(duì)，并優(yōu)化了TRSV的RT－PCR檢測(cè)體系。結(jié)果表明，針對(duì)TRSV基因組RNA1設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)1－1F／1－1R擴(kuò)增效果最佳。在退火溫度53℃、dNTPs終濃度0.075 mmol／L、引物終濃度0.30μmol／L、Taq DNA聚合酶終濃度0.035 U／μL時(shí)擴(kuò)增效果最佳。感病植物總RNA量為0.090 ng時(shí)仍可檢測(cè)到TRSV，表明優(yōu)化后的檢測(cè)體系具有較高的靈敏度。

通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系中引物、擴(kuò)增條件等的優(yōu)化，可以顯著提高檢測(cè)的靈敏度。閆志勇等［35］構(gòu)建的RT－PCR體系能夠從50 ng植物葉片（0.05 ng病毒RNA）中成功擴(kuò)增到目的片段。本研究建立的檢測(cè)體系能夠從0.090 ng植物總RNA中檢測(cè)到TRSV目的片段，具有很好的靈敏度和特異性。研究結(jié)果對(duì)準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)TRSV和切斷病毒傳播途徑具有重要意義。