余道道 孫敬起 霍唐燃 趙云鵬 劉思彤,,?

沸石載體恢復(fù)受饑餓影響厭氧氨氧化菌的性能研究

余道道1孫敬起2霍唐燃2趙云鵬2劉思彤1,2,?

1.北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源學(xué)院, 深圳 518055; 2.北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 100871; ?通信作者, E-mail: liusitong@pku.edu.cn

利用沸石良好的吸氨能力和微生物載體功能, 將受饑餓影響的厭氧氨氧化菌在含沸石的反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行活性恢復(fù), 研究沸石對長期饑餓影響下厭氧氨氧化菌恢復(fù)過程中菌群活性及結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明, 經(jīng)過 82 天的運行, 沸石反應(yīng)器和對照反應(yīng)器(無沸石添加)內(nèi)厭氧氨氧化菌均獲得恢復(fù)。沸石反應(yīng)器的脫氮效率從第 59 天開始與對照反應(yīng)器拉開差距, 運行第 82 天時, 沸石反應(yīng)器中氮去除負(fù)荷(NRR)為 177.8 mgN/(L·d), 顯著大于對照反應(yīng)器 (154.3mgN/(L·d))。利用 16SrRNA 高通量測序方法, 對反應(yīng)器內(nèi)菌群的微生物組成與功能進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)投加沸石載體使得恢復(fù)后的厭氧氨氧化菌的豐度更高, 可以更好地促進(jìn)受饑餓抑制的厭氧氨氧化菌的恢復(fù)。

厭氧氨氧化菌; 沸石; 細(xì)菌恢復(fù); 群落結(jié)構(gòu)

厭氧氨氧化是在厭氧條件下, 以氨為電子供體, 亞硝酸鹽為電子受體, 將氨氧化成氮氣的生物過程。與傳統(tǒng)的生物脫氮方法相比, 厭氧氨氧化具有氮去除負(fù)荷高、污泥產(chǎn)量低以及無需外加碳源等優(yōu)點[1], 受到學(xué)者們的普遍關(guān)注。然而, 由于厭氧氨氧化菌生長速度極慢, 倍增時間長, 因此其培養(yǎng)過程極其緩慢[2–3]。更重要的是, 在反應(yīng)器長期運行之后, 如果種泥保存不當(dāng), 使污泥處于饑餓狀態(tài), 活性會受到更大的影響。因此, 研究長期受饑餓影響厭氧氨氧化菌的有效恢復(fù)策略具有重要的意義。

目前, 恢復(fù)受饑餓影響厭氧氨氧化菌活性的措施主要有改變進(jìn)水負(fù)荷、投加中間產(chǎn)物 N2H4以及添加陶粒或彗星狀纖維材料等載體。候曉幫等[4]采用 4 種方式(正常負(fù)荷、降低負(fù)荷、投加 N2H4和投加 NH2OH)復(fù)活厭氧氨氧化菌, 發(fā)現(xiàn)降低負(fù)荷或投加 N2H4是快速恢復(fù)厭氧氨氧化菌活性的有效方法。楊開亮等[5]采用以彗星狀纖維材料為載體(特點是利用中間的小珠將纖維固定起來, 兩端呈放射狀)的序批式反應(yīng)器(sequencing batch reactor, SBR), 對停止運行 100 天的反應(yīng)器中厭氧氨氧化菌進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。結(jié)果表明, 生物膜的形成可增強(qiáng)厭氧氨氧化菌的活性, 縮短恢復(fù)周期, 恢復(fù)后厭氧氨氧化菌的脫氮性能良好。但是, 這些方法都存在不足之處: 外源添加藥品增加成本, 且 N2H4有劇毒、極不穩(wěn)定; 采用陶粒或彗星狀纖維材料等載體存在成本高、恢復(fù)過程漫長等問題。因此, 本研究擬用一種高效吸附 NH4+-N、經(jīng)濟(jì)成本低且環(huán)境友好的材料——沸石, 通過底物吸附耦合生物降解的模式, 對受饑餓影響的厭氧氨氧化菌進(jìn)行恢復(fù)。

沸石是分布在自然界中的硅酸鹽礦物, 內(nèi)部具有豐富的多孔結(jié)構(gòu), 孔體積可達(dá)自身體積的一半, 比表面積高達(dá) 400~1000m2/g, 能提供多個吸附活性位點[6]。沸石具有良好的離子吸附性及交換性, 尤其對 NH4+-N 的吸附性能良好[7]。Miladinovic 等[8]發(fā)現(xiàn)表面有生物膜的沸石比普通沸石脫氮效果好, 沸石生物膜上的硝化作用可以協(xié)同沸石的離子交換作用共同去除 NH4+-N。Qiu 等[9]分別以陶瓷、沸石和碳酸鹽為填料, 研究 3 種曝氣生物濾池(biological aerated filter, BAF)的性能, 發(fā)現(xiàn)沸石 BAF 和碳酸鹽 BAF 的 NH4+-N 去除效率比陶瓷顆粒 BAF 高, 且抗沖擊能力更好。Yapsakli 等[10]利用沸石吸附和生物降解相結(jié)合的方法去除廢水中 NH4+-N, 原理是將微生物的代謝作用與沸石的 NH4+-N 吸附作用耦合, 通過沸石吸附與解吸附 NH4+-N 離子的功能, 為厭氧氨氧化反應(yīng)提供 NO2?-N 與 NH4+-N 之比相對穩(wěn)定的進(jìn)水, 促進(jìn)廢水中 NH4+-N 的去除?，F(xiàn)有研究多以沸石為載體來促進(jìn)廢水中 NH4+-N 的去除, 鮮有研究利用沸石促進(jìn)受饑餓影響厭氧氨氧化菌的恢復(fù)。我們通過比較在反應(yīng)器內(nèi)加入和不加沸石兩種情況下長期受饑餓影響厭氧氨氧化菌的活性恢復(fù)情況, 利用 16S rRNA 高通量測序, 探究恢復(fù)過程中菌群變化規(guī)律, 為沸石用于恢復(fù)受饑餓影響厭氧氨氧化菌的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗裝置

實驗裝置由進(jìn)水系統(tǒng)、曝氣系統(tǒng)、反應(yīng)器主體、出水系統(tǒng)、水浴循環(huán)系統(tǒng)以及自控系統(tǒng)組成, 反應(yīng)器有效容積為 5L。通過時間控制器控制反應(yīng)器的進(jìn)水、攪拌、沉降與出水階段的時間。兩個反應(yīng)器頂部均有硅膠墊圈, 以此隔絕氧氣。在反應(yīng)器底部放置轉(zhuǎn)子, 并通過控制磁力攪拌器進(jìn)行攪拌。為了保證厭氧氨氧化菌所需的恒溫條件, 反應(yīng)器外層設(shè)有溫度控制在 37±0.5oC 的水浴夾層。其中一個反應(yīng)器為不加沸石的對照, 另一個反應(yīng)器底部放入一個自制三層沸石架(圖 1)。沸石架由 3 只定制不銹鋼架焊接而成, 單只架外圈直徑為 11cm, 高 5cm。將每只不銹鋼架網(wǎng)面的中間掏空, 從而使攪拌過程中厭氧氨氧化菌與沸石充分接觸。網(wǎng)面被掏空的部分呈圓形, 內(nèi)圈直徑為 4cm, 沸石架高約 18cm, 沸石反應(yīng)器內(nèi)的沸石添加量約為 100g/L。整個沸石反應(yīng)器裝置如圖 2 所示。

1.2 實驗廢水和接種污泥

反應(yīng)器進(jìn)水采用人工模擬廢水, 其物質(zhì)組成如表 1 所示。進(jìn)水前, 用 N2/CO2(95%/5%)對人工模擬廢水進(jìn)行曝氣, 除去水中的溶解氧, 并將進(jìn)水 pH 控制在 6.8~7.2。

反應(yīng)器接種的是放置在室溫中試反應(yīng)器內(nèi)、在NH4+-N 和 NO2?-N 濃度接近 0mg/L 的污水中饑餓長達(dá) 88 天的厭氧氨氧化污泥。接種后, 各反應(yīng)器內(nèi)混合液揮發(fā)性懸浮固體(mixed liquor volatile suspended solid, MLVSS)的濃度均為4500 mg/L。

1.3 反應(yīng)器運行和水質(zhì)檢測方法

對照反應(yīng)器和沸石反應(yīng)器共運行 82 天, 第 1~10天為啟動階段, 第 11~30 天為負(fù)荷提升階段, 第 31~82 天為穩(wěn)定運行階段。反應(yīng)器啟動初期, 兩個反應(yīng)器進(jìn)水的 NH4+-N 和 NO2?-N 濃度均保持在 50±5 mg/L。在負(fù)荷提升階段結(jié)束以前, 當(dāng)連續(xù) 3 個水力停留時間(hydraulic retention time, HRT)反應(yīng)器出水中 NO2?-N 濃度都穩(wěn)定在 5mg/L 以下時, 通過提高進(jìn)水 NH4+-N 和 NO2?-N 濃度的方式來提升反應(yīng)器進(jìn)水氮負(fù)荷。當(dāng)進(jìn)水的 NH4+-N 和 NO2?-N 濃度提高至 200mg/L 左右時, 即負(fù)荷提升階段結(jié)束后, 不再繼續(xù)提高進(jìn)水中 NH4+-N 和 NO2?-N 的濃度, 改為通過縮短 HRT 的方式來加大反應(yīng)器進(jìn)水的氮負(fù)荷。在穩(wěn)定運行階段末期, 兩個反應(yīng)器的 HRT 均由最初的 24 小時 縮短至 8 小時。

圖1 裝滿沸石的沸石架

圖2 沸石反應(yīng)器裝置示意圖

表1 合成廢水的組成

每天取兩個反應(yīng)器的進(jìn)出水進(jìn)行水質(zhì)檢測分析。在反應(yīng)器運行的 3 個階段, 分別取兩個反應(yīng)器內(nèi)懸浮態(tài)污泥樣品以及沸石反應(yīng)器內(nèi)沸石表面附著態(tài)污泥樣品, 用于分析胞外聚合物(extracellular po-lymeric substance, EPS)和微生物的組成結(jié)構(gòu), 樣品采集時間和編號如表 2 所示。

使用梅特勒 FE20 型 pH 計測定 pH 值, 使用雷磁 JPB-607A 型便攜式溶解氧儀測定溶解氧。氨氮(NH4+-N)、亞硝酸鹽氮(NO2?-N)、硝酸鹽氮(NO3?- N)、總氮(total nitrogen, TN)和 MLVSS 等指標(biāo)均按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法[11]測定。

表2 對照反應(yīng)器及沸石反應(yīng)器污泥樣品編號

說明: “?”表示反應(yīng)器運行的第1天, 無附著態(tài)污泥。

1.4 EPS 提取及測定

EPS 是特定環(huán)境條件下細(xì)菌代謝分泌的、包裹在細(xì)胞壁外的高分子聚合物, 主要由蛋白質(zhì)(protein, PN)和多糖(polysaccharide, PS)構(gòu)成[12]。EPS 是顆粒污泥快速形成與維持穩(wěn)定的關(guān)鍵因素之一[13], 厭氧氨氧化污泥中的 EPS 含量越大, 污泥顆粒穩(wěn)定性越強(qiáng)。本研究采用熱提取法[14]提取 EPS。取 0.5mL 厭氧氨氧化污泥, 靜置 20 分鐘后去除上清液。用0.05%NaCl 溶液將樣品定容至 10mL, 將混合液放入 60oC 水浴中加熱 30 分鐘。在 10000rpm 的轉(zhuǎn)速下將混合液離心 15 分鐘, 吸取上清液, 并用 0.45μm濾膜過濾, 即可得到 EPS 提取液。采用快速 Lowry法蛋白質(zhì)試劑盒測定 EPS 中 PN 含量, 采用蒽酮硫酸比色法測定 EPS 中 PS 含量[15]。采用標(biāo)準(zhǔn)重量法測定可揮發(fā)性懸浮固體濃度(volatile suspended solids, VSS)[11], 利用公式: (測得 PN/PS 濃度×提取液體積)/VSS, 將 PN 與 PS 含量相加, 即得最終 EPS濃度, EPS 中 PN 和 PS 以每克 VSS 中的蛋白和多糖含量計算。

在整個 82 天的運行周期中, 采集并測定第 1天、第 15 天、第 30 天、第 45 和第 82 天共 5 個時間點的污泥樣本。由于測定 EPS 需至少 3 個平行樣, 每個平行樣取 0.5mL 菌樣, 而起始階段沸石反應(yīng)器內(nèi)采集到的附著態(tài)污泥過少(低于 1.5mL), 故只測定對照反應(yīng)器內(nèi)懸浮樣及沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮污泥的EPS含量。

1.5 DNA 提取、聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)及Illumina測序

采用試劑盒法提取污泥中的 DNA, 所用的試劑盒為 FastDNA? SPIN Kit for Soil 土壤 DNA 快速提取試劑盒, 采用瓊脂糖凝膠電泳對 DNA 提取情況進(jìn)行檢驗。提取出的 DNA 樣品置于?20oC 冰箱內(nèi)冷凍保存。利用細(xì)菌通用引物 338F (ACTCCTACGGGA GGCAGCAG)和 806R (GGACTACHVGGGTWTCTA AT)[16]對合格的 DNA 樣品進(jìn)行 16S rRNA 基因在V3~V4 可變區(qū)的高通量測序(Illumina Miseq 2000, 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。測序深度指數(shù)為 Coverage, 每個樣品測 40000~70000 條序列, 樣品覆蓋度均在 99.8%以上。通過 Miseq 測序得到的雙端測序 reads, 按照重疊關(guān)系進(jìn)行拼接, 將測序獲得的原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾, 得到高質(zhì)量序列, 然后進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)的聚類分析, 并通過 RDP classifier 貝葉斯算法, 在 97%的相似水平上對 OTU 進(jìn)行物種分類學(xué)注釋(80%置信度)?；?OTU 數(shù)據(jù), 進(jìn)行物種分類學(xué)分析, 分析樣品的多樣性和菌群結(jié)構(gòu)。通過每個OTU 對應(yīng)的 greengene id, 獲得 OTU 對應(yīng)的 clusters of orthologous groups of proteins (COG)家族信息和KEGG orthology(KO)信息, 并計算各 COG 的豐度和 KO 豐度。根據(jù) COG 數(shù)據(jù)庫的信息, 可以從 Egg NOG 數(shù)據(jù)庫中解析得到各個 COG 的描述信息和功能信息, 從而得到 COG 功能豐度譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)器的脫氮性能

兩個反應(yīng)器進(jìn)出水的 NH4+-N, NO2?-N和NO3?-N濃度變化見圖 3(a)和(b), TN去除率及氮去除負(fù)荷(nitrogen removal rate, NRR)變化見圖 3(c)和(d)。在反應(yīng)器的啟動階段, 兩個反應(yīng)器進(jìn)水 NH4+-N 和NO2?-N 濃度均為 50±5mg/L, HRT 設(shè)置為 24 小時。兩個反應(yīng)器出水中 NH4+-N 和 NO2?-N濃度均呈下降趨勢。啟動階段末期(第 9 天), 對照反應(yīng)器的出水 NH4+-N 降至 11.9mg/L, 沸石反應(yīng)器的出水 NH4+-N 降至 10.2mg/L; 兩反應(yīng)器的出水NO2?-N 均降至 0mg/L。對照反應(yīng)器和沸石反應(yīng)器的 NRR 分別為18.6mgN/(L·d)和 18.12mgN/(L·d), 無明顯差別。在負(fù)荷提升階段(第 11~30 天), 厭氧氨氧化菌的脫氮活性迅速提升, TN 去除率呈直線增長, NRR的增長速率也比啟動階段有一定程度的提高。由圖 3(c)可以看出, 在負(fù)荷提升階段, 兩個反應(yīng)器的 TN 去除率曲線基本上重合。第 11~15 天, TN 去除率由 75%上升至 84%, 第 16~30 天, TN 去除率穩(wěn)定在 80%± 3%。兩個反應(yīng)器的 NRR 從第 11 天的 26.5mgN/ (L·d)增加到第 30 天的 73 mgN/(L·d)。

在穩(wěn)定運行階段(第 31~82 天), 厭氧氨氧化菌的脫氮活性開始穩(wěn)定, 此時沸石反應(yīng)器的穩(wěn)定性及脫氮性能開始高于對照反應(yīng)器。特別是當(dāng) HRT 由12 小時 縮短為 8 小時(第 59 天), 兩反應(yīng)器的 TN 去除率均呈斷崖式下降, 對照反應(yīng)器下降 42.3%, 沸石反應(yīng)器下降 39.1%。兩反應(yīng)器的 NRR 下降幅度不大, 對照反應(yīng)器下降 25.64mgN/(L·d), 沸石反應(yīng)器僅下降 17.08mgN/(L·d)。由此看出, 在反應(yīng)器內(nèi)部受到較大沖擊時(突然縮減 HRT 等), 沸石反應(yīng)器具有更好的穩(wěn)定性。TN 去除率的顯著下降可能是由于過早地縮短 HRT, 使進(jìn)水中 TN 超出反應(yīng)器的TN 去除負(fù)荷, 導(dǎo)致在出水時, 反應(yīng)器內(nèi)還有大量NH4+-N 和 NO2?-N 未去除, 厭氧氨氧化菌被過高的NO2?-N 濃度抑制, 使得 TN 去除效率大幅度下滑。

由圖 3(c)和(d)可以看出, 在穩(wěn)定運行階段的后期(第 59~82 天), 沸石反應(yīng)器的 NRR 和 TN 去除率開始高于對照反應(yīng)器, 并逐漸與對照反應(yīng)器拉開差距。沸石反應(yīng)器的 TN 去除率由第 58 天的 47.6%增加到第 82 天的 64.1%, 增幅為 16.5%; 對照反應(yīng)器的 TN 去除率在這 25 天里由 43.9%增至 55.2%, 增幅 11.4%; 兩反應(yīng)器 TN 去除率增幅相差5.1%。沸石反應(yīng)器的 NRR 在這 25 天里由 139.3mgN/(L·d)增至 177.8mgN/(L·d), 增幅為 38.5mgN/(L·d); 對照反應(yīng)器的 NRR 在這 25 天里由 129.1mgN/(L·d)增至154.3mgN/(L·d), 增幅為 25.2mgN/(L·d)。沸石反應(yīng)器的 NRR 增幅比對照反應(yīng)器提高 52.78%, 說明在反應(yīng)器受到較大沖擊后, 與對照反應(yīng)器相比, 沸石反應(yīng)器可以更高效地恢復(fù)反應(yīng)器的整體脫氮效率。在整個 82 天的運行周期中, 沸石反應(yīng)器與對照反應(yīng)器的 NRR 經(jīng) t 檢驗得到=0.6353(>0.05), 說明兩個反應(yīng)器的整體脫氮效率無明顯差異。但是, 在反應(yīng)器運行的最后 24 天, 即當(dāng) HRT 縮短為 8 小時的階段, 兩個反應(yīng)器 NRR 值經(jīng) t 檢驗得出= 0.0007(<0.01), 即具有顯著的差異性。這說明在穩(wěn)定運行期后期, 沸石反應(yīng)器的總體脫氮效率顯著高于對照反應(yīng)器。綜上所述, 添加沸石可以提高反應(yīng)器的整體脫氮效率, 并增強(qiáng)反應(yīng)器內(nèi)部系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

圖3 對照反應(yīng)器(a)和沸石反應(yīng)器(b)進(jìn)出水中NH4+-N, NO2?-N和NO3?-N濃度變化、反應(yīng)器總氮(TN)去除率變化(c)以及氮去除負(fù)荷(NRR)變化(d)

2.2 反應(yīng)器運行過程中 EPS 多糖和蛋白濃度變化分析

由圖 4 可知, 兩反應(yīng)器內(nèi)懸浮污泥 EPS 含量總體上隨時間增加而升高。前 3 次采樣 (第 15 天、第30 天和第 45 天)的兩反應(yīng)器內(nèi)懸浮態(tài)污泥 EPS 含量經(jīng) t 檢驗得=0.5152(>0.05), 無顯著性差異。并且, 前 3 次采樣的沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮態(tài)污泥 EPS 含量均小于對照反應(yīng)器, 可能是由于前期過多的菌泥在沸石表面形成過厚的生物膜, 影響內(nèi)層厭氧氨氧化菌的恢復(fù)[17], 同時沸石會截留部分細(xì)菌, 使其無法與反應(yīng)器內(nèi)的基質(zhì)充分反應(yīng)。但是, 到穩(wěn)定運行后期(第 82 天), 沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮菌樣 EPS 含量(103.2 mg/gVSS)首次超越對照反應(yīng)器(97.1mg/gVSS)。陳方敏等[18]發(fā)現(xiàn), 高活性的厭氧氨氧化細(xì)菌 EPS 濃度范圍為 100.1~105.6mg/gVSS, 本研究與之相近。綜上所述, 雖然在第 15 天、第 30 天和第 45 天, 對照組反應(yīng)器內(nèi)懸浮態(tài)污泥 EPS 含量高于沸石反應(yīng)器, 但兩者差異并不顯著。經(jīng)過長時間(82 天)的運行, 沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮態(tài)污泥 EPS 濃度高于對照反應(yīng)器。結(jié)合 TN 去除率來看, 在反應(yīng)器運行的前 58天內(nèi), 兩反應(yīng)器的 TN 去除曲線幾乎重合, TN 總體去除率并無明顯的差異(=0.8201>0.05)。沸石反應(yīng)器在懸浮污泥 EPS 含量低于對照反應(yīng)器的情況下, 還保持與對照反應(yīng)器幾乎一樣的脫氮效率, 這也說明添加沸石載體后, 沸石吸附 NH4+-N, 使得反應(yīng)器的脫氮更加高效和穩(wěn)定。

圖4 反應(yīng)器內(nèi)懸浮污泥的蛋白濃度(a)和多糖濃度(b)

2.3 反應(yīng)器內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步探究沸石吸氨對反應(yīng)器內(nèi)菌群組成的影響, 將對照反應(yīng)器和沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮污泥及沸石反應(yīng)器內(nèi)沸石表面附著態(tài)污泥進(jìn)行 16S rRNA基因高通量測序。首先對采集樣本的細(xì)菌測序結(jié)果進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA), 探究不同時期兩個反應(yīng)器內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性與差異性。PCA 分析可以對數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化, 去除干擾元素, 降維后在二維坐標(biāo)圖中表征出樣本間的相似性。樣本組成越相似, 則在 PCA 圖中的距離越近, 出現(xiàn)樣品數(shù)據(jù)點聚集的現(xiàn)象。

如圖 5 所示, 選取的樣品共聚為 4 類。反應(yīng)器運行啟動階段, 即第一次采樣的采樣點 B_1, B_2 和B_3 聚為一類, 說明在該階段, 沸石反應(yīng)器內(nèi)污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生大的改變。隨著反應(yīng)器的運行, 從負(fù)荷提升期開始, 沸石反應(yīng)器內(nèi)污泥的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的改變——沸石反應(yīng)器懸浮樣C_2 和沸石反應(yīng)器附著樣 C_3 開始與對照反應(yīng)器懸浮樣 C_1 拉大距離。但是, C_2 與 C_3 的距離仍然接近, 說明此時沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮態(tài)污泥與附著態(tài)污泥的群落結(jié)構(gòu)相似。到穩(wěn)定運行期, 沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮樣(D_2 和 E_2)、沸石反應(yīng)器內(nèi)附著樣(D_3和 E_3)以及對照反應(yīng)器懸浮樣(D_1 和 E_1)各自形成 3 個距離較遠(yuǎn)的團(tuán)簇, 說明在穩(wěn)定運行期, 對照反應(yīng)器懸浮樣與沸石反應(yīng)器懸浮樣的群落結(jié)構(gòu)差異繼續(xù)變大, 而沸石反應(yīng)器內(nèi)部懸浮態(tài)污泥與附著態(tài)污泥的群落結(jié)構(gòu)也開始出現(xiàn)差異。上述結(jié)果表明, 沸石的加入對反應(yīng)器內(nèi)污泥微生物群落結(jié)構(gòu)的演替有顯著的影響。

2.4 菌群分類及豐度變化情況

由圖 6 和 7 可知, 對照反應(yīng)器內(nèi)懸浮污泥中厭氧氨氧化菌屬主要是其次是。隨著反應(yīng)器的運行,在對照反應(yīng)器內(nèi)懸浮污泥中的豐度占比為B_1 6.9%, C_1 29%, D_1 30%和 E_1 34%, 呈增加的趨勢, 且在負(fù)荷提升期(第 15~45 天)的幅度較大, 為 22.1%。在穩(wěn)定運行期(第 45~82 天), 增幅較小, 僅為 5%。沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮菌樣中厭氧氨氧化菌屬主要是, 其初始占比為0.29%。隨著反應(yīng)器的運行,在沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮菌樣中的豐度占比為 B_2 4.9%, C_2 20%, D_2 33%和 E_2 41%, 呈增加的趨勢。與對照反應(yīng)器不同的是, 沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮態(tài)菌在穩(wěn)定運行時期,菌屬豐度占比的增幅(21%)較大。其中, 在第 60 天及第 90 天取得的污泥樣品中, 沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮菌樣中菌屬的相對豐度均超過對照反應(yīng)器, 兩反應(yīng)器內(nèi)屬豐度占比差距由 3%(第 60 天)拉大到 7% (第 90 天)。上述結(jié)果說明沸石的加入可以提升反應(yīng)器內(nèi)懸浮污泥中厭氧氨氧化菌的相對豐度和增長速率。

屬在沸石反應(yīng)器內(nèi)附著態(tài)污泥中的豐度占比為 B_2 12%, C_2 36%, D_2 34%和 E_2 35%。附著態(tài)污泥內(nèi)菌屬含量在負(fù)荷提升期(第 15 天)及穩(wěn)定運行期前期(第 45 天)均比同時期對照反應(yīng)器內(nèi)懸浮態(tài)污泥高。但是, 在穩(wěn)定運行期的中、后期(第 45, 60 和 90 天), 附著態(tài)污泥內(nèi)屬的豐度占比變化不大, 維持在 35%±1%?？赡苁且驗榉惺砻娓街勰鄡?nèi)厭氧氨氧化菌的相對豐度在這段時間一直處于較高水平, 到達(dá)“瓶頸”。在反應(yīng)器運行前期(第1~45 天), 附著態(tài)污泥內(nèi)屬的豐度占比增長比懸浮態(tài)污泥快的原因可能是沸石良好的吸附 NH4+-N 能力以及沸石對厭氧氨氧化菌提供的載體功能。在反應(yīng)器運行期間, 沸石反應(yīng)器內(nèi)的沸石表面形成一層厭氧氨氧化生物膜, 通過沸石自身吸附及解吸 NH4+-N 的能力, 在生物膜微環(huán)境內(nèi)進(jìn)行穩(wěn)定的厭氧氨氧化反應(yīng), 從而能夠更好地促進(jìn)受饑餓抑制厭氧氨氧化菌的恢復(fù)。

圖5 主成分分析

屬是一種兼性厭氧反硝化菌屬, 可在微氧條件下利用系統(tǒng)內(nèi) NO3?-N 或 NO2?-N 進(jìn)行反硝化反應(yīng)[19]。從圖 6 和 7 可以看出, 在厭氧氨氧化菌恢復(fù)過程中,屬的豐度呈逐步上升的趨勢。以對照反應(yīng)器為例,屬在懸浮態(tài)污泥中的豐度占比為 B_1 5.8%, C_1 33%, D_1 34%和 E_1 38%, 豐度占比從第 2 次采樣(第15 天)的 5.8%升至第 5 次采樣(第 45 天)的 38%, 增幅達(dá) 27.2%, 與屬在對照反應(yīng)器懸浮態(tài)污泥中豐度占比的變化情況(第 45 天比第15 天提高 22.1%)類似, 兩者均呈逐步遞增趨勢。這說明在受饑餓影響厭氧氨氧化菌的恢復(fù)過程中,與屬于協(xié)同共生關(guān)系。在沸石反應(yīng)器內(nèi),屬在懸浮態(tài)污泥中的豐度占比為 B_2 6.3%, C_2 31%, D_2 37%和E_2 36%, 在附著態(tài)污泥中豐度占比為 B_2 6.9%, C_2 32%, D_2 39%和 E_2 36%。沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮態(tài)與附著態(tài)污泥中屬的豐度占比幾乎相同, 且沸石反應(yīng)器內(nèi)污泥中屬的豐度占比與對照反應(yīng)器內(nèi)污泥差別不大, 說明沸石對反應(yīng)器內(nèi)屬的豐度影響甚微。

圖6 對照反應(yīng)器內(nèi)懸浮態(tài)污泥樣品在屬水平上的物種分類及豐度占比

圖7 沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮態(tài)污泥樣品(a)和附著態(tài)污泥樣品(b)在屬水平上的物種分類及豐度占比

圖8 微生物群落功能的COG功能豐度變化

2.5 功能預(yù)測分析

16s rDNA 高通量測序結(jié)果可以用來預(yù)測微生物群落的功能。采用 PICRUSt1 功能預(yù)測法, 對 4個采樣時間點(第 15 天、第 45 天、第 60 天和第 82天), 兩個反應(yīng)器內(nèi)不同形態(tài)污泥中的微生物群落功能進(jìn)行 COG 功能預(yù)測, 得到 COG 功能豐度箱(圖8)?？梢钥闯? 3 種污泥中豐度較高的 COG 功能基因分別為細(xì)胞壁和細(xì)胞膜生物合成功能、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化功能、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝功能以及信號轉(zhuǎn)換功能。其中, 豐度排第一位和第二位的功能分別是氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝以及能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化, 說明反應(yīng)器中微生物的活性較高, 生長速率較快, 微生物增加量大。豐度排第三位的是細(xì)胞壁和細(xì)胞膜生物合成功能, 該功能有利于微生物的附著態(tài)生長, 說明厭氧氨氧化菌容易附著在沸石載體表面, 通過沸石的吸氨能力及載體功能, 促進(jìn)厭氧氨氧化反應(yīng)高效、穩(wěn)定地運行。結(jié)合污泥中物種分類及豐度占比可以發(fā)現(xiàn), 沸石表面附著污泥內(nèi)厭氧氨氧化菌的豐度比其他兩種污泥更快地達(dá)到峰值(35%)。

進(jìn)一步地, 通過對兩個反應(yīng)器內(nèi) 3 種不同污泥狀態(tài)的 4 個采樣時間點(第 15 天、第 45 天、第 60 天和第 82 天)的 COG 功能基因豐度之間進(jìn)行 t 檢驗, 尋找<0.05 的 COG 功能分類, 結(jié)果如圖 9 所示。兩種對照反應(yīng)器懸浮樣以及沸石反應(yīng)器懸浮樣和附著樣均存在顯著性差異的 COG 功能分類: 信號傳導(dǎo)通路、細(xì)胞防御機(jī)理。對于沸石表面附著的污泥, 向反應(yīng)器內(nèi)加入沸石可能會增加污泥內(nèi)細(xì)胞的防御代謝, 增強(qiáng)細(xì)菌自身的排異及適應(yīng)功能。對于懸浮態(tài)細(xì)菌, 向反應(yīng)器內(nèi)加入沸石可能會加強(qiáng)細(xì)菌之間的通信。沸石反應(yīng)器內(nèi)懸浮污泥屬的豐度比對照反應(yīng)器高 7%, 說明沸石的加入可使細(xì)菌之間信號傳導(dǎo)更加密切, 從而促進(jìn)細(xì)菌功能的恢復(fù)。

圖9 兩反應(yīng)器內(nèi)污泥的兩種不同COG功能豐度及顯著性差異

3 結(jié)論

本文通過研究投加沸石載體對受饑餓影響厭氧氨氧化菌恢復(fù)過程的影響, 得到如下主要結(jié)論。

1)投加沸石載體可使反應(yīng)器內(nèi)厭氧氨氧化反應(yīng)更加穩(wěn)定和高效, NH4+-N 吸附和微生物降解同時發(fā)生。2)投加沸石載體可使恢復(fù)后的厭氧氨氧化菌()的豐度更高, 更好地促進(jìn)受饑餓抑制厭氧氨氧化菌的長期恢復(fù)。3)沸石為載體, 運行生物膜–活性污泥復(fù)合系統(tǒng)反應(yīng)器, 通過底物吸附+生物降解耦合手段, 在沸石表面的微環(huán)境中達(dá)到長期高效穩(wěn)定的 NH4+-N 底物供給, 可以更好地促進(jìn)厭氧氨氧化反應(yīng)進(jìn)行。

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Effect of Zeolite on Recovery of Anammox Bacteria Affected by Starvation

YU Daodao1, SUN Jingqi2, HUO Tangran2, ZHAO Yunpeng2, LIU Sitong1,2,?

1. Department of Environment and Energy, Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055; 2. Department of Environmental Science & Engineering, Peking University, Beijing 100871; ? Corresponding author, E-mail: liusitong@pku.edu.cn

Zeolite has good ammonium absorption capacity and microbial carrier function. Anammox bacteria affected by starvation were activated in a reactor containing zeolite to study the effect of zeolite on the activity and structure of anammox bacteria after long-term starvation. The results showed that anammox bacteria recovered in the zeolite reactor and the control reactor (without zeolite addition) after 82 days of operation. The nitrogen removal efficiency of zeolite reactor began to lag behind that of the control reactor on the 59th day. On the 82nd day of operation, the nitrogen removal load (NRR) of zeolite reactor was 177.8 mgN/(L·d), significantly higher than that of the control reactor (154.3 mgN/(L·d)). At the same time, 16S rRNA high-throughput sequencing method was used to analyze the microbial composition and function of the microbial community in the reactor. It was found that adding zeolite carrier could increase the abundance of anammox bacteriaafter recovery, and could better promote the recovery of anammox bacteria inhibited by hunger.

anammox bacteria; zeolite; bacterial recovery; community structure

10.13209/j.0479-8023.2021.011

2020–03–07;

2020–03–24