蔣 明，王軍峰，朱 晏，黃雯馨，應夢豪，馬佳瑩，戴晨宇

射干葉綠體基因組結構、序列特征與系統(tǒng)發(fā)育分析

蔣 明1，王軍峰2，朱 晏1，黃雯馨1，應夢豪1，馬佳瑩1，戴晨宇1

1. 臺州學院生命科學學院，浙江 臺州 318000 2. 華東藥用植物園科研管理中心，浙江 麗水 323000

以射干為材料，在測序、組裝獲得葉綠體基因組的基礎上，明確其結構、序列特征及系統(tǒng)發(fā)育關系。利用PE150雙末端策略進行建庫測序，用NOVOPlasty組裝完整的葉綠體基因組，經(jīng)PCR驗證邊界，借助生物信息學工具進行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育研究。射干的葉綠體基因組全長為153 816 bp，大單拷貝區(qū)、反向重復區(qū)和小單拷貝區(qū)的長度分別為83 143、26 214、18 245 bp。射干葉綠體基因組共有133個基因，編碼基因、tRNA和rRNA的數(shù)量分別為92、38和8；有2個拷貝，其中一個為假基因。系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，7種植物葉綠體基因組在發(fā)育樹上可分為4組，射干與同為鳶尾科的溪蓀聚為一組，支持率達100%。射干葉綠體基因組的組裝、序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，為該藥用植物的遺傳結構和遺傳多樣性研究奠定了基礎。

射干；葉綠體基因組；結構；序列分析；鳶尾科

射干(L.) Redouté為鳶尾科（Iridaceae）射干屬多年生草本植物，具結節(jié)狀的根狀莖，葉片劍形，花橙紅色，花瓣上散生紫褐色斑點，分布于我國的吉林、山東、安徽、江蘇、浙江和福建等20多個省份[1]。射干分布廣泛，是一種十分常見的藥用植物，有著悠久的栽培和藥用歷史；射干的主要藥用部位為其根狀莖，它富含酚類化合物，尤其是類黃酮和異黃酮類物質，如射干苷、白射干素、鳶尾黃素和野鳶尾苷等[2]。射干具有清熱解毒、散結消炎和利咽消腫等功效，可用于治療扁桃腺炎、喉痹咽痛和腰痛等[3-5]。射干葉形優(yōu)美、花色亮麗、花期較長，具有較好的觀賞價值，常用于盆栽、庭院美化或藥草園片植等，是一種觀賞和藥用兼用植物[6]。近年來，有關射干的研究主要集中在栽培技術、組培快繁、病蟲害防治、化學成分、藥理作用和轉錄組等方面[7-11]。

葉綠體是綠色植物進行光合作用和能量轉換的細胞器，它將太陽能轉換為化學能，用于物質積累和植物的生長發(fā)育[12]。葉綠體在植物逆境防御中也起著十分重要的作用，在不良環(huán)境下，產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS作為一種調控基因表達水平的信號分子，促使植物產(chǎn)生新的適應[13-14]。葉綠體基因組以雙鏈環(huán)狀形式存在于葉綠體中，被子植物的葉綠體基因組大小為120～170 ?kb，測序和組裝比核基因組容易[15]。隨著測序技術的快速發(fā)展及測序費用的降低，越來越多的葉綠體基因組得以注釋，目前已有1000多種植物完成葉綠體基因組的測序，它們在遺傳多樣性、基因組進化、基因水平轉移、系統(tǒng)發(fā)育分析和群體遺傳學等方面得到了應用[16-18]。目前，有關射干葉綠體基因組的測序、組裝和注釋等研究未見報道。本研究以射干葉片DNA為材料，在利用高通量測序的基礎上拼接葉綠體基因組，明確其序列特征、基因組結構及與近緣特種間的系統(tǒng)發(fā)育關系，為后續(xù)開展遺傳多樣性和群體遺傳學研究奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

射干葉片采自浙江舟山東福山島，伴生植物有山菅(L.) DC.、小茄Thunb.、蘚狀景天Hemsl.和濱海前胡Thunb.等。采集健康葉片，裝入樣品袋后帶回實驗室備用。

1.2 儀器

艾本德Eppendorf移液槍；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；ThinkPad P52移動工作站；伯樂C1000型PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；Covaris超聲波DNA破碎儀（Chromatin Shearing，美國）；Illumina HiSeq X Ten測序儀；北京六一DYY-12型電泳儀及電泳槽（北京市六一儀器廠）；伯樂Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）。

2 方法

2.1 DNA的提取和文庫構建

在無菌研砵中加入適量液氮，用研棒將葉片磨成細粉末，再利用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）方法提取基因組DNA，經(jīng)電泳檢測后用于構建文庫。用超聲波破碎儀將基因組DNA片段化，經(jīng)末端修復、添加A尾、兩端加測序接頭、產(chǎn)物純化及PCR擴增等過程，完成文庫的構建。

2.2 高通量測序

采用雙端（paired-end，PE）策略，用Illumina HiSeq X Ten高通量測序儀進行測序，讀長為2×150 bp，共獲得3.55 G原始數(shù)據(jù)。利用NGS QC Toolkit v2.3.3對原始數(shù)據(jù)進行過濾，去除接頭和低質量的序列[19]。最終共得到11 814 172條clean reads，20值達97.53%，30為92.73%，序列質量較高，可用于后續(xù)的拼接和注釋。

2.3 葉綠體基因組的拼接和注釋

葉綠體基因組的拼接在ThinkPad P52移動工作站上進行，拼接采用NOVOPlasty程序[20]。利用在線工具DOGMA（dual organellar genoMe annotator）對序列進行基因注釋，網(wǎng)址為http:// dogma.ccbb.utexas.edu/，起始和終止密碼子通過手工方式進行調整[21]。tRNA用tRNAscan-SE（http:// www.lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/）和ARAGORN預測[22-23]。OGDRAW（organellar genome draw）用于生成葉綠體基因組圈圖，網(wǎng)址為http://www. ogdraw. mpimp-golm.mpg.de[24]。

2.4 邊界序列的PCR克隆和測序驗證

葉綠體基因組的4個邊界采用PCR方法進行鑒定，根據(jù)拼接的草圖，共設計了4對引物，分別是YGUP1：5’-GGGCGAACCAAAAAGAATGAT- G-3’、YGDN1：5’-CTTTTGTAGCCAATCATTTAT- CGGG-3’；YGUP2：5’-GGTTATGGAAGAAGG- AACCGAGAA-3’、YGDN2：5’-GCTATTTCCTC-TGCTTGTATTGGT-3’；YGUP3：5’-CTATTTTA- CGTCTTTGCGCGC-3’、YGDN3：5’-CCGAGCT- CGGGTTATGGAAG-3’；YGUP4：5’-CTGTAGA- CCCACGGAAAAATGT-3’、YGDN4：5’-GGTA- GAGCCGGATCGAAGT-3’。

Eppendorf管中，依次加入15 μL ddH2O、2.0 μL 10×緩沖液、0.4 μL dNTPs（10 mmol/L）、0.3 μL的上游引物（20 μmol/L）、0.3 μL下游引物（20 μmol/L）、1.0 μL DNA模板（50 ng/μL）和0.5 μLDNA聚合酶（2 U/μL）。PCR反應在伯樂C1000型PCR儀上進行，程序為：94 ℃變性5 min；32個循環(huán)中，94 ℃、30 s，54.3 ℃、45 s，72 ℃、100 s，共32個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、割膠、回收和純化后，將其與p-GEM T-easy載體（Promega）連接，置于4 ℃過夜。把連接產(chǎn)物導入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR檢測后，各取3份菌液測序。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載6條葉綠體基因組的序列，它們分別來自溪蓀Donn ex Horn.（KT626943）、龍須菜Kunth（KX790361）、蔻第百子蓮F. M. Leight（KX790363）、惠普爾絲蘭(Torr.) Trel.、鹿蔥Maxim.（NC_040164）和馬褂木(Hemsl.) Sargent.（KU170538）。其中的溪蓀為鳶尾科植物；蔻第百子蓮和鹿蔥屬石蒜科（Amaryllidaceae）；龍須菜和惠普爾絲蘭為百合科（Liliaceae）植物；而外類群馬褂木隸屬木蘭科（Magnoliaceae）。

利用Geneious 11.1.5內置的Find repeats工具預測葉綠體基因組的反向重復（inverted repeat，IR）序列、大單拷貝區(qū)（large single copy，LSC）和小單拷貝區(qū)（small single copy，SSC），并用EXCEL計算各自的GC值。Geneious 11.1.5軟件中的MAFFT 7.388程序用于葉綠體基因組的多重比對，導出的比對序列用PhyML-SMS（Smart Model Selection in PhyML）在線工具獲得最佳替代模型，最后生成最大似然（maximum likelihood，ML）樹[25-26]。利用Mega X軟件構建最大簡約（maximum parsimony）樹，自舉檢測值為1000。

3 結果與分析

3.1 葉綠體基因組的邊界驗證

利用NOVOPlasty對射干葉片DNA的Clean reads進行拼接，并通過PCR手段對4個邊界進行克隆和測序驗證。電泳結果表明，4對引物均能擴增出單1條帶，PCR產(chǎn)物分別位于800、1300、1800、1300 bp處，大小與預期一致（圖1）。序列測定結果表明，4條序列的長度分別為812、1328、1859、1325 bp，堿基排列與組裝完成的葉綠體基因組邊界序列完全一致。

M-Marker 1～4-LSC/IRb、IRB/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC邊界序列

3.2 葉綠體基因組的特點

射干葉綠體基因組全長為153 816 bp，具有一個典型的四分體結構，即分別由LSC、SSC、IRa和IRb 4個部分組成（圖2）。LSC與SSC的大小為83 143 bp和18 245 bp，IRa和IRb長度均為26 214 bp（表1）。利用Excel計算GC值，結果表明，反向重復區(qū)的GC值最大，達43.0%，LSC次之，為36.0%，而SSC的GC值最小，僅31.4%；射干整個葉綠體基因組的GC值為37.8%。

3.3 葉綠體基因的組成和特點

射干葉綠體基因組上共有133個基因，包括38個轉運RNA（tRNA）、8個核糖體RNA（rRNA）、14個核糖體蛋白小亞基基因、11個核糖體蛋白大亞基基因、4個RNA聚合酶基因、12個NADH脫氫酶亞基基因、20個光系統(tǒng)I/光系統(tǒng)II亞基基因、6個細胞色素b/f復合物亞基基因和6個ATP合成酶亞基基因等。另有7個未知功能基因，它們是、、和，除外，其它各有2份拷貝。

rRNA基因中，、、和各有2份拷貝，分別位于2個反向重復區(qū)域，4種rRNA的長度分別為103、121、1491、2810 bp。tRNA中，、、、、、、和各有2份拷貝，其余tRNA均只有一個。具有2份拷貝的基因還有、、、、和基因等，也有2份拷貝，但其中1個為假基因（表2）。射干葉綠體基因組中，大部分基因沒有內含子，少部分具1～2個內含子。、和基因有2個內含子，、、、、、、、、、、、、和具1個內含子（表2）。

內圈深色部分為GC含量

表1 射干葉綠體基因組的堿基組成

3.4 基因組特征比較分析

從NCBI下載了溪蓀、龍須菜、蔻第百子蓮、惠普爾絲蘭、馬褂木和鹿蔥6種植物的葉綠體基因組，它們的全長分別為152 408、156 875、157 055、157 832、159 429和158 459 bp。馬褂木葉綠體基因組的GC值最大，為39.2%，溪蓀次之，為38.0%，蔻第百子蓮的GC值最小，僅37.5%（表3）。馬褂木的LSC和SSC最長，分別為87 766、18 997 bp，但它的IR較短，為26 333 bp。蔻第百子蓮的IR最長，長度為26 869 bp，鹿蔥次之，為26 764 bp，而溪蓀的IR最短，僅26 026 bp。

射干與其他6種植物的LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC邊界及基因分布如圖3所示，基因在邊界的排列情況基本相同。除馬褂木外，LSC/IRb邊界兩側分布有和基因，而馬褂木LSC/IRb兩側為和基因。和基因位于IRb/SSC的邊界，7種植物在該位置的基因全長為899～1112 bp，顯著短于正常的基因，它們均為假基因。另一個位于SSC/IRa交界處，長度為5276～5489 bp，均為正?；?。馬褂木IRa/LSC邊界兩側分布有和基因，而其他6種植物在該處為和基因。

表2 射干葉綠體基因組的基因

×2-2份拷貝 Ψ-假基因*-一個內含子**-2個內含子

×2-2 copies Ψ-pseudogene*-one intron**-2 introns

表3 7種植物葉綠體基因組的特征

3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用在線工具PhyML-SMS獲得最佳分子進化模型，結果表明，7條葉綠體基因組的最佳模型為GTR＋G＋I，該模型的赤池信息標準（Akaike information criterion，AIC）與貝葉斯信息標準（Bayesian information criterion，BIC）分別為820 620.543 72和820 831.677 20，與其他模型相比，它們的數(shù)值最低。以馬褂木葉綠體基因組為外類群，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。7種植物葉綠體基因組在系統(tǒng)發(fā)育樹上可分為4組，石蒜科的鹿蔥和蔻第百子蓮聚于組I，支持率為100%；百合科的龍須菜和惠普爾絲蘭聚于組II，支持率達100%；鳶尾科的溪蓀和射干聚于組III，支持率也為100%；而外類群馬褂木單獨處于分支IV。同時，利用Mega X構建了最大簡約樹，結果與最大似然樹基本一致，除龍須菜和惠普爾絲蘭的支持率為99%外，其余均達100%（圖4）。

圖3 射干葉綠體基因組的反向重復區(qū)域/單拷貝區(qū)域邊界

圖4 基于葉綠體全基因組構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

被子植物葉綠體基因組的結構通常十分保守，為雙鏈環(huán)狀，具2個反向重復序列IRa和IRb，它們將LSC和SSC隔開，最終形成四分體結構[27]。葉綠體基因組的長度也十分保守，大部分陸生植物的葉綠體基因組大小在135～160 kb[28]。禾本科（Gramineae）植物剪股穎L.的葉綠體基因組大小為136 584 bp[29]；百合科洋蔥L.的葉綠體基因大小為153 538 bp[30]。有些植物的葉綠體基因組較小，如藥用植物木賊麻黃Bge.僅109 518 bp[31]；而天竺葵Bailey的葉綠體基因組大小達217～942 bp，在目前已完成測序的陸生植物中最大[32]。本研究以射干為材料，在高通量測序的基礎上，對其葉綠體基因組進行了組裝，經(jīng)PCR克隆和測序驗證，得到射干葉綠體基因組的全長序列，它的長度為153 816 bp。

葉綠體基因組的基因組成十分保守，通常包含130個左右的基因，這些基因的功能涉及光合作用、轉錄和翻譯等[33]。葉綠體基因組通常有114種基因，包括4種rRNA基因、30種tRNA基因和80種蛋白質編碼基因[34]。在一些寄生或半寄生植物中，基因丟失現(xiàn)象十分普遍。山毛櫸寄生(L.) W. P. C. Barton的葉綠體基因組大小僅70 kb，大部分基因丟失，僅剩下42個，與光合作用和葉綠體呼吸相關的基因全部缺失[35]。在半寄生植物廣寄生(DC) Danser和桑寄生(Lecomte) Danser葉綠體基因組中，僅注釋到106個基因，包括66個蛋白編碼基因、28個tRNA、8個rRNA和4個假基因[36]。在射干葉綠體基因組中，共有4種rRNA基因，它們各有2份拷貝，分布在不同的IR區(qū)域，另有30種tRNA基因，其中的、和等各有2份拷貝。

植物在進化過程中，葉綠體基因組LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC邊界常發(fā)生擴張或收縮事件，使葉綠體基因組大小出現(xiàn)一定的差異，甚至發(fā)生假基因化。比較魯桑Perr.、蒙桑Schneid.、印度桑L.和川桑Schneid.的葉綠體基因組發(fā)現(xiàn)，它們的SSC/IRb交界處均存在1個假基因；在鼠尾草Thunb. SSC/IRb處的也是一個假基因。本研究中，也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，在射干葉綠體基因組中共有2份拷貝，位于SSC/IRb邊界的為假基因，而另一份正常。葉綠體基因組可用于植物的進化分析和親緣關系鑒定，目前已應用于不同分類級別的系統(tǒng)進化分析。張慧等[37]利用15個野芝麻亞科（Lamioideae）65個共有葉綠體蛋白序列構建最大似然法樹（maximum likelihood，ML），發(fā)現(xiàn)益母草(Laur.) S. Y. Hu和水蘇屬Linn.的親緣關系較近，大部分節(jié)點的支持率達100%。射干與其他6種植物葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，射干與溪蓀的關系最為接近，支持率達100%。

射干種質資源十分豐富，但不同種源藥材的質量參差不齊。葉綠體基因組的組裝和序列分析，為開發(fā)高分辨率的遺傳標記提供了依據(jù)，也為后續(xù)開展該植物的群體遺傳學和遺傳多樣性研究奠定了基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Structure, sequence characteristics, and phylogenetic evolution analysis ofchloroplast genome

JIANG Ming1, WANG Jun-feng2, ZHU Yan1, HUANG Wen-xin1, YING Meng-hao1, MA Jia-ying1, DAI Chen-yu1

1. College of Life Science, Taizhou University, Taizhou 318000, China 2. Scientific Research Management Center, East China Medicinal Botanical Garden, Lishui 323000, China

To confirm the genome structure, sequence characteristics, and phylogenetic relationship by sequencing and assembling the chloroplast genome of a medicinal plant.A PE150 strategy was applied to construct library. The complete chloroplast genome was generated using NOVOPlasty, followed by PCR confirmation of the borders, and sequence analysis, as well as phylogenetic study was conducted by bioinformatic tools.The full-length chloroplast genome was 153 816 bp in length, with a large single copy of 83 143 bp, an inverted repeat of 26 214 bp, and a small single copy of 18 245 bp. Thechloroplast genome consisted of 133 genes, including 92 protein-coding genes, 38 tRNAs, and 8 rRNAs, respectively. There were twogenes, one of which was a pseudogene. Phylogenetic evolution analysis results indicated that the seven chloroplast genomes can be divided into four groups,andfrom Iridaceae were found to cluster in the same clade, with a support rate of 100%.Assembly, sequence analysis and phylogenetic evolution ofchloroplast genome provides an insight into studies on both genetic structure and genetic diversity.

(L.) Redouté; chloroplast genome; structure; sequence analysis; Iridaceae

R282.12

A

0253 - 2670(2021)13 - 4039 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.027

2020-12-03

臺州市211人才工程經(jīng)費資助（2012年度）

蔣 明（1973—），男，浙江嵊州人，博士，教授，碩士生導師，研究方向為植物基因組學、植物逆境生物學及其分子調控。E-mail: jiangming1973@139.com

[責任編輯 時圣明]