江 媛1，楊青淑1，王 婧1，楊成金，黃林芳，楊 燕，段寶忠

? 藥材與資源 ?

毛重樓葉綠體基因組序列特征及其系統(tǒng)發(fā)育分析

江 媛1,2，楊青淑1, 2，王 婧1, 2，楊成金3，黃林芳2，楊 燕4，段寶忠1*

1. 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193 3. 云南白藥集團(tuán)中藥資源有限公司，云南 昆明 650504 4. 云南省科學(xué)技術(shù)院，云南 昆明 650051

獲取毛重樓葉綠體基因組信息特征并對(duì)其系統(tǒng)位置進(jìn)行研究。采用Illumination測(cè)序技術(shù)對(duì)毛重樓葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序，對(duì)其進(jìn)行組裝、注釋和特征分析，并構(gòu)建最大似然（maximum likelihood，ML）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。毛重樓葉綠體基因組大小為163 918 bp，總GC含量為37.05%，大單拷貝區(qū)（large single-copy，LSC）、小單拷貝區(qū)（small single-copy region，SSC）分別為84 173、13 054 bp，反向互補(bǔ)重復(fù)區(qū)（inverted repeats，IR）大小為33 296 bp，共編碼113個(gè)基因，包括79個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，30個(gè)tRNA基因和4個(gè)rRNA基因。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，重樓屬L.與藜蘆科（Melanthiaceae Batsch ex Borkh.）關(guān)系較近，與百合科（Liliaceae Juss.）關(guān)系較遠(yuǎn)。LSC區(qū)和SSC區(qū)序列變異高于IR區(qū)；相較于重樓屬，毛重樓與蚤休組的親緣關(guān)系最近，應(yīng)將毛重樓歸屬為蚤休組；相較于百合科，毛重樓與藜蘆科藜蘆屬親緣關(guān)系更近，應(yīng)將蚤休組從百合科中獨(dú)立，歸屬為藜蘆科。

毛重樓；葉綠體基因組；重樓屬；系統(tǒng)發(fā)育；藜蘆科

重樓屬L.植物全球共有約30余種，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，有藥用記載的有11種[1]。其中滇重樓Smith var.(Franch.) Hand. -Mazz.和華重樓Smith var.(Franch.) Hara，是《中國(guó)藥典》2020年版收載的品種[2]。由于長(zhǎng)期的掠奪式采挖，重樓屬植物資源遭到了毀滅性的破壞，多個(gè)物種已瀕臨枯竭[3-4]，加強(qiáng)該屬植物種質(zhì)資源的保護(hù)和相關(guān)基礎(chǔ)研究迫在眉睫。毛重樓H. Léveillé為重樓屬植物，主要分布在云南、四川和貴州，以根莖入藥，具有清熱解毒、平喘止咳、消腫散瘀，常用于治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、咳嗽、蛇蟲(chóng)咬傷、跌撲傷痛等病癥[5]。現(xiàn)代研究表明，毛重樓含有螺甾烷型、呋甾烷型、五環(huán)三萜型等多種皂苷類化合物[6-8]，具有抗腫瘤、抗病毒等重要藥用價(jià)值[9]。目前，有關(guān)毛重樓的研究主要集中在栽培、遺傳多樣性、化學(xué)成分和藥效學(xué)研究等方面[5,8,10-11]。此外，Song等[12]雖報(bào)道了毛重樓的葉綠體全基因組，但未對(duì)該植物的基因序列特征、功能與分類、密碼子組成等進(jìn)行研究，且未與重樓屬其他植物葉綠體基因組進(jìn)行比較，限制了對(duì)其遺傳背景、種質(zhì)資源保護(hù)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化等方面的認(rèn)識(shí)。鑒于此，本研究對(duì)毛重樓、峨眉重樓var.H. X. in, H. Zhang、滇重樓3個(gè)重樓屬物種的新鮮葉片進(jìn)行了測(cè)序，并對(duì)毛重樓葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了解析，同時(shí)比較了上述3個(gè)物種的葉綠體基因組特征差異，以期為研究毛重樓優(yōu)良品種選育、種質(zhì)資源保護(hù)和植物系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

樣品的新鮮葉片采自云南省永平縣龍門鄉(xiāng)種質(zhì)資源圃（N99°53′，E25°54′），經(jīng)大理大學(xué)段寶忠教授鑒定為毛重樓H. Léveillé（標(biāo)本號(hào)YN20200820A6）、峨眉重樓var.H. X. in, H. Zhang（標(biāo)本號(hào)YN20191003B2）和滇重樓Smithvar.(Franch.) Hand. -Mazz.（標(biāo)本號(hào)YN20191002B4）健康葉片裝入取樣袋后帶回實(shí)驗(yàn)室，用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，晾干后置于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 基因組DNA的提取和測(cè)序

取毛重樓、峨眉重樓和滇重樓的新鮮葉片，采用植物基因組DNA試劑盒（TIANGEN公司，北京）提取總DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。檢測(cè)合格后的總DNA利用Illumina HiSeq X Ten平臺(tái)進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。原始序列采用NGS QC ToolKit進(jìn)行質(zhì)控。原始數(shù)據(jù)提交到GenBank，登錄號(hào)MW694831。

2.2 葉綠體基因組的組裝與注釋

以峨眉重樓葉綠體全基因組序列（NC_050052）為序列延伸種子，在Linux系統(tǒng)中運(yùn)行腳本。使用NOVOPlasty （V.3.8.3）對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。采用Circlator （V.2.0.1）[13]軟件，檢測(cè)reads映射的覆蓋度和各contigs的連接處，檢驗(yàn)組裝的正確性。注釋、編輯和校正采用Geneious（V.9.1.4）進(jìn)行。葉綠體基因組環(huán)狀示意圖采用OGDRAW在線工具繪制[14]。

2.3 重復(fù)序列和密碼子使用分析

采用CPGAVAS2（http://47.96.249.172:16019/ analyzer/home）進(jìn)行重復(fù)序列和密碼子使用分析[15]。其中，MISA用于發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列分析[16]，參數(shù)閾值設(shè)置為：?jiǎn)巍㈦p、3、4、5、6，核苷酸參數(shù)為10、6、5、5、5、5；TRF軟件用于串聯(lián)重復(fù)序列分析[17]，重復(fù)單元大小設(shè)定≥7；VMATCH軟件用于分析散布重復(fù)序列[18]；GC含量和密碼子使用偏好采用EMBOSS（v6.3.1）[19]中的Cusp程序計(jì)算獲得。

2.4 基因組比較分析

使用IRscope可視化工具，比較毛重樓、滇重樓和峨眉重樓葉綠體基因組4個(gè)區(qū)域邊界的差異。并采用mVISTA對(duì)其進(jìn)行全基因組比對(duì)分析。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為探討毛重樓的系統(tǒng)位置，本研究按照《中國(guó)植物志》百合科分類系統(tǒng)，從NCBI下載了百合科下22條物種的葉綠體基因組序列，包括廣義重樓屬植物15條，藜蘆屬植物5條和貝母屬L.植物2條。同時(shí)選擇與百合科親緣關(guān)系較近的菝葜科（Smilacacea）菝葜L.和白背牛尾菜Miq.作為外類群，構(gòu)建最大似然（maximum likelihood，ML）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。具體步驟：采用MAFFT（V.7.0）[20-21]進(jìn)行全基因組比對(duì)，然后使用RAxML（V.8.2.11）軟件，核苷酸替代模型設(shè)置為GTR＋I(xiàn)＋G（Bootstrap 1000），具體參數(shù)為：“raxmlHPC-PTHREADS-SSE3 -f a -N 1000 -m GTRGAMMA -x 551314260 -p 551314260-o Smilax_china_NC_ 049022，Smilax_nipponica_NC_ 049024 -T 20”。

3 結(jié)果與分析

3.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)

利用Illumina HiSeq X Ten測(cè)序，去除接頭和低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，共得到32 817 588條長(zhǎng)度約為150 bp的序列。利用NOVOPlasty進(jìn)行組裝，經(jīng)注釋后得到毛重樓的葉綠體基因組。結(jié)果表明，毛重樓葉綠體基因組總長(zhǎng)163 819 bp，G/C含量為37.05%，A/T含量為62.95%，有明顯的AT偏向性?；蚪M呈雙鏈環(huán)狀（圖1），具有典型的4分區(qū)域結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)大單拷貝區(qū)（large single-copy，LSC）、1對(duì)反向互補(bǔ)重復(fù)區(qū)（inverted repeats，IR）和1個(gè)小單拷貝區(qū)（small single-copy region，SSC），其大小分別為84 173、33 296、13 054 bp。此外，LSC、IR和SSC區(qū)域的GC值存在一定的差異，堿基組成結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可看出，IR區(qū)的G/C含量最高（39.73%），其次是SSC區(qū)（35.70%）及LSC區(qū)（32.16%），其可能原因是IR區(qū)含有高GC含量的rRNA基因[22]。

圖1 毛重樓葉綠體基因組圖譜

表1 毛重樓葉綠體基因組堿基組成

3.2 葉綠體基因組功能及分類

毛重樓葉綠體基因組共包含113個(gè)基因，其中編碼蛋白基因、rRNA基因與tRNA基因的數(shù)量分別為79、4、30個(gè)。根據(jù)其功能可以把它們分為4大類：分別是與光合作用有關(guān)的基因、復(fù)制有關(guān)的基因、未知功能的蛋白質(zhì)基因，以及成熟酶基因（）、囊膜蛋白基因（）等其他基因。在這些基因中，有10個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（、、、、、、、、、）、7個(gè)tRNA編碼基因（、、、、、）和4個(gè)rRNA編碼基因（、、、）位于IR區(qū)。對(duì)毛重樓葉綠體基因內(nèi)含子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)共有22個(gè)基因含有內(nèi)含子，其中僅有4個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（、、、）含有2個(gè)內(nèi)含子，其余18個(gè)基因只有1個(gè)內(nèi)含子（表3）。

表2 毛重樓葉綠體基因組基因列

表3 毛重樓葉綠體基因中內(nèi)含子的位置和長(zhǎng)度

3.3 散在重復(fù)序列、串聯(lián)重復(fù)序列及SSR分析

散在重復(fù)序列以值＜1×10?4為閾值進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示重復(fù)單元以散在方式分布于基因組內(nèi)，包括回文重復(fù)序列26條、正向重復(fù)序列23條，其長(zhǎng)度均為110～180 bp。串聯(lián)重復(fù)序列按照總長(zhǎng)度大于20 bp，且重復(fù)單元間相似性≥90%進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示共有15個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSRs）分析表明，共有80個(gè)SSRs位點(diǎn)。其中包括60個(gè)單核苷酸重復(fù)基序，13個(gè)二核苷酸重復(fù)基序，3個(gè)三核苷酸重復(fù)基序，2個(gè)五核苷酸重復(fù)基序和2個(gè)六核苷酸重復(fù)基序，未發(fā)現(xiàn)四核苷酸重復(fù)基序。SSR的類型以A/T為主，共有59個(gè)；其次為AT/AT，共有12個(gè)（表4）。

3.4 葉綠體基因組密碼子使用分析

毛重樓葉綠體基因組密碼子使用頻次統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，共有41 893個(gè)密碼子（圖2）。在這些密碼子中，異亮氨酸（Leu）為頻次最高的氨基酸，編碼4766次，占10.21%；密碼子總數(shù)＜2000次的氨基酸有半胱氨酸（Cys）、天冬氨酸（Asp）、組氨酸（His）、甲硫氨酸（Met）、脯氨酸（Pro）、谷氨酰胺（Gln）、精氨酸（Arg）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、終止子（TER），其中編碼頻次最低的氨基酸為半胱氨酸（Cys），僅編碼603次，占總密碼子的1.29%。這與蒙古韭Regel、金鐵鎖W. C. Wu & C. Y. Wu等陸生植物觀察到的趨勢(shì)一致[23-24]。圖2顯示了毛重樓葉綠體基因組所有蛋白質(zhì)編碼基因的20個(gè)氨基酸和終止密碼子的密碼子個(gè)數(shù)。

表4 毛重樓葉綠體基因組SSRs類型及數(shù)量

3.5 IR邊界變化分析

研究顯示，毛重樓葉綠體基因組共存在4個(gè)邊界，分別是IRB-SSC、IRB-LSC、IRA-SSC、IRA-LSC。所選的3個(gè)重樓屬植物葉綠體基因組相對(duì)保守（圖3），3個(gè)物種的IRB-LSC邊界均位于，且該基因在IRB區(qū)域長(zhǎng)度均為6 bp。IRB-SSC的邊界與存在間隙，其中該基因在毛重樓中擴(kuò)張，距SSC區(qū)僅3 bp，而峨眉重樓與滇重樓均為21 bp。所有物種的IRA- SSC邊界均位于內(nèi)，該基因相對(duì)保守長(zhǎng)度均為2222 bp。此外，IRA-LSC邊界均與基因存在著58～59 bp的間隙。

圖2 毛重樓蛋白質(zhì)編碼基因中20個(gè)氨基酸和終止密碼子的密碼子含量

圖3 重樓屬3種植物葉綠體基因組的LSC、IRs和SSC邊界區(qū)域的比較分析

3.6 基因組序列變異分析

嘗試與NCBI中重樓屬部分物種進(jìn)行比較，但發(fā)現(xiàn)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的多條重樓屬物種和基因缺失達(dá)5300 bp，尚不清楚是物種問(wèn)題還是測(cè)序深度所造成，因此，采用了本課題組裝拼接的序列進(jìn)行比對(duì)，以期更進(jìn)一步理解他們之間的差異。全局比對(duì)采用在線基因組比對(duì)工具mVISTA，以項(xiàng)目組已發(fā)表的峨眉重樓葉綠體基因組（NC_050052）為參照，對(duì)毛重樓和滇重樓（NC_052909）葉綠體基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析（圖4）。結(jié)果顯示，3條葉綠體基因組序列中非編碼區(qū)變異高于保守的蛋白編碼區(qū)域，LSC區(qū)、IR區(qū)變異明顯大于SSC區(qū)，rRNA基因高度保守，幾乎沒(méi)有變異。由圖可見(jiàn)，變異較大的基因有F、L-UAA、A和D，其他基因的保守程度非常高，絕大多數(shù)的基因相似度都在90%以上。3個(gè)重樓屬植物的基因間區(qū)，如T-UGU-L-UAA、-D、L-CAU-2、F-V、E-UUC-T-GGU、S-GCU-G-UCC、8-等，其基因間區(qū)變異均大于基因區(qū)。此外，毛重樓變異相對(duì)較大，如Q-UUG和2基因，以及K-L、H-L和D-A基因間區(qū)。這些位點(diǎn)為毛重樓的分子鑒定提供了新的位點(diǎn)資源。

3.7 毛重樓葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

為確定毛重樓的系統(tǒng)位置，基于24條序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖5。從圖5可見(jiàn)，2個(gè)外類群物種獨(dú)立為一支；毛重樓與蚤休屬L.的祿勸花葉重樓等聚成一支，再與延齡草屬L.聚成一支，之后與北重樓屬L.聚為一支，這3支在《被子植物APG分類法IV》（APG IV）分類系統(tǒng)均歸屬為延齡草亞科（Subfam. Trillioideae A. Gray），表明相較北重樓屬而言，毛重樓與延齡草屬的親緣關(guān)系更近；延齡草亞科（Subfam. Trillioideae）與藜蘆亞科（Subfam. Melanthioideae Eaton）聚為一支歸屬于藜蘆科。值得一提的是，百合科貝母屬與藜蘆科分布在不同的進(jìn)化支上，支持率為100。在之前的研究中，學(xué)術(shù)界對(duì)重樓屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系一直存在著較大爭(zhēng)議[25-27]。如李恒[26]和Dumortier[28]提出重樓屬與延齡草屬二者構(gòu)成一個(gè)單系類群，親緣關(guān)系最近，應(yīng)歸屬于延齡草科（Trilliaceae）；而在《中國(guó)植物志》中重樓被歸屬于百合科（Liliaceae）。本研究結(jié)果表明，相較藜蘆科，毛重樓與百合科的關(guān)系較遠(yuǎn)，基于葉綠體基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析，支持將毛重樓從百合科中獨(dú)立，歸屬為藜蘆科，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[29]。從屬下等級(jí)來(lái)看，基于葉綠體基因組的ML樹(shù)顯示，廣義重樓屬被分為5個(gè)類群，分別是蚤休組Sect.、五指蓮組Sect、黑籽組Sect.、日本重樓Sect.和北重樓組Sect.，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果存在一定的分歧，如Franchet認(rèn)為重樓屬分為Sect.[30]和蚤休組2個(gè)組；而Hara[31]和Takhtajian[32]學(xué)者則認(rèn)為重樓屬應(yīng)分為北重樓組、日本重樓組和側(cè)膜組3個(gè)組[31-32]。李恒[26,33]則將其分為側(cè)膜亞屬和中軸亞屬，而后再分成海南重樓組Sect.、蚤休組、祿勸花葉重樓組Sect.、球藥隔重樓組Sect.、五指蓮組、黑籽組、日本重樓組和北重樓組。鑒于重樓屬植物分類的分歧，從葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育的角度來(lái)看，重樓屬植物應(yīng)分為5個(gè)類群較為恰當(dāng)。

圖4 毛重樓與相關(guān)重樓屬植物葉綠體基因組全局比對(duì)圖

圖5 基于葉綠體全基因組序列構(gòu)建ML系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

4 討論

本研究完成了毛重樓葉綠體基因組的測(cè)序、組裝和注釋，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、GC含量等進(jìn)行了分析。研究表明毛重樓具有典型的環(huán)狀DNA分子，且具有保守的4分狀結(jié)構(gòu)，全長(zhǎng)163 819 bp，與本課題前期組裝的同屬植物滇重樓、峨眉重樓等葉綠體基因組大小相似[34-35]，其GC含量為36.5%，共編碼125基因，其中14個(gè)蛋白編碼基因含有內(nèi)含子。此外，在該基因組中存在一些未知功能的基因，如和，到目前為止，功能尚未清楚的基因雖仍在大多數(shù)被子植物中存在，但在重樓屬植物的葉綠體基因組中已完全消失。本研究從毛重樓葉綠體基因組中分別共檢測(cè)到80個(gè)SSR，共發(fā)現(xiàn)15條串聯(lián)重復(fù)序列及49條散在重復(fù)序列。這些重復(fù)序列可為重樓屬物種分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)，物種或產(chǎn)品鑒定提供理論依據(jù)。

基于葉綠體基因組的ML進(jìn)化樹(shù)顯示，廣義重樓屬[26]被分為蚤休組、五指蓮組、黑籽組、日本重樓組和北重樓組5個(gè)類群，其中毛重樓與蚤休組聚為一支，相較于北重樓組，毛重樓與蚤休組的親緣關(guān)系最近，建議將毛重樓歸屬為蚤休組。此外，相較于百合科，毛重樓與藜蘆科藜蘆屬親緣關(guān)系更近，支持將蚤休屬歸于藜蘆科的觀點(diǎn)。本研究表明葉綠體基因組可在物種水平上有效解決重樓屬的系統(tǒng)進(jìn)化問(wèn)題。毛重樓葉綠體基因組的組裝和序列分析，為后續(xù)開(kāi)展群體遺傳學(xué)和遺傳多樣性研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Complete chloroplast genome of: characterization and phylogeny

JIANG Yuan1, 2, YANG Qing-shu1, 2, WANG Jing1, 2, YANG Cheng-jin3, HUANG Lin-fang2, YANG Yan3, DUAN Bao-zhong1

1. College of Pharmaceutical Science, Dali University, Dali 671000, China 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China 3.Yunnan Baiyao Group Traditional Chinese Medicine Resources Co., Ltd., Kunming 650504, China 4. Yunnan Provincial Academy of Science and Technology, Kunming 650051, China

To obtain the complete chloroplast genome information and to estimate phylogenetic relationships among.The Illumina platform was used to sequence the complete chloroplast genome ofThe bioinformatics software were used to assemble, annotate and characterize the complete chloroplast genome of. RAxML was used to reconstruct a maximum-likelihood (ML) phylogenetic tree.The complete chloroplast genome ofwas 163 819 bp, containing inverted repeated of 33 296 bp each, a large single-copy region of 84 173 bp, and a small single-copy region of 13 054 bp. A total of 113 genes were identified including 79 protein-coding, 30 tRNAs, and 4 rRNAs. Phylogenetic analysis indicated thatpresented a closer relationship with Melanthiaceae than Liliaceae.The IR region variability was significantly inferior to LSC and SSC. Besides, phylogenetic analysis revealed thatwas closely related to.

H. Lév.; chloroplast genome;L.; phylogeny; Melanthiaceae

R282

A

0253 - 2670(2021)13 - 4014 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.024

2020-12-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31860080）；云南省重大科技專項(xiàng)（202002AA100007）；大理大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（ZKLX2019318）；云南省院士專家工作站（宋經(jīng)元，2021-1）

江 媛（1997—），碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與鑒定。E-mail: yjiang@yntcm.ac.cn

段寶忠，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與鑒定。Tel: (0872)2257411 E-mail: bzduan@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]