嚴寶飛，段金廒，張景正，劉圣金，劉 嘉*，毛藝蓓，曾慶琪, 3

忍冬藤提取物誘導骨肉瘤細胞凋亡的作用及機制研究

嚴寶飛1, 2，段金廒2，張景正1，劉圣金2，劉 嘉1*，毛藝蓓1，曾慶琪1, 3

1. 江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院，江蘇 南京 211800 2. 南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室，江蘇 南京 210023 3. 南京中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029

研究忍冬藤提取物對骨肉瘤細胞增殖和凋亡的作用及機制。采用超高效液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用技術（UPLC-Q-TOF/MS）表征忍冬藤提取物的化學成分；采用MTT法檢測忍冬藤提取物對人骨肉瘤細胞HOS、143B以及人腎皮質近曲小管上皮細胞HK-2存活率的影響；采用熒光顯微鏡觀察忍冬藤提取物對HOS、143B細胞凋亡的影響；采用Annexin V/PI雙染法檢測忍冬藤提取物對HOS細胞凋亡的影響；采用JC-1染色法檢測忍冬藤提取物對HOS細胞線粒體膜電位的影響；采用Western blotting法檢測忍冬藤提取物對HOS細胞B細胞淋巴瘤2相關X蛋白（bcl-2 associated X，Bax）、B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、活化的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）、活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved poly ADP-ribose polymerases，cleaved PARP）、cleaved Caspase-9和細胞色素C（cytochrome-c，Cyt-C）蛋白表達的影響。忍冬藤提取物中鑒定出有機酸類、三萜皂苷類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類和氨基酸類5種類型的36種化學成分。忍冬藤提取物抑制HOS和143B細胞存活率，顯著誘導HOS細胞凋亡（＜0.01），Caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK顯著抑制忍冬藤提取物誘導的HOS細胞凋亡（＜0.05、0.01）；忍冬藤提取物顯著提高HOS細胞Caspase-3活性（＜0.01），顯著改變HOS細胞線粒體膜電位（＜0.05、0.01），顯著上調HOS細胞Bax、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9、Cyt-C和Bax/Bcl-2蛋白表達水平（＜0.05、0.01），顯著下調Bcl-2蛋白表達水平（＜0.05、0.01）。忍冬藤提取物能夠抑制骨肉瘤細胞增殖，并通過線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡，其機制可能與下調Bcl-2蛋白表達，上調Bax、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表達，激活Caspase級聯(lián)反應有關。

忍冬藤；骨肉瘤；凋亡；作用機制；UPLC-Q-TOF/MS

骨肉瘤又名成骨肉瘤，是一種可以直接產(chǎn)生骨樣組織的原發(fā)性惡性腫瘤，多發(fā)于青少年，發(fā)病率位居原發(fā)性惡性骨腫瘤第1位；其初期癥狀為間斷性的疼痛和腫脹，隨后發(fā)展為無法緩解的持續(xù)性疼痛，并伴有局部炎性反應、病理性骨折等表現(xiàn)[1]。中醫(yī)學雖無“骨肉瘤”病名記載，但早有關于其癥狀及臨床表現(xiàn)的描述，如《靈柩·癰疽》載“發(fā)于膝，狀大癰，色不變，如堅石”，并將其歸屬為“下石疽”“骨疽”“骨瘤”“骨蝕”等范疇，體虛外感結里、邪氣博結于骨為其病因病機。中醫(yī)對骨肉瘤的病因、病位和病機的認識與辨證論治的實踐充分，中醫(yī)辨證論治和整體觀念的治療原則在骨肉瘤治療過程中具有獨特的優(yōu)勢[2]。

忍冬藤為忍冬科植物忍冬Thunb.的干燥莖枝，始載于魏晉時期的《名醫(yī)別錄》，自1963年被《中國藥典》收載，其性甘、味寒，具有清熱解毒、疏風通絡之功效，用于治療溫病發(fā)熱、熱毒血痢、癰腫瘡瘍等癥，《本草綱目》稱其“莖葉及花，功用皆同，治一切濕氣及諸腫痛”[3]。忍冬藤主要含黃酮類、有機酸類、三萜類等成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、免疫調節(jié)、解熱等藥理活性。忍冬藤及其有效成分具有顯著的抗腫瘤作用，但尚未有研究報道其對骨肉瘤細胞的作用及機制。因此，本研究考察忍冬藤提取物對人骨肉瘤細胞HOS和143B增殖和凋亡的影響，并初步探討其誘導細胞凋亡的機制，以期為忍冬藤的臨床應用及開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞

HOS、143B細胞及人腎皮質近曲小管上皮細胞HK-2購自美國ATCC。

1.2 藥材

忍冬藤（批號20200613）購自江蘇省中醫(yī)院，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學段金廒教授鑒定為忍冬科植物忍冬Thunb.的干燥莖枝，憑證標本存放于南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心。

1.3 藥品與試劑

甲醇（批號20200814）購自南京化學試劑公司；乙腈購自德國Merck公司；對照品新綠原酸（批號XLYS20190413）、綠原酸（批號LYS20190306）、隱綠原酸（批號YLYS20190316）、異綠原酸B（批號YLYS220181107）、異綠原酸A（批號YLYS120190104）、異綠原酸C（批號YLYS320190203）購自南京春秋生物工程有限公司，質量分數(shù)均大于98%；胎牛血清（批號FSS500）購自杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)基（批號1776550）購自美國Gibco公司；MTT（批號M-2253）購自美國Spectrum Chemical公司；二甲基亞砜（DMSO，批號276855）購自美國Sigma公司；AnnexinV-FITC/碘化丙啶（PI）雙染試劑盒（批號20200306）、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（批號KG-A306）購自上海李記生物科技公司；B細胞淋巴瘤2相關X蛋白（bcl-2 associated X，Bax）抗體（批號5023T）、B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號15071T）、活化的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）抗體（批號9661T）、活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved poly ADP-ribose polymerases，cleaved PARP）抗體（批號5625T）、cleaved Caspase-9抗體（批號7237T）、細胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）抗體（批號4280T）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號5174T）、HRP標記的羊抗兔IgG抗體（批號32935S）購自美國CST公司；Caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK（批號sc6753）購自美國Santa cruz公司；Hochest 33258染色試劑盒（批號H4046）、Caspase-3活性檢測試劑盒（批號C1115）購自碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號23246）、PVDF膜（批號LC2002）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 儀器

EPED型超純水系統(tǒng)（南京易普達易科技發(fā)展有限公司）；KQ250E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；ML204/MS105型電子天平（美國托利多公司）；Rotavapor R-210型旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；30A型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Triple TOF 5600＋型質譜儀（美國AB Sciex公司）；TS2R型浮雕反差倒置熒光顯微鏡、TS100型倒置顯微鏡（日本尼康公司）；MINI-4小型垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Multiskan MK3型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

2 方法

2.1 忍冬藤提取物的制備

忍冬藤粉碎，過40目篩，稱取25 g粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，靜置1 h，室溫超聲50 min后濾過；濾渣中加入50%甲醇50 mL，室溫超聲50 min，合并濾液，濃縮至25 mL即得忍冬藤提取物（以生藥量計1 g/mL），于4 ℃保存，臨用前用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至相應質量濃度。

2.2 忍冬藤提取物的UPLC-Q-TOF/MS分析

2.2.1 供試品溶液的制備 取“2.1”項下忍冬藤提取物，13 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，得到供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定對照品，加入50%甲醇溶液，配制成新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C質量濃度分別為0.213、0.243、0.530、0.174、0.306、0.204 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 色譜條件[4]Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～5.0 min，5%～27% B；5.0～10.0 min，27%～95% B；10.0～15.0 min，95% B；15.0～15.2 min，95%～5% B；15.2～20.0 min，5% B；柱溫為25 ℃；體積流量為0.3 mL/min；進樣量為3 μL。

2.2.4 質譜條件 正、負離子模式；霧化氣壓力為379.225 kPa；輔助氣壓力為379.225 kPa；氣簾氣壓力為241.325 kPa；離子源溫度為550 ℃；離子噴霧電壓為4500 V/?4500 V；去簇電壓為60 V/?60 V；碰撞能量為60 eV/?60 eV；TOF-MS掃描范圍為/100～2000；子離子掃描范圍為/50～1500。

2.3 忍冬藤提取物對HK-2細胞存活率的影響

取處于對數(shù)生長期的HK-2細胞，以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。設置對照組和忍冬藤提取物（5、10、25、50、75、100 mg/mL）組，棄去培養(yǎng)基，各給藥組加入100 μL藥物，對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基（含0.1% DMSO），培養(yǎng)24 h。加入MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入DMSO，室溫振蕩，使結晶充分溶解，采用酶標儀測定492 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝給藥/對照

2.4 忍冬藤提取物對骨肉瘤細胞存活率的影響

取處于對數(shù)生長期的HOS和143B細胞，按“2.3”項下方法處理，給藥后分別培養(yǎng)24、48、72 h，測定細胞存活率。

2.5 Hochest染色法檢測細胞凋亡

取處于對數(shù)生長期的HOS和143B細胞，以2.5×104/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h。設置對照組和忍冬藤提取物（25、50、75 mg/mL）組，各給藥組加入500 μL藥物，對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基（含0.1% DMSO），培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，以PBS洗滌2次，于4%多聚甲醛溶液中固定30 min；棄上清，PBS洗滌3次，加入300 μL Hochest 33258工作液，室溫避光孵育10 min；棄上清，PBS洗滌3次，加入300 μL PBS，于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

2.6 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡率

取處于對數(shù)生長期的HOS細胞，以4×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h。按“2.5”項下方法處理，用不含EDTA的胰酶收集各組細胞，1000 r/min離心10 min，PBS洗滌2次，加入500 μL Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V/FITC混勻，再加入PI染液，室溫混合后避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.7 Caspase-3試劑盒檢測Caspase-3活性

取處于對數(shù)生長期的HOS細胞，以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。設置對照組和忍冬藤提取物（25、50、75 mg/mL）組，各給藥組加入500 μL藥物，對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基（含0.1% DMSO），培養(yǎng)24 h。加入PBS洗滌2次，棄上清，每2×106個細胞加入100 μL裂解液，重懸細胞，裂解15 min，期間振蕩3～4次；4 ℃、8000 r/min離心15 min，吸取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，調整至每10微升待測樣品中含10～30 μg蛋白。取10 μL待測樣品，加入80 μL檢測緩沖液和10 μL Caspase-3底物Ac-DEVD-pDNA（2 mmol/L），混勻，37 ℃避光孵育2～4 h，采用酶標儀測定405 nm處的值，計算Caspase-3活性。

2.8 Z-VAD-FMK對HOS細胞存活率的影響

取處于對數(shù)生長期的HOS細胞，以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。設置對照組、Z-VAD-FMK（10 μmol/L）組、忍冬藤提取物（25、50、75 mg/mL）組、忍冬藤提取物聯(lián)用Z-VAD-FMK組。Z-VAD-FMK預處理30 min后，各給藥組再加入100 μL藥物，對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基（含0.1% DMSO），培養(yǎng)24 h，按“2.3”項下方法測定細胞存活率。

2.9 JC-1染色法檢測線粒體膜電位變化

取處于對數(shù)生長期的HOS細胞，按“2.7”項下方法處理，用不含EDTA的胰酶收集各組細胞，1000 r/min離心10 min，加入500 μL JC-1工作液，培養(yǎng)15 min，2000 r/min離心5 min，收集細胞，用1×Incubation Buffer洗滌2次，采用流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化。

2.10 Western blotting法檢測Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表達情況

取處于對數(shù)生長期HOS細胞，按“2.6”項下方法處理，收集各組細胞，采用總蛋白分離提取試劑盒提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h，分別加入Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌4次，5 min/次，加入HRP標記的羊抗兔IgG抗體（1∶1000），孵育2 h；TBST洗滌4次，5 min/次，加入ECL化學發(fā)光試劑顯影，采用ChemiScope 3300 mini化學發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，ClinxChemi圖像軟件進行灰度值分析。

2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結果

3.1 忍冬藤提取物成分鑒定

忍冬藤提取物正、負離子模式下總離子流圖見圖1。在色譜及質譜條件優(yōu)化后，基于Triple TOF 5600+工作站PeakView工作站、對照品和相關文獻，在忍冬藤提取物中共鑒定出36種化學成分，見表1。

圖1 正 (A)、負離子模式(B) 忍冬藤提取物的總離子流圖

表1 忍冬藤提取物的UPLC/Q-TOF-MS分析

3.2 忍冬藤提取物對HK-2、HOS和143B細胞存活率的影響

如圖2所示，忍冬藤提取物最大給藥濃度仍然沒有達到HK-2細胞的半數(shù)抑制濃度（50% maximal inhibitory concentrations，IC50）值；如圖3所示，忍冬藤提取物抑制HOS和143B細胞存活率，呈劑量和時間相關性；忍冬藤提取物作用于HOS細胞24、48、72 h的IC50分別為37.15、24.07、12.93 mg/mL，作用于143B細胞24、48、72 h的IC50值分別為39.88、25.95、18.34 mg/mL。

圖2 忍冬藤提取物對HK-2細胞存活率的影響()

3.3 忍冬藤提取物對HOS和143B細胞凋亡的影響

如圖4所示，對照組HOS和143B細胞形態(tài)正常，細胞核呈現(xiàn)彌散均勻藍色熒光；忍冬藤提取物組HOS和143B細胞均出現(xiàn)濃染致密的顆粒塊狀藍色熒光等明顯的細胞凋亡特征，表明忍冬藤提取物能夠促進HOS和143B細胞凋亡。

3.4 忍冬藤提取物對HOS細胞凋亡的影響

如圖5所示，與對照組比較，各給藥組HOS細胞凋亡率明顯升高（＜0.01），呈劑量相關性，表明忍冬藤提取物能夠誘導HOS細胞凋亡。

3.5 忍冬藤提取物對HOS細胞Caspase-3活性的影響

如圖6所示，與對照組比較，忍冬藤提取物（50、75 mg/mL）組Caspase-3活性顯著升高（＜0.01）。

圖3 忍冬藤提取物對HOS細胞 (A) 和143B細胞 (B) 存活率的影響()

圖4 忍冬藤提取物對HOS和143B細胞凋亡的影響

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖6 忍冬藤提取物對HOS細胞Caspase-3活性的影響()

3.6 Z-VAD-FMK對HOS細胞存活率的影響

如圖7所示，與單獨給予忍冬藤提取物相比，聯(lián)用Z-VAD-FMK能夠顯著提高細胞存活率（＜0.05、0.01），表明忍冬藤提取物誘導HOS細胞凋亡具有Caspase-3相關性。

3.7 忍冬藤提取物對HOS細胞線粒體膜電位的影響

如圖8所示，與對照組比較，各給藥組HOS細胞綠色熒光（JC-1 monomer）顯著增強（＜0.01），忍冬藤提取物（50、75 mg/mL）組細胞紅色熒光（JC-1 aggregate）顯著減弱（＜0.05、0.01），表明忍冬藤提取物能夠降低HOS細胞線粒體膜電位，呈劑量相關性。

與忍冬藤提取物（25 mg/mL）組比較：#P＜0.05；與忍冬藤提取物（50 mg/mL）組比較：**P＜0.01；與忍冬藤提取物（75 mg/mL）組比較：$$P＜0.01

3.8 忍冬藤提取物對HOS細胞Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表達的影響

如圖9所示，與對照組比較，各給藥組HOS細胞Bax、cleaved Caspase-9蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）；忍冬藤提取物（50、75 mg/mL）組細胞Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3、Cyt-C、cleaved PARP蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖8 忍冬藤提取物對HOS細胞線粒體膜電位的影響()

圖9 忍冬藤提取物對HOS細胞Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表達的影響()

4 討論

目前臨床常用放療結合外科技術治療骨肉瘤，但易產(chǎn)生耐藥性和嚴重的不良反應，術后骨肉瘤患者5年生存率為70%，肺轉移患者5年生存率僅為20%，因此開發(fā)抑制骨肉瘤的新藥尤其重要[1,4]。細胞凋亡是細胞死亡的一種程序化形式，是細胞在生理或病理調節(jié)下啟動自身內(nèi)部機制，經(jīng)過多種信號轉導途徑，結束自身生命的過程[5]。細胞凋亡因其不引起周圍組織炎性損傷而被認為是殺死腫瘤細胞的最佳方式，是許多化療藥物清除腫瘤細胞的重要途徑[6]。誘導腫瘤細胞凋亡是中藥發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機制[7]。本研究采用忍冬藤提取物干預骨肉瘤細胞，觀察其對骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響，并探討其誘導細胞凋亡的機制，為忍冬藤及其組方防治骨肉瘤提供理論基礎與實驗依據(jù)。

本課題組前期分別以水、不同比例乙醇和甲醇提取忍冬藤，系統(tǒng)考察了不同提取物對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)50%甲醇提取物的抑制作用最強，因此基于忍冬藤50%甲醇提取物開展后續(xù)研究。本研究結果顯示，忍冬藤提取物顯著抑制HOS和143B細胞的增殖并誘導其凋亡，提示忍冬藤提取物具有顯著的抗骨肉瘤作用；相同劑量下，忍冬藤提取物對HK-2細胞的抑制作用低于HOS和143B細胞，提示忍冬藤提取物在殺傷骨肉瘤細胞的同時，對正常人體細胞具有一定安全性；相同劑量下，HOS細胞對忍冬藤提取物更為敏感，故選取HOS細胞進行凋亡機制的探究。

凋亡誘導蛋白Bax和凋亡抑制蛋白Bcl-2同屬Bcl-2家族成員，在凋亡過程中起到重要作用[8]，Bax/Bcl-2比值的變化調控線粒體途徑細胞凋亡進程[9]。Cyt-C存在于線粒體中，具有調控細胞凋亡的作用[10]。Cyt-C自線粒體釋放至胞質進而激活Caspase級聯(lián)反應，是細胞凋亡的關鍵步驟，Cyt-C的釋放受Bcl-2家族蛋白控制[11]。凋亡的發(fā)生是由Caspase家族成員介導的蛋白酶級聯(lián)反應過程，其中Caspase-3是最下游的凋亡最終執(zhí)行蛋白[12]。內(nèi)源性線粒體凋亡途徑中上游分子Caspase-9激活Caspase-3，啟動Caspase級聯(lián)反應，切割DNA修復因子PARP等Caspase底物，從而使細胞凋亡進入不可逆階段[13-14]。本研究結果顯示，忍冬藤提取物能夠促使HOS細胞Caspase-3活化，Caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK可以有效抑制忍冬藤提取物誘導的HOS細胞凋亡，表明忍冬藤提取物誘導HOS細胞凋亡具有Caspase-3相關性，提示Caspase-3的活化可能是忍冬藤提取物誘導HOS細胞凋亡的關鍵分子機制。忍冬藤提取物能夠顯著降低HOS細胞線粒體膜電位，下調Bcl-2蛋白表達水平，上調Bax、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9、Cyt-C和Bax/Bcl-2蛋白表達水平，表明忍冬藤提取物能夠通過線粒體凋亡途徑誘導HOS細胞凋亡，其機制可能為忍冬藤提取物上調Bax蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達；增加線粒體膜的通透性，導致線粒體膜電位下降，促使線粒體內(nèi)Cyt-C釋放進入細胞質中，與銜接蛋白凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）相互作用，在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和dATP的協(xié)助下形成凋亡復合體，激活Caspase-9，進一步激活Caspase-3，啟動Caspase級聯(lián)反應，最終誘導細胞凋亡。

中藥的藥效是其復雜化學成分作用于機體生理病理過程的整體調節(jié)效應，體現(xiàn)在多種化學成分通過多途徑、多環(huán)節(jié)調節(jié)機體內(nèi)部的動態(tài)平衡[15]。目前，主要基于金銀花對忍冬藤化學成分進行研究，但二者來源于藥用植物忍冬的不同器官，植物不同器官生長發(fā)育節(jié)律不一，產(chǎn)生的初生與次生代謝產(chǎn)物的種類與含量也因此產(chǎn)生差異，故本研究基于UPLC-Q-TOF/MS對忍冬藤的化學成分進行全面快速地定性分析[16-17]，鑒定出忍冬藤中有機酸類、三萜皂苷類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類和氨基酸類5種類型的36種化學成分，其中()-aldosecolo-ganin、金圣草素-7--新橙皮糖苷、cauloside A、精氨酸、酪氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸等成分為忍冬藤中首次報道，可能是忍冬藤誘導細胞凋亡的物質基礎，后續(xù)可以基于忍冬藤單體成分或成分群開展實驗，探討各成分間的協(xié)同、加和甚至拮抗作用，進一步闡明忍冬藤抗腫瘤的作用機制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Ma B, Zhu J W, Zhao A,. Raddeanin A, a natural triterpenoid saponin compound, exerts anticancer effect on human osteosarcoma via the ROS/JNK and NF-κB signal pathway [J]., 2018, 353: 87-101.

[2] 張雨凝, 肖海濤. 肖海濤教授運用中醫(yī)藥治療多發(fā)性骨髓瘤的臨床經(jīng)驗 [J]. 中西醫(yī)結合心血管病電子雜志, 2020, 8(18): 174-175.

[3] 康帥, 張繼, 魏愛華, 等. 金銀花的本草再考證 [J]. 藥物分析雜志, 2014, 34(11): 1922-1927.

[4] Zhao A, Zhang Z J, Zhou Y F,. β-Elemonic acid inhibits the growth of human osteosarcoma through endoplasmic reticulum (ER) stress-mediated PERK/ eIF2α/ATF4/CHOP activation and Wnt/β-catenin signal suppression [J]., 2020, 69: 153183.

[5] 李龍妹, 黃錦鵬, 河文峰, 等. 龍葵提取物澳洲茄堿誘導A549細胞凋亡的機制研究 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2020, 31(12): 1422-1427.

[6] Jan R, Chaudhry G E. Understanding apoptosis and apoptotic pathways targeted cancer therapeutics [J]., 2019, 9(2): 205-218.

[7] 李小江, 鄔明歆, 孔凡銘, 等. 中藥有效成分抗腫瘤活性及作用機制研究進展 [J]. 中草藥, 2020, 51(9): 2587-2592.

[8] Delbridge A R, Grabow S, Strasser A,. Thirty years of BCL-2: Translating cell death discoveries into novel cancer therapies [J]., 2016, 16(2): 99-109.

[9] Fickova M, Macho L, Brtko J. A comparison of the effects of tributyltin chloride and triphenyltin chloride on cell proliferation, proapoptotic p53, Bax, and antiapoptotic Bcl-2 protein levels in human breast cancer MCF-7 cell line [J]., 2015, 29(4): 727-731.

[10] Yadav N, Gogada R, O'Malley J,. Molecular insights on cytochrome C and nucleotide regulation of apoptosome function and its implication in cancer [J]., 2020, 1867(1): 118573.

[11] 潘朝旺, 王偉, 祁學章, 等. 金蕎麥提取物對人宮頸癌Hela細胞增殖和誘導凋亡的影響 [J]. 中藥藥理與臨床, 2018, 34(5): 96-100.

[12] Günther C, Martini E, Wittkopf N,. Caspase-8 regulates TNF-α-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis [J]., 2011, 477(7364): 335-339.

[13] Brentnall M, Rodriguez-Menocal L, De Guevara R L,. Caspase-9, Caspase-3 and Caspase-7 have distinct roles during intrinsic apoptosis [J]., 2013, 14: 32.

[14] Pommier Y, O'Connor M J, de Bono J. Laying a trap to kill cancer cells: PARP inhibitors and their mechanisms of action [J]., 2016, 8(362): 362ps17.

[15] 汪小莉, 劉曉, 韓燕全, 等. 中藥藥效物質基礎主要研究方法概述 [J]. 中草藥, 2018, 49(4): 941-947.

[16] 魯思愛. 忍冬藤的化學成分及其藥理應用研究進展 [J]. 臨沂大學學報, 2012, 34(3): 132-134.

[17] 段金廒. 中藥資源化學—理論基礎與資源循環(huán)利用 [M]. 北京: 科學出版社, 2015: 151.

Mechanism of apoptosis induced byextract on osteosarcoma cells

YAN Bao-fei1, 2, DUAN Jin-ao2, ZHANG Jing-zheng1, LIU Sheng-jin2, LIU Jia1, MAO Yi-bei1, ZENG Qing-qi1, 3

1. Jiangsu Health Vocational College, Nanjing 211800, China 2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources Recycling Utilization, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 3. The First Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, China

To investigate the proliferation and apoptosis effects and mechanism ofextract on human osteosarcoma cells.Chemical constituents ofextract were characterized by UPLC-Q-TOF/MS. MTT method was used to detect the effect ofextract on survival rate of human osteosarcoma cells HOS and 143B and human renal cortex proximal tubule epithelial cells HK-2; Fluorescence microscope was used to observe the effect ofextract on apoptosis of HOS and 143B cells; Annexin V/PI double staining method was used to detect the effect ofextract on apoptosis of HOS cells; JC-1 staining method was used to detect the effect ofextract on mitochondrial membrane potential of HOS cells; Western blotting method was used to detect the effect ofextract on expressions of B cell lymphoma 2 associated X protein (Bax), B cell lymphoma 2 (b-cell lymphoma-2, Bcl-2), activated cysteine protease-3 (cleaved Caspase-3), cleaved poly ADP-ribose polymerase (cleaved PARP), cleaved Caspase-9 and cytochrome-c (Cyt-C) in HOS cells.A total of 36 chemical components of five types, including organic acids, triterpene saponins, flavonoids, iridoids and amino acids, were identified inextract.extract inhibited the survival rate of HOS and 143B cells, and significantly induced HOS cells apoptosis (< 0.01). Caspase-3 inhibitor Z-VAD-FMK significantly inhibited HOS cells apoptosis induced byextract (< 0.05, 0.01);extract significantly increased Caspase-3 activity in HOS cells (< 0.01), changed mitochondrial membrane potential of HOS cells (< 0.05, 0.01), increased expressions of Bax, cleaved Caspase-3, cleaved PARP, cleaved Caspase-9, Cyt-C and Bax/Bcl-2 in HOS cells (< 0.05, 0.01), down-regulated Bcl-2 expression (< 0.05, 0.01).extract can inhibit the proliferation of osteosarcoma cells and induce apoptosis through mitochondrial apoptosis. The mechanism may be related to down-regulation of Bcl-2 expression, up-regulation of Bax, cleaved Caspase-3, cleaved PARP, cleaved Caspase-9 and Cyt-C expression, and activation of Caspase cascade reaction.

Thunb.; osteosarcoma; apoptosis; mechanism; UPLC-Q-TOF/MS

R285.5

A

0253 - 2670(2021)13 - 3923 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.016

2021-01-14

國家中醫(yī)管理局名醫(yī)驗方評價與轉化重點研究室開放課題（NZYJDMF-2020001）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK20191498）；江蘇省衛(wèi)生健康委醫(yī)學科研項目重點項目（ZDB2020020）；浦口區(qū)科技發(fā)展社會事業(yè)項目（S2020-14）；江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院校級課題重點項目（JKA201916）

嚴寶飛，男，碩士，助教，主要從事中藥資源學研究。Tel: (025)68172750 E-mail: baofeiy@163.com

劉 嘉，男，碩士，副教授，主要從事中藥資源學研究。Tel: (025)68172750 E-mail: liujia402@163.com

[責任編輯 李亞楠]