姜蔓菁，蒙金英，顏夏晴，覃淑婷，李耀華，樊蘭蘭

甜茶素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物鑒定與藥動(dòng)學(xué)研究

姜蔓菁，蒙金英，顏夏晴，覃淑婷，李耀華*，樊蘭蘭*

廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200

對(duì)甜茶素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，并考察甜茶素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征。SD大鼠ig甜茶素（125 mg/kg），收集不同時(shí)間段的尿液、糞便、膽汁和血漿。采用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS/MS）分析其在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物；基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）建立一種測(cè)定大鼠血漿中甜茶素含量的方法，初步研究甜茶素的藥動(dòng)學(xué)特征。大鼠ig甜茶素后，在尿液、糞便、膽汁和血漿中共檢測(cè)并初步鑒定了1種原型成分和58種代謝物，主要代謝途徑有脫氫化、羥基化、去葡萄糖基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化等。甜茶素在大鼠體內(nèi)的吸收較快，在0.12 h血藥濃度達(dá)到最大值，半衰期為4.20 h，較大的表觀分布容積提示甜茶素可能存在一定的組織分布。甜茶素在大鼠體內(nèi)吸收迅速，并經(jīng)歷廣泛的代謝反應(yīng)，為進(jìn)一步闡明甜茶素藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

甜茶素；代謝產(chǎn)物；藥動(dòng)學(xué)；UPLC-Q-TOF-MS/MS；UPLC-MS/MS

甜茶素又名甜茶苷、甜葉懸鉤子苷，是廣西甜茶的主要甜味及活性成分，廣西甜茶為薔薇科植物甜葉懸鉤子S. Lee的葉[1-3]。甜茶素是由斯替維醇和葡萄糖組成的四環(huán)二萜苷[4]，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂[5-7]、抗過(guò)敏性哮喘[8]、抗齲齒[9-10]等藥理活性。甜茶素作為一種低熱量的天然非糖甜味劑被廣泛應(yīng)用于各種食品的加工中[11-12]。因此，甜茶素在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域具有良好的研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。目前研究主要集中在甜茶素的分離純化、含量測(cè)定和藥理活性等[3,13-15]，未見(jiàn)其體內(nèi)代謝及藥動(dòng)學(xué)的研究報(bào)道。為了更好地了解甜茶素在生物體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)化和排泄過(guò)程，本研究利用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS/MS）鑒定并推測(cè)甜茶素在大鼠尿液、糞便、膽汁和血漿中的代謝產(chǎn)物，同時(shí)基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）建立一種快速測(cè)定甜茶素的血漿藥物濃度的方法，探究其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，為甜茶素的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，7～14周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（20±2）℃、濕度40%的環(huán)境中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)DW20200713-003。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品甜茶素（批號(hào)18053101）、甘草次酸（批號(hào)19011506）和甜菊醇（批號(hào)18121002）購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；烏拉坦（批號(hào)H1821067）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；質(zhì)譜級(jí)甲酸（批號(hào)186260）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；色譜級(jí)甲醇、乙醇和乙腈購(gòu)自西隴化工股份有限公司；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制；固相萃取小柱購(gòu)自廣州費(fèi)尼根儀器有限公司。

1.3 儀器

Dionex Ultimate 3000 UPLC（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Bruker impact HD型Q-TOF-MS/MS（德國(guó)Bruker公司）；Acquity UPLC?I Class色譜儀和Xevo TQ-XS質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）。

2 方法

2.1 代謝產(chǎn)物的鑒定

2.1.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～10 min，10%～24% B；10～18 min，24% B；18～19 min，24%～54% B；19～21 min，54%～95% B；21～24 min，95% B；24～25 min，95%～10% B；25～28 min，10% B。體積流量為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子模式；霧化氣（N2）壓力為200 kPa；干燥氣溫度為200 ℃；氣體體積流量為8.0 L/min；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；掃描范圍/50～1000。

2.2 血漿藥物濃度的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～0.5 min，30% B；0.5～1.0 min，30%～60% B；1.0～2.5 min，60%～90% B；2.5～5.0 min，90% B；5.0～6.5 min，90%～30% B。體積流量為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 ESI源；負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；霧化氣（N2）壓力為700 kPa；溫度為550 ℃；體積流量為1000 L/h；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；錐孔電壓為117 V；用于定量分析離子反應(yīng)對(duì)為：甜茶素/641.3→317.2，碰撞能43 eV；甘草次酸/469.3→425.4，碰撞能40 eV。

2.3 溶液的配制

2.3.1 甜茶素藥液的配制 精密稱取適量甜茶素，溶于純水配制成質(zhì)量濃度為12.50 mg/mL的溶液。

2.3.2 對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取甜茶素和甘草次酸，以甲醇配制成質(zhì)量濃度為16.80 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液和20.80 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。取甜茶素儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度為6.72、5.05、3.36、1.26、0.84、0.42、0.17、0.08 μg/mL的系列對(duì)照品溶液；質(zhì)控溶液高、中、低質(zhì)量濃度分別為5.88、1.68、0.25 μg/mL；定量限溶液質(zhì)量濃度為0.08 μg/mL。

2.4 生物樣品的收集

取SD大鼠隨機(jī)分為空白組、尿液糞便組、膽汁組和血漿組，每組8只，給藥前禁食不禁水12 h?？瞻捉Mig純水（10 mL/kg），其余各組ig甜茶素（125 mg/kg）[16-17]。尿液糞便組分別收集給藥后0～4、4～8、8～12和12～24 h尿樣和糞樣，尿樣記錄體積，3500 r/min離心10 min后取上清液；糞樣于50 ℃烘干后稱定質(zhì)量。膽汁組ip 20%烏拉坦（1.1 g/kg）麻醉[18]，實(shí)施膽汁插管引流手術(shù)，分別收集給藥后0～2、2～4、4～6、6～8、8～10、10～12、12～24 h膽汁，記錄體積。血漿組ip 20%烏拉坦（1.1 g/kg）麻醉，于5、15、30 min以及1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h眼眶靜脈采血0.5 mL，置肝素化抗凝離心管3000 r/min離心15 min取上清?？瞻捉M收集尿液、糞便、血漿和膽汁。所有樣品于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 生物樣品的處理

2.5.1 尿液、糞便的處理 將各時(shí)間段尿液樣品混合后以3倍量甲醇稀釋，旋蒸蒸干，以25 mL甲醇超聲復(fù)溶。每克糞便以20 mL甲醇稀釋，旋蒸蒸干，以10 mL甲醇超聲復(fù)溶。復(fù)溶后的尿液和糞便樣品4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液分析。

2.5.2 膽汁的處理 將7個(gè)時(shí)間段膽汁樣品等體積混合，取1 mL加入到活化好的固相萃取小柱，依次用2 mL水和甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，于40 ℃氮?dú)饬鞔蹈?，?00 μL甲醇復(fù)溶，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液分析。

2.5.3 血漿的處理 方法1：將12個(gè)時(shí)間點(diǎn)血漿各取50 μL混合，按“2.5.2”項(xiàng)下方法處理，取上清液進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS/MS分析。方法2：取各時(shí)間點(diǎn)血漿20 μL，加入內(nèi)標(biāo)20 μL、乙腈400 μL，渦旋混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液于40 ℃氮?dú)饬鞔蹈?，?00 μL甲醇復(fù)溶，離心取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性考察 分別取空白血漿、加入對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的血漿、給藥后大鼠血漿按“2.5.3”項(xiàng)下方法2處理后進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限 分別取20 μL空白血漿，加入“2.3.2”項(xiàng)下系列對(duì)照品溶液20 μL，按“2.5.3”項(xiàng)下方法2處理，制備分別含672.00、504.50、336.00、126.00、84.00、42.00、16.80、8.40 ng/mL甜茶素及2.08 μg/mL內(nèi)標(biāo)的血漿樣品。以待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為橫坐標(biāo)（），血漿中待測(cè)物的濃度為縱坐標(biāo)（），用加權(quán)（W＝1/x）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算。取定量限溶液同上述處理平行制備3份定量限樣品（含8.40 ng/mL甜茶素），連續(xù)測(cè)定3 d，并隨行當(dāng)天標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

2.6.3 準(zhǔn)確度和精密度 取20 μL空白血漿和質(zhì)控溶液制備質(zhì)量濃度分別為25.20、168.00、588.00 ng/mL的低、中、高濃度質(zhì)控樣品，各濃度平行6份，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算準(zhǔn)確度與精密度。

2.6.4 回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取20 μL空白血漿和低、中、高濃度質(zhì)控溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下方法2制備低、中、高濃度質(zhì)控樣品（A）；空白血漿按“2.5.3”項(xiàng)下方法2處理（不加內(nèi)標(biāo)），再加入內(nèi)標(biāo)、質(zhì)控溶液各20 μL，甲醇200 μL，離心取上清液（B）；以甲醇制備與上述質(zhì)控樣品等濃度的工作液（C）。以相同質(zhì)量濃度A與B溶液的峰面積比值計(jì)算提取回收率；以B與C溶液的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取20 μL空白血漿和質(zhì)控溶液制備低、中、高濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行制備6份，分別于室溫放置12 h、?20 ℃至室溫反復(fù)凍融3次、?80 ℃放置20 d后進(jìn)樣分析，每次測(cè)定隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果

3.1 甜茶素對(duì)照品的質(zhì)譜裂解途徑分析

甜茶素的[M－H]?離子/641.317 2，同時(shí)存在[M＋HCOO]?離子/687.323 0（圖1-A）以及特征碎片離子/479.264 6 [M－H－C6H10O5]?、317.211 1 [M－H－2C6H10O5]?（苷元甜菊醇），/317.211 1繼續(xù)失去H2O、－COOH產(chǎn)生碎片離子/273.222 1，255.209 9（圖1-B），推測(cè)的裂解途徑見(jiàn)圖2。

3.2 甜茶素在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用Metabolite Predict 2.0結(jié)合常規(guī)I相、II相代謝反應(yīng)規(guī)律預(yù)測(cè)甜茶素可能的代謝產(chǎn)物，基于UPLC-QTOF-MS分析給藥后大鼠尿液、糞便、血漿和膽汁樣品。通過(guò)對(duì)比保留時(shí)間（R）和多級(jí)質(zhì)譜信息，共鑒定和推測(cè)了1種原型成分和58種代謝物。各生物樣品的總離子流圖見(jiàn)圖3，由于膽汁中雜質(zhì)較多，以提取離子流圖代替，代謝物信息見(jiàn)表1。

尿液、糞便、膽汁和血漿樣品的R為20.3 min時(shí)，均檢測(cè)L0準(zhǔn)分子離子峰/641 [M－H]?以及特征碎片離子/479 [M－H－C6H10O5]?、317 [M－H－2C6H10O5]?，與甜茶素對(duì)照品一致，以此鑒定L0為甜茶素。L1-1/L1-2的準(zhǔn)分子離子峰為/639 [M－H]?，較L0少2，產(chǎn)生碎片離子/479、317、273，推測(cè)L0葡萄糖基上的羥基發(fā)生了脫氫化反應(yīng)。L2-1/L2-2、L3準(zhǔn)分子離子峰/657 [M－H]?均較L0多16，產(chǎn)生碎片離子/495 [M－H－C6H10O5]?、333 [M－H－2C6H10O5]?。L3二級(jí)質(zhì)譜中檢測(cè)到/629，比[M－H]?離子少28 [C≡O(shè)]?，為環(huán)氧乙烷開環(huán)特征碎片，環(huán)氧化位點(diǎn)推測(cè)是L0的C16位雙鍵[19]，L2-1/L2-2無(wú)此碎片，推測(cè)為L(zhǎng)0羥基化產(chǎn)物，羥基化位點(diǎn)推測(cè)為母核的－CH2。L4準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?為/789，較L0多148（C5H8O5），碎片離子/641、627、479、317，推測(cè)為L(zhǎng)0葡萄糖基上的－OH與五碳糖結(jié)合的糖基化產(chǎn)物，但無(wú)法確定糖基構(gòu)型及連接位點(diǎn)。L5-1/L5-2準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?為/817，較L0多176（C6H8O6），推測(cè)為L(zhǎng)0的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。L6-1/6-2準(zhǔn)分子離子峰/479 [M－H]?，與L0特征碎片一致，推測(cè)為L(zhǎng)0的去葡萄糖基化產(chǎn)物。L7-1/L7-2準(zhǔn)分子離子峰/721 [M－H]?，較L0多80，推測(cè)由L0葡萄糖基上的羥基發(fā)生硫酸酯化反應(yīng)得到。L8～L25的代謝產(chǎn)物中，大部分由上述同種或兩種I相、II相代謝反應(yīng)結(jié)合得到。其中，L12準(zhǔn)分子離子峰/675 [M－H]?，較L3多18，失去葡萄糖產(chǎn)生碎片離子/513、351，推測(cè)L12為L(zhǎng)3的C16位連接的環(huán)氧乙烷基發(fā)生開環(huán)反應(yīng)得到[19]。L17和L21的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?分別為/874、536，分別較L6和L5多57，推測(cè)為L(zhǎng)6的C18位上和L5葡萄糖醛酸基上的－COOH與甘氨酸結(jié)合的產(chǎn)物。同理，推測(cè)L22為L(zhǎng)6的谷氨酸化產(chǎn)物。

圖1 負(fù)離子模式下甜茶素的一級(jí)質(zhì)譜圖(A) 和二級(jí)質(zhì)譜圖 (B)

圖2 甜茶素可能的裂解途徑

圖3 大鼠ig甜茶素后尿液(A)、糞便 (B)、膽汁(C) 和血漿 (D) 樣品總離子流圖或提取離子流圖

表1 甜茶素在大鼠體內(nèi)代謝物的鑒定

“＋”表示檢測(cè)到；“－”表示未檢測(cè)到

“+” means detected; “—” means not detected

尿液、糞便、膽汁和血漿樣品的R為21.5 min處均檢測(cè)到L26準(zhǔn)分子離子峰為/317 [M－H]?，其二級(jí)碎片特征與甜菊醇對(duì)照品一致，故鑒定為甜菊醇。根據(jù)甜茶素對(duì)照品的裂解規(guī)律，推測(cè)L26由L0在大鼠體內(nèi)發(fā)生糖苷鍵水解而得到。L27、L28準(zhǔn)分子離子峰均為/333 [M－H]?，較L26多了16，與L12和L13類似，L28存在環(huán)氧乙烷開環(huán)特征碎片離子/305 [M－H－CO]?，L27無(wú)此碎片，推測(cè)L27和L28分別為L(zhǎng)26的羥基化產(chǎn)物和環(huán)氧化產(chǎn)物[19-21]。L29、L30、L31和L32的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?分別較L26多148、176、57、129，根據(jù)二級(jí)碎片信息，分別推測(cè)為L(zhǎng)26的C13位羥基糖基化和葡萄糖醛酸化產(chǎn)物、C18位的羧基甘氨酸化和谷氨酸化產(chǎn)物。L33～L45由以上同種或2種I相、II相代謝反應(yīng)結(jié)合而得到。

3.3 甜茶素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物信息總結(jié)

本研究檢測(cè)和鑒定了甜茶素在大鼠體內(nèi)的1種原型、20種I相和38種II相代謝產(chǎn)物，其中尿液38個(gè)、糞便38個(gè)、膽汁37個(gè)、血漿35個(gè)。I相代謝包括脫氫化、羥基化、環(huán)氧化和去葡萄糖基化等，II相代謝包括糖基結(jié)合、葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸化、谷氨酸結(jié)合和甘氨酸結(jié)合等。甜茶素中的代謝反應(yīng)位點(diǎn)主要有母核的－CH2、－OH、C＝C及葡萄糖基上的－OH。羥基化反應(yīng)主要發(fā)生在母核環(huán)上的幾個(gè)－CH2，C16位的雙鍵是環(huán)氧化和開環(huán)反應(yīng)發(fā)生的位點(diǎn)。脫氫化和II相代謝反應(yīng)中的各種結(jié)合反應(yīng)主要發(fā)生于葡萄糖上的－OH或糖基水解后苷元暴露出的－OH。由于質(zhì)譜提供的信息有限，許多代謝反應(yīng)無(wú)法確定具體位點(diǎn)。另外，糖基化產(chǎn)物如L4等所結(jié)合的糖基均推測(cè)為五碳糖（C5H8O5），而非較常見(jiàn)的葡萄糖基結(jié)合，但未能確定構(gòu)型，初步推斷其反應(yīng)發(fā)生位點(diǎn)在－OH上。

比較各化合物峰面積，尿液中主要檢測(cè)到L27（甜菊醇＋羥基化產(chǎn)物）和一部分L0（原型）、L26（甜菊醇）；糞便中主要檢測(cè)到L0、L26和L27。膽汁中檢測(cè)到的各代謝物含量較低，以L0的硫酸酯化產(chǎn)物（L7-1）、羥基化＋硫酸酯化產(chǎn)物（L11-2/L11-3）、L26的環(huán)氧化＋谷氨酸產(chǎn)物（L40）為主，只檢測(cè)到了少量的L0和L26；血漿中主要檢測(cè)到了L0、L26及L26的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物（L30）、脫氫化＋羥基化產(chǎn)物（L33）。結(jié)果表明甜茶素在大鼠體內(nèi)能夠直接以原型被吸收，經(jīng)歷的主要代謝途徑有糖苷鍵水解（去葡萄糖基化）產(chǎn)生苷元甜菊醇，苷元的脫氫化、羥基化、葡萄糖醛酸化、環(huán)氧化和谷氨酸化，以及原型直接發(fā)生羥基化和硫酸酯化反應(yīng)。甜茶素在大鼠體內(nèi)大部分以原型、苷元和苷元的羥基化產(chǎn)物經(jīng)尿液或糞便排泄，但主要排泄途徑為糞便。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 專屬性試驗(yàn) 空白血漿、加入對(duì)照品工作液和內(nèi)標(biāo)的空白血漿、給藥后大鼠血漿樣品色譜圖見(jiàn)圖4。表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，甜茶素與內(nèi)標(biāo)可以得到較好分離，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不會(huì)影響甜茶素和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，該方法專屬性良好。

3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為＝1 408.4－14.873（2＝0.996 6），表明甜茶素在8.40～672.00 ng/mL線性關(guān)系良好，定量限血漿樣品日間精密度為0.90%。

I-空白血漿樣品 II-空白血漿＋待測(cè)物（168 ng/mL甜茶素）和內(nèi)標(biāo)（2.08 μg/mL甘草次酸）樣品 III-給藥后30 min的血漿樣品

3.4.3 精密度和準(zhǔn)確度 如表2所示，甜茶素各濃度質(zhì)控樣品日內(nèi)和日間精密度的RSD為2.51%～10.51%，準(zhǔn)確度為?1.78%～4.81%，表明該方法精密度和準(zhǔn)確度良好。

3.4.4 回收率和基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)考察中，甜茶素各濃度樣品基質(zhì)效應(yīng)為88.63%～98.57%，RSD在11.08%以下；回收率為90.18%～95.41%，RSD在6.68%以下。表明該條件下，基質(zhì)幾乎不干擾待測(cè)物的測(cè)定，且對(duì)待測(cè)物具有足夠的提取回收率。

表2 甜茶素質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度

3.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 3個(gè)濃度質(zhì)控樣品于室溫放置12 h后的準(zhǔn)確度為?5.87%～3.14%；于?20 ℃反復(fù)凍融3次的準(zhǔn)確度為 ?8.03%～5.21%；于?80 ℃存放20 d后，準(zhǔn)確度為0.90%～3.34%，表明血漿樣品穩(wěn)定性良好。

3.5 甜茶素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

按“2.5.3”項(xiàng)下方法2處理血漿樣品，每次檢測(cè)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品。采用Phoenix WinNonlin 8.1藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算大鼠血漿中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3，藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖5。大鼠ig甜茶素（125 mg/kg）后，吸收較快，達(dá)峰時(shí)間（max）為（0.12±0.08）h，達(dá)峰濃度（max）為（2 196.13±472.36）ng/mL，消除半衰期（1/2）為（4.20±1.38）h。同時(shí)，表觀分布容積大，提示甜茶素可能具有較大程度的組織分布。

表3 大鼠ig甜茶素后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)()

圖5 大鼠ig甜茶素后在體內(nèi)的平均血藥濃度-時(shí)間曲線()

4 討論

本研究分析了ig甜茶素后大鼠的尿液、糞便、膽汁和血漿中的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)各生物樣品在ESI負(fù)離子模式下響應(yīng)優(yōu)于正離子模式，因此選用負(fù)離子模式檢測(cè)代謝產(chǎn)物。在對(duì)樣品處理方法進(jìn)行考察時(shí)，發(fā)現(xiàn)膽汁和血漿樣品經(jīng)固相萃取小柱預(yù)處理后進(jìn)樣時(shí)可以較大程度地減少雜質(zhì)干擾，用乙腈代替甲醇沉淀蛋白質(zhì)可以消除內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)甜茶素血藥濃度測(cè)定的干擾。在測(cè)定血藥濃度時(shí)，一級(jí)質(zhì)譜中除了準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?外，還可觀察到[M＋HCOO]?的加合離子。

甜茶素在大鼠體內(nèi)經(jīng)歷了廣泛的I相和II相代謝反應(yīng)，以脫氫化、羥基化、去葡萄糖基化、葡萄糖醛酸化等為主。此前已有不少關(guān)于甜菊醇及其苷類代謝和藥動(dòng)學(xué)研究的報(bào)道。Koyama等[19]研究甜葉菊提取物（主要含rebaudioside A、rebaudioside C、甜菊苷等）及甜菊醇在大鼠體內(nèi)和體外肝微粒體的生物轉(zhuǎn)化及藥動(dòng)學(xué)，發(fā)現(xiàn)甜菊醇能夠被快速吸收，而以甜菊醇為苷元的苷類較難被直接吸收，主要被腸道菌群降解為苷元才能重新被小腸吸收。Roberts等[22]的研究中也得到了類似的結(jié)果，且發(fā)現(xiàn)大鼠膽汁中大部分甜菊醇會(huì)與葡萄糖醛酸結(jié)合，但糞便中主要以原型排泄，表明在經(jīng)糞便排泄前葡萄糖醛酸基又會(huì)被水解而釋放出原型。本研究中，甜茶素雖與上述苷類結(jié)構(gòu)類似，但經(jīng)大鼠口服后能夠快速以原型被吸收，推測(cè)是由于甜茶素結(jié)構(gòu)中糖基數(shù)量較上述苷類少。大鼠尿液和糞便中主要檢測(cè)到甜茶素原型、苷元和苷元的羥基化產(chǎn)物，極少或未檢測(cè)到葡萄糖醛酸化、硫酸酯化和環(huán)氧化等結(jié)合型代謝產(chǎn)物，推測(cè)這些產(chǎn)物在排泄前可能被降解而失去結(jié)合基團(tuán)，更容易進(jìn)入尿液或糞便。另外，葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)主要發(fā)生在肝臟，產(chǎn)物主要經(jīng)膽汁排泄，本研究中的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物主要在血漿中被檢測(cè)到，并且該基團(tuán)大部分與苷元甜菊醇結(jié)合，與Geuns等[23]的甜菊苷體內(nèi)代謝研究結(jié)果相似，推測(cè)甜茶素在大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物會(huì)經(jīng)膽汁排泄至胃腸道，重新進(jìn)入血液循環(huán)。

藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明，甜茶素在大鼠體內(nèi)能夠被迅速吸收，表觀分布容積較大，提示其可能存在較大程度的組織分布，課題組前期在ig甜茶素的大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦組織中均檢測(cè)到甜茶素，但還有待深入研究。本研究在大鼠膽汁中主要檢測(cè)到一些結(jié)合型代謝產(chǎn)物，尿液和糞便中主要檢測(cè)到甜茶素原型、苷元和羥基化產(chǎn)物，對(duì)比峰面積，糞便中的原型、苷元和苷元的羥基化產(chǎn)物含量較高，但排泄速率和累積排泄量還有待進(jìn)一步研究，甜茶素中苷元甜菊醇的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程也有待深入探究。

綜上，本研究利用UPLC-Q-TOF-MS方法對(duì)大鼠ig甜茶素后的尿液、糞便、膽汁及血漿樣品進(jìn)行分析，共鑒定出1種原型成分和58種代謝物，涉及廣泛的I相和II相代謝反應(yīng)。甜茶素在大鼠體內(nèi)能夠直接以原型被吸收，經(jīng)歷的主要代謝途徑有脫氫化、羥基化、環(huán)氧化、去糖基化、葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸酯化等。甜茶素大部分以原型、苷元和苷元的羥基化產(chǎn)物經(jīng)尿液和糞便排泄，主要排泄途徑為糞便。本研究還建立了基于UPLC-MS/MS測(cè)定大鼠血漿中甜茶素的方法，并以該方法初步研究甜茶素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)甜茶素能夠被快速吸收，為甜茶素的體內(nèi)轉(zhuǎn)化過(guò)程和藥理作用提供依據(jù)，為其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification of metabolites and pharmacokinetic study of rubusoside in rats

JIANG Man-jing, MENG Jin-ying, YAN Xia-qing, QIN Shu-ting, LI Yao-hua, FAN Lan-lan

School of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China

To identify the metabolites and study the pharmacokinetic characteristics of rubusoside in rats.SD rats were ig rubusoside (125 mg/kg), metabolites in their urine, feces, bile and plasma collected at different time periods were identified by ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF-MS/MS). A UPLC-MS/MS method was developed and validated for determination of rubusoside in rat plasma. The pharmacokinetic characteristics of rubusoside in rats were investigated.One prototype component and 58 metabolites were detected. The main metabolic pathways of rubusoside were dehydrogenation, hydroxylation, deglucosylation, glucuronic acid conjugation, sulfation, etc. Rubusoside was absorbed rapidly into the blood after intragastric administration. Maximum concentration (max) and the half-life (1/2) of rubusoside were 0.12 h and 4.20 h, respectively. Meanwhile, the large apparent volume of distribution indicated possible tissue distribution of rubusoside.Rubusoside was absorbed fast and experienced extensive metabolismin rats, which provide a reference for further investigation on therapeutic material basis of rubusoside.

rubusoside; metabolites; pharmacokinetics; UPLC-Q-TOF-MS/MS; UPLC-MS/MS

R285.61

A

0253 - 2670(2021)13 - 3914 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.015

2020-12-31

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31660095）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81903918）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2019JJA140644）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)一流學(xué)科項(xiàng)目（2019XK117）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（YCSZ2020011，YCSZ20190028）[1]

姜蔓菁（1997—），女，碩士研究生，主要從事中藥民族藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

樊蘭蘭（1980—），研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥民族藥質(zhì)量控制研究。Tel: (0771)4953513 Email: fanll2015@gxtcmu.edu.cn

李耀華（1978—），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥質(zhì)量控制研究。Tel: (0771)4953513 E-mail: liyh2001@gxtcmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]