梁艷妮，程 雯，吳柯楠，于金高，張東博，張 珍，王 征

? 藥理與臨床 ?

基于高通量測序技術研究靛玉紅對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響

梁艷妮，程 雯，吳柯楠，于金高，張東博，張 珍，王 征*

陜西中醫(yī)藥大學 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育），陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083

研究靛玉紅對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）模型小鼠腸道菌群的影響及其作用機制。雄性昆明種小鼠隨機分為對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶（125 mg/kg）組和靛玉紅低、中、高劑量（7.5、15.0、30.0 mg/kg）組，采用3% DSS自由飲用7 d誘導小鼠UC模型，第8天ig藥物，連續(xù)干預7 d后，觀察小鼠體征進行疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠結(jié)腸組織病理變化；采用ELISA法檢測小鼠血清中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、IL-10、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；各組收集5份小鼠腸道內(nèi)容物樣本，采用細菌16S rRNA基因V4～V5區(qū)高通量測序，分析小鼠腸道內(nèi)容物的菌群變化。與模型組比較，靛玉紅組小鼠DAI評分顯著降低（＜0.05），結(jié)腸組織損傷減輕，炎性細胞浸潤減少，血清中促炎細胞因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α水平顯著降低（＜0.05），抗炎細胞因子IL-10水平呈升高趨勢。16S rRNA基因測序結(jié)果顯示，模型組小鼠腸道菌群多樣性降低，靛玉紅組小鼠腸道菌群多樣性升高，在門水平主要表現(xiàn)為擬桿菌門與厚壁菌門比例回升，屬水平7個菌屬Lachnospiraceae_FCS020_group、_9、_brachy_group、別樣棒菌屬、鏈球菌屬、Erysipelotrichaceae_ UCG_003和可能與靛玉紅對UC的治療作用相關。靛玉紅能夠通過調(diào)節(jié)UC小鼠腸道菌群、抑制腸道炎性反應，從而治療UC。

靛玉紅；潰瘍性結(jié)腸炎；16S rRNA基因測序；腸道菌群；多樣性分析

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種累及直腸、結(jié)腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性結(jié)腸炎性反應，以腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重為主要臨床表現(xiàn)，是結(jié)直腸癌的高相關性疾病[1]。隨著人們生活方式的改變，我國UC患者比例不斷升高[2-4]。UC的發(fā)病機制普遍認為與免疫異常、遺傳易感、環(huán)境因素、腸道菌群失衡等相關[5]，臨床治療藥物主要有氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，長期服用易出現(xiàn)嚴重的不良反應[6]。中醫(yī)認為UC病理因素主要為濕熱、瘀熱、熱毒、痰濁、氣滯、血瘀等，清熱燥濕為其主要治法[7]。青黛為爵床科植物馬藍(Nees) Bremek.、蓼科植物蓼藍Ait.或十字花科植物松藍Fort.的葉或莖葉經(jīng)加工制得的干燥粉末、團塊或顆粒，具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚的功效，符合中醫(yī)治療UC“清熱利濕、涼血止血”的用藥策略，臨床常使用含青黛的方劑如青黛散、復方青黛顆粒、清腸溫中方、錫類散、潰結(jié)方等治療UC[8-10]。靛玉紅為天然雙吲哚類化合物，是青黛中的主要成分之一，也是大青葉、板藍根中的有效成分，臨床用于治療慢性粒細胞白血病、炎性疾病和腫瘤等[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，靛玉紅能夠干預UC的發(fā)生和發(fā)展[13-15]。

腸道菌群在人體健康中發(fā)揮著關鍵作用，腸道菌群與宿主互利共生，參與重要的代謝、免疫和腸道保護作用。正常菌群的種類、數(shù)量和比例異常時，免疫系統(tǒng)失衡、代謝紊亂，導致腸道黏膜損傷。腸道菌群紊亂可能是UC發(fā)生和遷延難愈的主要原因之一[16-18]，因此微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)腸道菌群已成為臨床治療炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的常用手段。本課題組前期研究結(jié)果表明，青黛可以調(diào)節(jié)葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的UC小鼠腸道菌群失衡，可能與厭氧的革蘭陽性菌曲霉菌屬、消化球菌屬密切相關[19]。本研究采用高通量測序技術對小鼠腸道菌群進行16S RNA基因測序，對菌群結(jié)構和多樣性變化進行深入分析，探究靛玉紅對DSS誘導UC小鼠腸道菌群的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性昆明種小鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（川）2015-030。動物飼養(yǎng)于陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心SPF級實驗動物中心，室內(nèi)保持12 h明暗交替。動物實驗遵循陜西中醫(yī)藥大學實驗動物管理和使用的規(guī)定，符合3R原則。

1.2 藥品與試劑

靛玉紅（批號18121203，質(zhì)量分數(shù)為98%）購自成都普菲德生物科技有限公司；DSS（批號S3045）購自美國MP Biomedicals公司；柳氮磺胺吡啶（批號22200301）購自上海福達制藥有限公司；小鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、IL-10 ELISA試劑盒（批號分別為M190322-004a、M190322-104a、M190322-003a）購自欣博盛生物科技有限公司；IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號分別為201908、201908）購自南京森貝伽生物科技有限公司；Stool DNA Kit試劑盒（批號00D4015040000L10T002）購自美國Omega公司；FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（批號7E470L0）、VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V3（批號7E401J0）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Prime Star GXL DNA Polymerase（批號AJ62481A）購自日本Takara公司；Agencourt AMPure XP（批號17900700）購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 儀器

5424R型高速臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；超低溫冰箱、NanoDrop 2000超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；GeneAmp 9700型PCR擴增儀（美國ABI公司）；高通量測序儀（美國Illumina公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

雄性小鼠適應性飼養(yǎng)3 d后隨機分成對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶（125 mg/kg）組和靛玉紅低、中、高劑量（7.5、15.0、30.0 mg/kg）[15]組，每組10只。對照組飲用純凈水，其余各組自由飲用3% DSS 7 d誘導UC模型。柳氮磺胺吡啶腸溶片研磨后，溶于超純水配制成質(zhì)量濃度為6.25 mg/mL的混懸液；靛玉紅溶于超純水分別配制成質(zhì)量濃度為0.375、0.750、1.500 mg/mL的溶液。造模后第8天，各給藥組ig相應藥物（20 mL/kg），對照組和模型組ig等體積純凈水，1次/d，連續(xù)7 d。自造模第1天起記錄小鼠體質(zhì)量、大便性狀、便血特征，進行疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分，評分標準見表1。

DAI＝(體質(zhì)量下降評分＋大便性狀評分＋大便隱血情況評分)/3

表1 DAI評分標準

2.2 靛玉紅對UC小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α水平的影響

末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，吸入乙醚麻醉，摘眼球取血，3000 r/min離心10 min，吸取血清，按試劑盒說明書檢測血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α水平。

2.3 靛玉紅對UC小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

小鼠脫頸椎處死，無菌條件下解剖，距離肛門5 cm處取結(jié)腸段1 cm，于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)包埋、切片后進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。

2.4 腸道菌群測序

各組小鼠收集5份腸道內(nèi)容物，采用Stool DNA Kit試劑盒抽提總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測DNA提取質(zhì)量，以16S rRNA基因V4～5可變區(qū)進行PCR擴增，引物序列：上游引物5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTA-3’、下游引物5’-CCCCGYCAATTCMTTTRAG-3’。使用FastPure DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，利用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit純化后采用QuantiFluorTM-ST定量，根據(jù)每個樣本測序量要求進行相應比例混合；根據(jù)VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V3試劑盒進行文庫構建，采用Illumina MiSeq平臺測序得到Pair-End（PE）雙端序列，擴增子建庫后使用Trimmomatic v0.36和Pear v0.9.6軟件對原始數(shù)據(jù)質(zhì)控；利用FLASH v1.2.0和Pear v0.9.6軟件進行拼接，利用UCHIME方法去除序列中的嵌合體，采用QIIME v1.8.0軟件中UPARSE聚類法按97%相似度進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類。

2.5 生物信息學分析

將OTU代表序列對比16S rRNA數(shù)據(jù)庫，采用RDP分類算法進行物種比對注釋，置信度閾值為0.7，獲得OTU代表序列的分類學信息，并在各分類水平上分析樣本群落組成?；贠TU聚類結(jié)果采用mothur軟件進行α多樣性分析和主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）。根據(jù)線性判別分析（liner discriminant analysis，LDA）進行LEfSe多級物種差異判別分析，找出組間在豐度上有顯著差異的物種。

2.6 宏基因組預測與分析

PICRUSt軟件可以基于16S rRNA基因測序得到的OTUs預測群落的基因類型與數(shù)量，結(jié)合京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、直系同源蛋白簇（clusters of orthologous groups of proteins，COG）和Pfam數(shù)據(jù)庫進行注釋作功能分析。采用PICRUSt軟件將對照組、模型組和靛玉紅高劑量組樣品測序的OTU映射到GreenGene數(shù)據(jù)庫，進行菌群功能和代謝途徑預測分析。

2.7 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 靛玉紅對UC小鼠DAI評分的影響

對照組小鼠活動敏捷、攝食正常、體質(zhì)量正常增加、無便血、腹瀉情況；如圖1所示，其余各組小鼠造模后逐漸出現(xiàn)懶動、翻毛、扎堆、體質(zhì)量下降、排稀便甚至便血、死亡，造模7 d后小鼠DAI評分上升到3分，提示UC模型制備成功。各給藥組小鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量減輕、腹瀉便血等均有不同程度地改善，DAI評分顯著降低（＜0.05），表明靛玉紅對UC具有治療作用。

與模型組比較：*P＜0.05

3.2 靛玉紅對UC小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α水平的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高（＜0.05），抗炎因子IL-10水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中IL-8和IL-1β水平顯著降低（＜0.05），柳氮磺胺吡啶組和靛玉紅中、高劑量組小鼠血清中IL-6水平顯著降低（＜0.05），柳氮磺胺吡啶組和靛玉紅低、中劑量組小鼠血清中TNF-α水平顯著降低（＜0.05），表明靛玉紅能夠調(diào)節(jié)UC小鼠體內(nèi)促炎因子和抑炎因子的平衡。

與對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

3.3 靛玉紅對UC小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

如圖3所示，結(jié)腸腸壁由內(nèi)至外依次為黏膜層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層和漿膜層。對照組結(jié)腸組織結(jié)構完整，可見明顯的隱窩和大量杯狀細胞，隱窩邊緣規(guī)則，無炎性細胞異常浸潤。模型組結(jié)腸黏膜層可見隱窩萎縮和上移，隱窩邊緣不規(guī)則，杯狀細胞大量減少，中性粒細胞浸入黏膜層和隱窩。柳氮磺胺吡啶組結(jié)腸結(jié)構完整，雖然仍有少量炎性細胞浸潤，但隱窩和杯狀細胞已大量可見。靛玉紅組出現(xiàn)大量杯狀細胞，隱窩結(jié)構有所恢復，炎性細胞減少。表明靛玉紅能夠緩解DSS誘導的UC小鼠結(jié)腸組織損傷。

U型虛線表示隱窩；圓形虛線表示杯狀細胞；矩形實線表示中性粒細胞浸潤

3.4 靛玉紅對UC小鼠腸道菌群的影響

3.4.1 腸道菌群的物種注釋 如圖4-A所示，經(jīng)Illumina高通量測序共得到1396個OTUs，樣本間共有OTUs 267個。Venn圖可以直觀表現(xiàn)樣本的OTU數(shù)目及各組重疊情況，如圖4-B所示，1056個OTUs為3組間共有，占比為75.6%，對照組和模型組共有1211個OTUs，模型組和靛玉紅高劑量組共有1145個OTUs，經(jīng)鑒定分別屬于15個門和208個屬。

C-對照組 M-模型組 HINR-靛玉紅高劑量組

如圖5-A所示，在門水平上，各組樣品主要包括擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、藍藻菌門、軟壁菌門、脫鐵桿菌門等，其中擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度占95%以上，變形菌門次之。經(jīng)Wilcoxon分析，模型組厚壁菌門相對豐度顯著上調(diào)，擬桿菌門相對豐度顯著下調(diào)；與模型組比較，靛玉紅高劑量組厚壁菌門相對豐度降低，擬桿菌門相對豐度升高，但無顯著差異。

如圖5-B所示，在屬水平上，各組樣品相對豐度較高的菌屬分別為Prevotellaceae_UCG-001、乳酸桿菌屬、另枝菌屬、別樣棒菌屬、Prevotellaceae_UCG-003、擬桿菌屬、Lachnospiraceae_NK4A136_ group、Ruminococcaceae_UCG-014、Rikenellaceae_ RC9_gut_group、、擬普雷沃氏菌屬、_1。與對照組比較，模型組Prevotellaceae_UCG-001相對豐度降低，別樣棒菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、擬普雷沃氏菌屬、_1、等相對豐度升高；與模型組比較，靛玉紅高劑量組PrevotellaceaeUCG-001、_1、別樣棒菌屬和等相對豐度回調(diào)，表明普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬、別樣棒菌屬和等與靛玉紅對UC的治療作用相關。

3.4.2 α多樣性分析 Rank-abundance曲線可以分析物種豐度和物種均勻度，水平方向曲線的寬度反映物種豐度，曲線在橫軸上范圍越大則物種的豐度越高；曲線平滑程度反映物種均度，曲線越平緩則物種分布越均勻。Specaccum物種累積曲線描述隨著樣本量增大物種增加的情況，反映了持續(xù)抽樣下新物種出現(xiàn)的速率，可用于判斷樣本量是否充分并估計物種豐富度。如圖6-A、B所示，隨著測序深度和樣本量的增加，絕大多數(shù)微生物都能被測序，且物種豐富度不再隨樣本量增加而增加，表明本研究中測序深度和樣本量能夠滿足分析需求。α多樣性指數(shù)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，經(jīng)過最低序列數(shù)的樣本數(shù)抽平分析，得到反映群落豐富度的指數(shù)observed_species和反映群落多樣性的指數(shù)Shannon。如圖6-C、D所示，模型組和靛玉紅高劑量組對腸道菌群物種數(shù)量無顯著影響，但是能夠調(diào)節(jié)不同菌群豐度的消長，使菌群物種多樣性水平產(chǎn)生變化；模型組Shannon指數(shù)降低，靛玉紅高劑量組Shannon指數(shù)升高，表明靛玉紅能夠改善腸道菌群結(jié)構，優(yōu)化其物種多樣性指數(shù)。

圖5 門水平(A) 和屬水平(B) 的樣本物種組成分析

C-對照組 M-模型組 HINR-靛玉紅高劑量組

3.4.3 β多樣性分析 β多樣性分析利用各樣本序列間的進化關系及豐度信息計算樣本間距離，反映樣本間是否具有顯著的微生物群落差異。PCoA分析通過對一系列的特征值和特征向量進行排序，選擇排在前幾位的最主要特征值表現(xiàn)在坐標系里，沒有改變樣本點之間的相互位置而只改變坐標系統(tǒng)?；赽ray-curtis的PCoA二維圖見圖7，對照組、模型組和靛玉紅高劑量組樣品的菌群結(jié)構具有明顯差異，模型組和靛玉紅高劑量組較為接近，對照組相對差距較遠；模型組和靛玉紅高劑量組菌群輪廓一定程度上分開，表明UC小鼠腸道菌群結(jié)構發(fā)生變化，靛玉紅能夠恢復腸道菌群結(jié)構從而治療UC。

圖7 基于bray-curtis的PCoA分析

3.4.4 LEfSe分析 LEfSe分析可以實現(xiàn)多組間比較，找到組間在豐度上有顯著差異的物種。如圖8所示，與對照組比較，模型組別樣棒菌屬、擬桿菌屬、大腸志賀氏桿菌，擬普雷沃菌屬、考拉桿菌屬等17種菌屬相對豐度顯著上調(diào)，Prevotellaceae_UCG_001、別樣桿菌屬、Rikenellaceae_RC9_gut_group、_coprostanoligenes_group、副擬桿菌屬等22種菌屬相對豐度顯著下調(diào)；與模型組比較，靛玉紅高劑量組擬普雷沃菌屬Family_XIII_UCG_001、、Lachnospiraceae_ FCS020_group、_brachy_group、_9、_5、、螺桿菌屬、_group、厭氧棍狀菌屬11種菌屬相對豐度顯著上調(diào)，別樣棒菌屬、Prevotellaceae_NK3B31_group、Prevotellaceae_ UCG_003、、_fissicatena_ group、_coprostanoligenes_group、鏈球菌屬、和Erysipelotrichaceae_ UCG_003 9種菌屬相對豐度顯著下調(diào)；其中靛玉紅能夠顯著上調(diào)模型組中下調(diào)的、Lachnospiraceae_FCS020_group、_9、_brachy_group[16]等菌屬，顯著下調(diào)模型組中上調(diào)的別樣棒菌屬、鏈球菌屬、Erysipelotrichaceae_UCG_003等菌屬，表明靛玉紅對UC的治療作用與這些菌屬相對豐度的回調(diào)有關。

3.4.5 PICRUSt基因預測分析 如圖9所示，與對照組比較，模型組轉(zhuǎn)運蛋白、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細菌趨藥性、孢子形成等功能上調(diào)，核糖體、DNA修復和重組蛋白質(zhì)、嘧啶代謝、蛋白酶、DNA復制蛋白、能量代謝、嘌呤代謝、氧化磷酸化以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等功能下調(diào)；與模型組比較，靛玉紅高劑量組脂類代謝、細胞骨架蛋白、氯烷烴和氯烯烴的降解、脂質(zhì)代謝功能上調(diào)，氮代謝、葉酸生物合成、β-丙氨酸代謝、癌癥通路以及二苯乙烯、二庚烷和姜辣素的生物合成等功能下調(diào)。

圖8 各組樣品腸道菌群的LEfSe分析

圖9 PICRUSt功能預測分析

4 討論

腸道微生態(tài)與消化系統(tǒng)疾病[16,20]、心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、代謝綜合征[21]、腫瘤[22]等關系密切，腸道菌群在維持腸道穩(wěn)態(tài)及宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育和激活中起重要作用。IBD患者體內(nèi)腸道菌群嚴重失調(diào)，菌群多樣性及豐度下降，出現(xiàn)不穩(wěn)定的菌群，腸道共生菌減少，雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌顯著減少，腸道致病菌及條件致病菌數(shù)量增加，導致腸黏膜損傷[21]。IBD不同發(fā)病時期腸黏膜菌群結(jié)構存在差異[23]?；顒悠赨C患者腸道中的有益菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌、消化球菌等菌群數(shù)量明顯少于緩解期和健康者，致病菌如大腸桿菌、腸球菌和小梭菌菌群數(shù)量顯著高于緩解期和健康者；緩解期UC患者腸道擬桿菌群數(shù)量明顯低于健康者[24]。腸道菌群可以促進免疫系統(tǒng)的成熟，腸道菌群產(chǎn)生的信號分子參與調(diào)控腸道上皮細胞的凋亡、增殖和分化，腸道菌群失衡導致IBD患者T細胞分化異常。目前較多研究使用益生菌、益生元、糞菌移植等恢復腸道微生物穩(wěn)態(tài)，治療炎性腸病[5]。中醫(yī)根據(jù)UC泄瀉、腹痛的病因病機，以運脾化濕、通利氣機為治療原則，臨床上常用健脾滲濕、清熱燥濕、活血化瘀等中藥復方或有效組分，通過增強有益菌且減弱致病菌及條件致病菌扶正祛邪，調(diào)節(jié)宿主腸道菌群平衡及免疫反應，從而治療UC[25-26]。

青黛咸寒，具有清熱解毒、清腸胃邪熱的功效?！侗窘?jīng)逢原》中記載“青黛，瀉肝膽，散郁火，治溫毒發(fā)斑及產(chǎn)后熱痢下重”。靛玉紅能夠通過下調(diào)UC大鼠結(jié)腸組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）表達水平，上調(diào)堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，）、腸三葉因子（intestinal trefoil factor，）mRNA表達水平，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路，進而抑制腸道細胞凋亡和腸道炎性反應，促進腸黏膜修復[15]。靛玉紅能夠降低DSS誘導的UC小鼠血清中促炎因子水平，升高抗炎因子水平，上調(diào)CD4＋T細胞叉狀頭樣轉(zhuǎn)錄因子P3（Forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）表達，抑制氧化應激反應和腸上皮細胞凋亡[14]；靛玉紅能夠抑制UC小鼠核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的活化。本課題組前期研究表明，青黛和色胺酮對DSS誘導的UC小鼠腸道微生態(tài)具有調(diào)節(jié)作用，青黛對UC治療作用可能與曲霉菌屬和消化球菌屬密切相關，色胺酮對UC的治療作用可能與Erysipelotrichaceae_UCG_003、Rikenellaceae_ RC9_gut_group和密切相關[19]。本研究從DAI評分、結(jié)腸組織形態(tài)及血清中細胞因子水平證實靛玉紅對UC小鼠具有治療作用，能夠調(diào)節(jié)失衡的炎性因子水平；并通過16S RNA基因測序探究了靛玉紅對UC小鼠腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)靛玉紅能夠恢復UC小鼠厚壁菌門與擬桿菌門比例，調(diào)節(jié)不同菌群相對豐度，加快腸道菌群結(jié)構向正常水平恢復，Lachnospiraceae_FCS020_group、_9、_brachy_group、別樣棒菌屬、鏈球菌屬、Erysipelotrichaceae_UCG_003和可能與靛玉紅對UC的治療作用密切相關。

腸道菌群失調(diào)介導的免疫損傷是IBD的重要發(fā)病機制，但腸道微生態(tài)與IBD的關系尚未完全明確。本研究從腸道微生物角度探討靛玉紅對UC小鼠腸道菌群結(jié)構的影響，發(fā)現(xiàn)靛玉紅對UC小鼠腸道菌群結(jié)構與多樣性的調(diào)節(jié)作用與其對UC的治療作用具有相關性。后續(xù)將進一步結(jié)合宏基因組測序、蛋白質(zhì)組學、代謝組學等技術從腸道菌群角度深入研究靛玉紅治療UC的作用機制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Ungaro R, Mehandru S, Allen P B,. Ulcerative colitis [J]., 2017, 389(10080): 1756-1770.

[2] Prideaux L, Kamm M A, de Cruz P P,. Inflammatory bowel disease in Asia: A systematic review [J]., 2012, 27(8): 1266-1280.

[3] 劉篤佳, 王媛媛, 馬旭. 潰瘍性結(jié)腸炎的流行病學研究進展 [J]. 中國燒傷創(chuàng)瘍雜志, 2017, 29(3): 214-217.

[4] 呂蘭婷, 王麗娟. 中國潰瘍性結(jié)腸炎干預的衛(wèi)生經(jīng)濟學評價研究進展 [J]. 中國藥物經(jīng)濟學, 2019, 14(1): 114-121.

[5] 周林妍, 李巖. 炎癥性腸病與腸道微生態(tài)的研究進展 [J]. 微生物學通報, 2020, 47(5): 1600-1606.

[6] 孫中美, 胡立明, 毛堂友, 等. 潰瘍性結(jié)腸炎中西醫(yī)治療進展 [J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2018, 20(11): 171-175.

[7] 張聲生, 沈洪, 鄭凱, 等. 潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識意見（2017）[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2017, 32(8): 3585-3589.

[8] 姜慧, 李軍祥, 胡立明, 等. 青黛及其復方治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究進展 [J]. 中國中醫(yī)急癥, 2019, 28(4): 740-742.

[9] Naganuma M, Sugimoto S, Mitsuyama K,. Efficacy of indigo naturalis in a multicenter randomized controlled trial of patients with ulcerative colitis [J]., 2018, 154(4): 935-947.

[10] Naganuma M. Treatment with indigo naturalis for inflammatory bowel disease and other immune diseases [J]., 2019, 42(1): 16-21.

[11] 賴金倫, 劉玉輝, 劉暢, 等. 中藥靛玉紅作用機理及其臨床應用研究進展 [J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2017, 36(1): 76-79.

[12] Sugimoto S, Naganuma M, Kanai T. Indole compounds may be promising medicines for ulcerative colitis [J]., 2016, 51(9): 853-861.

[13] Tokuyasu N, Shomori K, Amano K,. Indirubin, a constituent of the Chinese herbal medicine qing-dai, attenuates dextran sulfate sodium-induced murine colitis [J]., 2018, 61(2): 128-136.

[14] Gao W Y, Zhang L D, Wang X Q,. The combination of indirubin and isatin attenuates dextran sodium sulfate induced ulcerative colitis in mice [J]., 2018, 96(5): 636-645.

[15] 李楠, 柳越冬, 王長洪, 等. 靛玉紅緩解三硝基苯磺酸致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎及其機制研究 [J]. 中國藥理學通報, 2018, 34(12): 1689-1692.

[16] Zhang S L, Wang S N, Miao C Y. Influence of microbiota on intestinal immune system in ulcerative colitis and its intervention [J]., 2017, 8: 1674.

[17] Prosberg M, Bendtsen F, Vind I,. The association between the gut microbiota and the inflammatory bowel disease activity: A systematic review and meta-analysis [J]., 2016, 51(12): 1407-1415.

[18] 杜珊, 周月, 陳斌. 中醫(yī)藥與腸道微生態(tài)相關性研究進展 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2019, 25(18): 182-188.

[19] Liang Y N, Yu J G, Zhang D B,. Indigo naturalis ameliorates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice by modulating the intestinal microbiota community [J]., 2019, 24(22): E4086.

[20] 岳宏宇, 叢春莉, 李艷梅. 腸道微生態(tài)與腸道疾病關系的研究進展 [J]. 中國真菌學雜志, 2020, 15(4): 240-243.

[21] 王萍, 王穎, 萬紅, 等. 腸道菌群在代謝綜合征發(fā)病機制中的作用 [J]. 中國糖尿病雜志, 2020, 28(2): 147-149.

[22] 滕俊, 趙艷芬, 姜云寧, 等. 腸道菌群與肺癌的相關性 [J]. 中國肺癌雜志, 2020, 23(10): 909-915.

[23] 劉陽, 徐纓龍. 不同發(fā)病時期潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群差異及對血清TLRs/NF-κB和SOCS-3及Cingulin蛋白水平的影響 [J]. 中國微生態(tài)學雜志, 2020, 32(11): 1285-1288.

[24] 梁淑文, 王曉英, 屈昌民, 等. 潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群變化的臨床研究 [J]. 醫(yī)學研究雜志, 2015, 44(9): 60-62.

[25] 劉素萍, 蔣青青, 金晶, 等. 中醫(yī)藥調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎腸道菌群研究概況[J]. 中華中醫(yī)藥學刊, 2021, 39(3): 208-212.

[26] 曹暉, 吳東升, 張彧, 等. 基于高通量測序技術研究芍藥湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群的影響 [J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2021, 28(1): 61-66.

Effect of indirubin on intestinal flora in mice with ulcerative colitis based on high-throughput sequencing technology

LIANG Yan-ni, CHENG Wen, WU Ke-nan, YU Jin-gao, ZHANG Dong-bo, ZHANG Zhen, WANG Zheng

Co-construction Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine Resources Industrialization by Shaanxi & Education Ministry, State Key Laboratory of Research & Development of Characteristic Qin Medicine Resources (Cultivation), Shaanxi Innovative Drug Research Center, Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712083, China

To investigate the effect and mechanism of indirubin on intestinal flora of mice with ulcerative colitis (UC) induced by dextran sulfate sodium (DSS).Male kunming mice were randomly divided into control group, model group, salazosulfapyridine (125 mg/kg) group, and low-, medium-, high-dose (7.5, 15.0, 30.0 mg/kg) indirubin groups, UC model was induced by free drinking 3% DSS for 7 d. On 8th day, mice were ig drugs, after continuous intervention for 7 d, signs of mice were observed for disease activity index (DAI) score; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of colon tissue; ELISA method was used to detect levels of interleukin-6 (IL-6), IL-8, IL-10, IL-1β and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in serum of mice. Five samples of intestinal contents in each group were collected, and bacterial 16S rRNA gene V4—V5 regions high-throughput sequencing were used to analyze the flora of intestinal contents variety.Compared with model group, DAI score in indirubin group was significantly reduced (< 0.05), colon tissue damage was reduced, inflammatory cell infiltration was decreased, levels of pro-inflammatory cytokines such as IL-6, IL-8, IL-1β and TNF-α in serum were significantly decreased (< 0.05), level of anti-inflammatory cytokine IL-10 showed an increasing trend. 16S rRNA gene sequencing results showed intestinal flora diversity of mice in model group was decreased, and intestinal flora diversity in indirubin group was increased; Ratio of Bacteroides/Firmicutes was increased at phylum level, seven genus such as Lachnospiraceae_FCS020_group,_9,_brachy_group,,, Erysipelotrichaceae_UCG_003 andmay be related to the therapeutic effect of indirubin on UC.Indirubin can treat UC by regulating intestinal flora of UC mice and inhibiting intestinal inflammation.

indirubin; ulcerative colitis; 16S rRNA gene sequencing; intestinal flora; diversity analysis

R285.5

A

0253 - 2670(2021)13 - 3896 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.013

2020-12-18

國家自然科學基金資助項目（81803951）；國家自然科學基金資助項目（81973687）；陜西省教育廳重點科研項目（20JY012）；陜西高校青年創(chuàng)新團隊（陜教[2019]90號）；陜西高校第三批“青年杰出人才支持計劃”項目（陜教工[2019]95號）；陜西省首批中醫(yī)藥優(yōu)秀中青年科技骨干人才支持計劃

梁艷妮（1986—），女，博士，副教授，從事藥物活性評價研究。E-mail: aiziji_2005@126.com

王 征，男，副教授，碩士生導師，從事中藥活性成分發(fā)現(xiàn)與評價研究。E-mail: wazh0405@126.com

[責任編輯 李亞楠]