王蘭英，孫吉利，蘇家茹

青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266011

乳腺癌的發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中位于首位，全球每年約有40多萬人因乳腺癌死亡［1］。我國乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，且發(fā)病趨于年輕化［2］。目前對乳腺癌的治療以手術為主，但乳腺癌細胞通常通過血液和淋巴結遷移擴散至全身，給治療帶來困難［3］。由于腫瘤具有異質(zhì)性，不同階段乳腺癌患者對藥物選擇存在差別，因此，常存在治療后腫瘤細胞未完全清除的情況，造成治療失敗。此外，腫瘤細胞耐藥性也是影響治療效果的重要因素［4］。因此，研發(fā)新的治療方案，提高乳腺癌治療效果顯得尤為重要。雞血藤作為我國傳統(tǒng)藥材，具有補血活血、通絡強筋等功效。研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤總黃酮具有干擾腫瘤細胞周期、抑制腫瘤細胞轉移的作用，但其作用機制未完全明確［5］。Wnt/β-catenin通路對細胞生長發(fā)育嚴格精準調(diào)控，但當其過度活化時則會導致腫瘤的生成。已有研究證實，Wnt/β-catenin通路的異常調(diào)控可導致肺癌、前列腺癌、直腸癌、肝癌等［6-9］。本實驗基于對Wnt/β-catenin通路的調(diào)控作用研究雞血藤總黃酮對人乳腺癌細胞株MCF-7增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響。

1 材料

1.1 細胞人乳腺癌細胞株MCF-7（武漢尚恩生物技術有限公司，批號：190351），保存于-80℃冰箱。

1.2 藥物與試劑阿霉素（山東西亞化學工業(yè)有限公司，純度≥99.0%，貨號：A16278）；蘆丁（北京中科質(zhì)檢生物技術有限公司，貨號：202597）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：11054020、16140071）；乳酸脫氫酶染色液（四唑鹽法）（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：GL0510）；吉姆薩染液試劑盒（北京雷根生物技術有限公司，貨號：DM002）；RNA提取試劑盒（上海東寰生物科技有限公司，貨號：M00501）；Trizol、反轉錄試劑盒［賽默飛世爾科技（中國）有限公司，貨號：15596018、K1691］；RT-qPCR試劑盒（美國賽默飛公司，貨號：AB4105A）；蛋白裂解試劑盒（上海江林生物科技有限公司，貨號：P1160）；Wnt1、β-catenin、Cyclin-D1、c-Myc、MMP-7、β-catenin磷酸化一抗（上海信裕生物科技有限公司，貨號：xy-WNTi-Hu、xy-E11315、xy-E10333、xy-1732R、xy-0423R、xy-2063R）；β-actin一抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔二抗（美國Cell Signaling Technology公司，貨號：4967S、7074）；TUNEL法試劑盒（德國Merck-Calbiochem公司，貨號：G3250）；電化學發(fā)光（Enhanced Chemiluminescent，ECL）顯色試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司，貨號：P1260）；4%多聚甲醛、二甲基亞砜、乙醇（山東西亞化學工業(yè)有限公司，貨號：B14435、A296671、A10140）；MTT粉（上海尚寶生物科技有限公司，貨號：T10182）；引物合成委托北京睿博興科生物技術有限公司。

1.3 儀器Herocell 240細胞培養(yǎng)箱（上海潤度生物科技有限公司）；DNM-9602G酶標儀（北京普朗新技術有限公司）；JY300E電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；Axio Imager2光學顯微鏡（北京普瑞賽司儀器有限公司）；RT-qPCR儀（美國賽默飛公司）。

2 方法

2.1 藥物制備雞血藤總黃酮的提取：取雞血藤5.0 g，粉碎成粗粉，加入50%乙醇100 mL，加熱回流提取2.5 h，重復1次，過濾合并濾液，減壓回收乙醇，得到雞血藤總黃酮；以蘆丁為對照品，測得其中雞血藤總黃酮的含量＞80%。

2.2 細胞培養(yǎng)與干預人乳腺癌細胞株MCF-7培養(yǎng)基由10%胎牛血清和90%DMEM培養(yǎng)基配置，細胞培養(yǎng)在5%CO2、37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中，當細胞生長至對數(shù)期時，按照每孔1×105個細胞加入96孔板中培養(yǎng)，并將其分為5組，陰性對照組、陽性對照組、雞血藤總黃酮高、中、低劑量組。陽性對照組培養(yǎng)基中加入阿霉素至終濃度為5μmol·L-1，陰性對照組加入等體積的PBS溶液，雞血藤總黃酮高、中、低劑量組培養(yǎng)基中加入雞血藤總黃酮使其終濃度分別為80 mg·L-1、40 mg·L-1、20 mg·L-1，培養(yǎng)48 h。

2.3 MCF-7細胞增殖能力檢測分別在培養(yǎng)24 h和48 h時，每孔加入5 g·L-1MTT溶液20μL，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入200μL二甲基亞砜，室溫避光置于水平搖床上10 min，使用酶標儀讀取樣品在490 nm處光吸收值，計算增殖抑制率。

增殖抑制率＝（1-實驗組OD值/陰性對照組OD值）×100%

2.4 MCF-7細胞侵襲能力檢測藥物干預48 h后，取1×105個·mL-1的MCF-7細胞懸液200μL接種在Transwell小室上室中，小室底部有一層基質(zhì)膠，小室下加20%胎牛血清和80%DMEM培養(yǎng)基。將MCF-7細胞置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，擦去上室內(nèi)的細胞和基質(zhì)膠，使用吉姆薩染液試劑盒對附著在上室底部的細胞染色，光鏡下觀察并統(tǒng)計每個視野下細胞的數(shù)量。

2.5 MCF-7細胞遷移能力檢測藥物干預48 h后，將細胞接種在96孔板中，當細胞融合度達到90%以上時，用滅菌槍頭在有貼壁細胞的96孔板底部劃出一道劃痕，清除劃痕附近破碎的細胞，將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，光鏡下觀察并計算細胞遷移率。

細胞遷移率＝（1-培養(yǎng)48 h后的間距/起始劃痕間距）×100%

2.6 MCF-7細胞凋亡情況檢測藥物干預48 h后，收集細胞，用約1×106個細胞均勻鋪在蓋玻片上，自然晾干后使用4%多聚甲醛將細胞固定在載玻片，用PBS清洗2次后加TUNEL混合液并嚴格按照TUNEL試劑盒說明書進行操作。顯色后封片，光鏡下觀察并統(tǒng)計每個視野中凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)。

細胞凋亡指數(shù)＝細胞凋亡數(shù)/細胞總數(shù)×100%

2.7Wnt1、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和MMP-7的mRNA相對表達量檢測使用RT-qPCR檢測Wnt1、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和MMP-7的mRNA相對表達量。藥物干預48 h后，收集細胞于離心管中，加入Trizol，按照RNA提取試劑盒操作說明書對細胞總RNA進行提取，使用反轉錄試劑盒將細胞總RNA反轉錄為cDNA，按照NCBI基因庫中查找的目的基因序列，設計目的基因上下游引物，引物序列見表1。按照RT-qPCR試劑盒說明書將PCR程序設置為：95℃10 s，58℃30 s，72℃20 s，35個循環(huán)后，60℃5 min。GAPDH為內(nèi)參基因，通過2-△△Ct計算各目的基因mRNA相對表達量。

表1 引物序列

2.8 Wnt1、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和MMP-7蛋白表達量和β-catenin磷酸化水平檢測采用Western blot檢測Wnt1、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和MMP-7蛋白表達量和β-catenin磷酸化水平。藥物干預48 h后，將細胞收集到離心管中，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白。按照Western blot試劑盒說明書進行操作，加一抗（1∶1 000）、二抗（1∶1 000）后使用ECL顯色試劑盒顯色，以β-actin蛋白為內(nèi)參，計算各目的蛋白的相對表達量。

2.9 統(tǒng)計學方法研究結果使用均數(shù)±標準差（±s）表示，使用SPSS 16.0對結果進行統(tǒng)計學分析，多組樣本間比較使用單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗，組內(nèi)比較采用t檢驗。P＜0.05表示結果有顯著統(tǒng)計學差異。

3 結果

3.1 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞增殖抑制率的影響藥物干預24 h和48 h后，與陰性對照組比較，雞血藤總黃酮可明顯升高MCF-7細胞的增殖抑制率（P＜0.05），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性；與藥物干預24 h相比，不同劑量的雞血藤總黃酮干預48 h后MCF-7細胞的增殖抑制率均顯著升高（P＜0.05）。提示雞血藤總黃酮可明顯抑制MCF-7細胞增殖。見表2。

表2 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞增殖抑制率的影響 （±s，%）

表2 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞增殖抑制率的影響 （±s，%）

注：與24 h相比，*P＜0.05；與陰性對照組相比，a P＜0.05；與陽性對照組相比，b P＜0.05；與雞血藤總黃酮高劑量組相比，c P＜0.05；與雞血藤總黃酮中劑量組相比，d P＜0.05

24 h 48 h陰性對照組組別0 0陽性對照組 32.50±2.14a 51.28±6.06*a雞血藤總黃酮高劑量組 44.62±5.33ab 69.34±5.27*ab雞血藤總黃酮中劑量組 30.43±3.75ac 49.75±6.33*ac雞血藤總黃酮低劑量組 21.19±2.47abcd 34.57±4.69*abcd

3.2 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞凋亡的影響藥物干預48 h后，TUNEL法觀察MCF-7細胞凋亡情況。與陰性對照組比較，雞血藤總黃酮顯著升高MCF-7細胞的凋亡指數(shù)（P＜0.05），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。提示雞血藤總黃酮可促進MCF-7細胞凋亡。見圖1，表3。

圖1 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞凋亡的影響（×200）

表3 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞凋亡的影響 （±s）

表3 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞凋亡的影響 （±s）

注：與24 h相比，*P＜0.05；與陰性對照組相比，a P＜0.05；與陽性對照組相比，b P＜0.05；與雞血藤總黃酮高劑量組相比，c P＜0.05；與雞血藤總黃酮中劑量組相比，d P＜0.05

/%陰性對照組組別 凋亡指數(shù)5.12±1.02陽性對照組 34.50±5.18a雞血藤總黃酮高劑量組 45.47±6.22ab雞血藤總黃酮中劑量組 30.91±4.15ac雞血藤總黃酮低劑量組 22.14±3.38 abcd

3.3 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞侵襲活性的影響與陰性對照組比較，雞血藤總黃酮顯著降低Transwell小室上室底部MCF-7細胞數(shù)（P＜0.05），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。提示雞血藤總黃酮可抑制MCF-7細胞侵襲活性。見圖2，表4。

表4 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞侵襲活性的影響 （±s）

表4 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞侵襲活性的影響 （±s）

注：與陰性對照組相比，a P＜0.05；與陽性對照組相比，b P＜0.05；與雞血藤總黃酮高劑量組相比，c P＜0.05；與雞血藤總黃酮中劑量組相比，d P＜0.05

組別 陽性細胞數(shù)（個/視野）168.40±10.05陽性對照組 93.80±6.43a雞血藤總黃酮高劑量組 42.60±5.28ab雞血藤總黃酮中劑量組 96.20±7.75ac雞血藤總黃酮低劑量組 119.6±12.60陰性對照組abcd

圖2 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞侵襲活性的影響（×100）

3.4 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞遷移能力的影響與陰性對照組比較，雞血藤總黃酮顯著降低MCF-7細胞的遷移率（P＜0.05），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。提示雞血藤總黃酮可抑制MCF-7細胞的遷移能力。見圖3，表5。

表5 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞遷移能力的影響 （±s）

表5 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞遷移能力的影響 （±s）

注：與陰性對照組相比，a P＜0.05；與陽性對照組相比，b P＜0.05；與雞血藤總黃酮高劑量組相比，c P＜0.05；與雞血藤總黃酮中劑量組相比，d P＜0.05

組別 遷移率/%陰性對照組abcd 89.96±6.58陽性對照組 61.41±5.30a雞血藤總黃酮高劑量組 30.52±4.23ab雞血藤總黃酮中劑量組 62.35±6.08ac雞血藤總黃酮低劑量組 73.20±5.91

圖3 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞遷移能力的影響（×400）

3.5 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞中Wnt/β-catenin通路相關基因相對表達量的影響RT-qPCR檢測MCF-7細胞中Wnt1、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和MMP-7的mRNA相對表達量。與陰性對照組比較，雞血藤總黃酮顯著降低Wnt1、βcatenin、cyclinD1、c-Myc和MMP-7的mRNA表達（P＜0.05），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。見表6。

表6 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞中Wnt/β-catenin通路相關基因相對表達量的影響 （±s）

表6 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞中Wnt/β-catenin通路相關基因相對表達量的影響 （±s）

注：與陰性對照組相比，a P＜0.05；與陽性對照組相比，b P＜0.05；與雞血藤總黃酮高劑量組相比，c P＜0.05；與雞血藤總黃酮中劑量組相比，d P＜0.05

mRNA陰性對照組 1.78±0.26 0.65±0.05 1.25±0.15 1.50±0.22 0.8組別 Wnt1 mRNA β-catenin mRNA cyclinD1 mRNA c-Myc mRNA MMP-7 5±0.06陽性對照組 1.05±0.12a 0.42±0.09a 0.83±0.06a 0.96±0.14a 0.44±0.04a雞血藤總黃酮高劑量組 0.66±0.07ab 0.28±0.07ab 0.41±0.09ab 0.65±0.07ab 0.29±0.03ab雞血藤總黃酮中劑量組 1.10±0.12ac 0.41±0.10ac 0.85±0.10ac 0.98±0.13ac 0.42±0.04ac雞血藤總黃酮低劑量組 1.36±0.15abcd 0.55±0.08abcd 0.99±0.08abcd 1.21±0.16abcd 0.63±0.08 abcd

3.6 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達量及其磷酸化水平的影響Western blot檢測MCF-7細胞中Wnt1、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和MMP-7蛋白表達水平和β-catenin磷酸化水平。與陰性對照組比較，雞血藤總黃酮顯著降低Wnt1、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和MMP-7的蛋白表達水平（P＜0.05），顯著升高β-catenin磷酸化水平（P＜0.05），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。見圖4，表7。

圖4 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達量及其磷酸化水平的影響

表7 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達量及其磷酸化水平的影響 （±s）

表7 雞血藤總黃酮對MCF-7細胞中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達量及其磷酸化水平的影響 （±s）

注：與陰性對照組相比，a P＜0.05；與陽性對照組相比，b P＜0.05；與雞血藤總黃酮高劑量組相比，c P＜0.05；與雞血藤總黃酮中劑量組相比，d P＜0.05

組別 Wnt1/β-actin β-catenin/β-actin β-catenin磷酸化/β-actin cyclinD1/β-actin c-Myc/β-actin MMP-7/β-actin陰性對照組 2.08±0.32 0.56±0.05 0.14±0.01 1.05±0.12 1.3 5±0.11 1.03±0.14陽性對照組 1.45±0.21a 0.35±0.05a 0.36±0.06a 0.74±0.04a 0.88±0.13a 0.66±0.12a雞血藤總黃酮高劑量組 0.87±0.14ab 0.19±0.07ab 0.50±0.07ab 0.38±0.05ab 0.49±0.07ab 0.48±0.07ab雞血藤總黃酮中劑量組 1.48±0.18ac 0.30±0.06ac 0.33±0.05ac 0.76±0.07ac 0.90±0.12ac 0.65±0.09ac雞血藤總黃酮低劑量組 1.63±0.21abcd 0.43±0.04abcd 0.25±0.03abcd 0.89±0.04abcd 1.13±0.14abcd 0.81±0.10 abcd

4 討論

乳腺癌作為女性高發(fā)惡性腫瘤嚴重危害女性健康。雖然人們對乳腺癌發(fā)病機制的研究不斷深入，但是目前仍未完全明確［10］。化療是該病治療的重要手段，但是化療引起的腫瘤耐藥性不可忽視。研究報道，90%以上的化療失敗均為腫瘤細胞耐藥所致，且此類藥物不良癥狀較多，也使得患者預后不佳［11］。因此，尋找新型治療方案顯得尤為重要。乳腺癌在中醫(yī)上被認為是肝氣郁結、正氣不足所致，癌變過程被認為是毒邪停留、氣滯血瘀［12］。因此，治療需以活血化瘀、散節(jié)理氣為主。雞血藤為我國傳統(tǒng)中藥之一，其性味溫、苦、甘，具有補血活血、通絡活筋、調(diào)經(jīng)止痛的功效［13］。研究表明，雞血藤總黃酮為雞血藤的主要成分，具有調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、抗氧化、抗腫瘤等作用［14-15］，且雞血藤總黃酮在抑制腫瘤細胞的同時，對正常細胞毒性較小，安全性較高［16］?；诖?，本研究探討雞血藤總黃酮對乳腺癌細胞的抑制作用。

阿霉素是廣譜類抗腫瘤藥物，對乳腺癌具有較強抗癌活性，常見于乳腺癌的臨床治療，但因其不良反應及耐藥性導致該藥物在臨床治療中無法長期大量使用［17］。因此本研究使用阿霉素作為雞血藤總黃酮的陽性對照藥物具有可行性。本研究使用雞血藤總黃酮處理人乳腺癌細胞株MCF-7發(fā)現(xiàn)，MCF-7細胞增殖抑制率升高，侵襲和轉移能力降低，該結果與已有研究結果一致。此外，雞血藤總黃酮處理組與陽性對照組均表現(xiàn)出對MCF-7細胞抑制作用，但是高劑量雞血藤總黃酮效果優(yōu)于阿霉素。癌細胞除了能夠增殖、侵襲和轉移以外，細胞周期被改變，細胞凋亡被抑制，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因之一。研究證明，雞血藤可干擾細胞周期，促進人非小細胞肺癌A549細胞凋亡［18］。本研究通過TUNEL法檢測人乳腺癌MCF-7細胞凋亡指數(shù)發(fā)現(xiàn)，雞血藤總黃酮和阿霉素均可促進MCF-7細胞凋亡，高劑量雞血藤總黃酮效果優(yōu)于阿霉素。Wnt/β-catenin信號通路最初發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育形成中起重要作用，隨著研究的深入又被證實與腫瘤的形成、發(fā)展密切相關［19］。當該信號通路未被激活時，存在細胞質(zhì)中的β-catenin會與GSK-3β等蛋白結合形成復合物，并發(fā)生磷酸化，磷酸化的β-catenin會進入泛素化-蛋白酶體途徑發(fā)生降解，使得細胞質(zhì)中βcatenin維持較低水平，Wnt通路下游靶基因表達被抑制，維持正常細胞調(diào)控［20］。當細胞質(zhì)中存在Wnt配體時，GSK-3β被磷酸化，復合物無法形成導致β-catenin無法被磷酸化，在細胞質(zhì)中大量累積并處于游離狀態(tài)，游離的β-catenin可進入細胞核并和細胞核內(nèi)轉錄因子結合，激活下游靶基因cyclinD1、c-Myc和MMP-7等［21］。cyclinD1是細胞周期蛋白家族成員，其過表達可導致細胞從G1期快速進入S期，導致細胞生長失控，進行惡性增殖，引起腫瘤的生成，因此，在癌細胞中cyclinD1的表達常表現(xiàn)為異常增多［22］。研究表明，乳腺癌的高侵襲轉移性和cyclinD1的陽性表達有關［23］。c-Myc是癌基因家族成員，在細胞生長、增殖、分化、凋亡等過程中具有重要作用，由于其在多種腫瘤組織中均可檢測出異常高表達量，因此，常作為部分腫瘤診斷的標志物［24］。研究表明，下調(diào)乳腺癌細胞中c-Myc基因表達水平可抑制細胞生長和侵襲轉移能力［25］。MMP-7是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，具有降解細胞外基質(zhì)、促進血管生成、調(diào)節(jié)細胞間黏附程度等功能。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-7在腫瘤組織中呈現(xiàn)出較高表達量，并且與腫瘤的浸潤轉移有密切關系［26］。本研究結果顯示，雞血藤總黃酮處理的MCF-7細胞中Wnt1、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和MMP-7的mRNA和蛋白表達水平降低，β-catenin磷酸化水平提高，表明MCF-7細胞中Wnt/β-catenin信號通路異常激活被抑制，且抑制效果具有劑量依賴性。綜上所述，雞血藤總黃酮可抑制人乳腺癌細胞株MCF-7增殖、侵襲和遷移，促進其凋亡，推測其作用機制與抑制Wnt/β-catenin信號通路激活有關。本研究僅從體外實驗方面進行探討，雞血藤總黃酮能否作為乳腺癌治療藥物應用于臨床還需要進一步深入研究。