井晶，劉夢(mèng)，郭靜，田二斌

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003

卵巢癌是一種高度異質(zhì)類腫瘤，其發(fā)病率位于女性惡性腫瘤第2位，而致死率在女性惡性腫瘤中位居首位［1］。卵巢癌早期無明顯痛感和典型癥狀，不易察覺，因此確診時(shí)往往已為中晚期，癌細(xì)胞已轉(zhuǎn)移到腹腔，嚴(yán)重威脅女性健康［2］。化療技術(shù)是中晚期腫瘤治療的主要手段，以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療方法在卵巢癌的治療中普遍使用［3］。雖然該方法可提高患者5年生存率，但是由于卵巢癌復(fù)發(fā)率高、易耐藥，使得治療效果不明顯［4］。據(jù)報(bào)道，90%的卵巢癌晚期患者因多藥耐藥死亡［5］。研究表明，初次化療患者中至少存在20%的患者對(duì)鉑類化療藥物具有耐藥性，而在卵巢癌復(fù)發(fā)患者中，對(duì)該藥的耐藥率高達(dá)70%以上［6］。因此，如何降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。龍膽苦苷提取自龍膽科植物龍膽，具有抗炎鎮(zhèn)痛、保肝利膽、健胃等功效［7］。研究表明，龍膽苦苷還有抗腫瘤的作用，可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移［8］。但是該藥物對(duì)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞順鉑化療敏感性的影響尚未涉及，因此，本研究使用龍膽苦苷處理人卵巢癌細(xì)胞株A2780/DDP，研究其對(duì)順鉑化療敏感性的影響，并探討其機(jī)制，為龍膽苦苷在臨床卵巢癌治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞人卵巢癌細(xì)胞株A2780/DDP（上海美軒生物科技有限公司，貨號(hào)C1015112），-80℃恒溫保存，避免反復(fù)凍融。

1.2 藥物與試劑順鉑注射液（江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：181204）；龍膽苦苷（成都德思特生物技術(shù)有限公司，純度≥98%，批號(hào)：1808006）。RAMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號(hào)：20181046）；MTT法細(xì)胞增殖分析試劑盒（美國Trevigen公司，批號(hào)：1811102）；吉姆薩染色試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司，批號(hào)：20181016003）；二甲基亞砜（蘇州聯(lián)雄化工科技有限公司，批號(hào)：20190516）；4%多聚甲醛（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號(hào)：201904112）；RNA提取試劑盒（美國賽默飛公司，批號(hào)：1904125）；蛋白提取試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司，批號(hào)：P1903147）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)：190415）；RT-qPCR染色試劑盒（常州百代生物科技有限公司，批號(hào)：1902183）；Bcl-2、p53、XIAP、Survivin、p-p53、β-actin一抗和二抗（美國Aviva Systems Biology公司，批號(hào)：1904126、1904166、1901118、1904187、1902137、1906132、1905157、1907157、1906128、1908142、1905119、1907135）；TUNEL凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶公司，批號(hào)：20181203）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（美國Sigma公司，批號(hào)：20190812004）；引物合成委托上海賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.3 儀器MCO-18AC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；ELX808酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；Q1000 RT-qPCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；DY-1000C蛋白電泳設(shè)備（南京貝帝試驗(yàn)儀器有限公司）；CX31型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；CKX53倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；BD-YG500熒光顯微鏡（廣州博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和干預(yù)人卵巢癌細(xì)胞株A2780/DDP使用RAMI 1640培養(yǎng)基置于5%CO237℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期，每孔1×105個(gè)細(xì)胞加入96孔板中，分為對(duì)照組、順鉑組、龍膽苦苷組、順鉑+龍膽苦苷組，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。順鉑組加入5 mg·L-1順鉑，龍膽苦苷組加入15μmol·L-1龍膽苦苷，順鉑+龍膽苦苷組加入15μmol·L-1龍膽苦苷和5 mg·L-1順鉑，對(duì)照組給予等體積生理鹽水，培養(yǎng)48 h。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察藥物干預(yù)24 h后，將細(xì)胞置于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測分別于藥物干預(yù)24 h和48 h后使用MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率。每孔加入20μL MTT溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μL二甲基亞砜，避光震蕩10 min，使用酶標(biāo)儀讀取490 nm處光吸收值。

細(xì)胞增殖抑制率＝（1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組）×100%。

2.4 細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測藥物干預(yù)48 h后，按照TUNEL試劑盒說明書檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)。棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞2 h，移去固定液，PBS洗3遍，按照TUNEL試劑盒說明書操作加入試劑，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野中凋亡陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。

細(xì)胞凋亡指數(shù)＝（細(xì)胞凋亡數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%

2.5Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測采用RT-qPCR檢測Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相對(duì)表達(dá)量。藥物干預(yù)48 h后，收集細(xì)胞至離心管中，加入Trizol試劑，按照RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。從NCBI基因庫中查找目的基因mRNA序列并設(shè)計(jì)出目的基因上下游引物，引物序列見表1。反應(yīng)條件為：94℃5 min，94℃1 min，56℃30 s，72℃40 s，最后55℃停止。通過配套熒光信號(hào)采集系統(tǒng)分析樣品CT值并以β-actin為內(nèi)參計(jì)算各樣品mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2.6 Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表達(dá)水平及p53磷酸化水平檢測采用Western blot檢測Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表達(dá)水平及p53的磷酸化水平。藥物干預(yù)48 h后，收集細(xì)胞于離心管中，通過蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取40μL樣品上樣，蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜后加封閉液孵育，加一抗（1∶1 000）孵育，加二抗（1∶2 000）孵育，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光、顯色，掃描成像，以β-actin圖像灰度值為對(duì)照，計(jì)算各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用單因素方差分析對(duì)多組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，使用SNK-q檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，使用t檢驗(yàn)對(duì)組內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 龍膽苦苷對(duì)A2780/DDP細(xì)胞形態(tài)的影響對(duì)照組A2780/DDP細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞排列呈現(xiàn)鋪路石狀，細(xì)胞連接緊密且輪廓清晰，偶見死亡懸浮細(xì)胞；順鉑組可見少量死亡懸浮細(xì)胞，細(xì)胞間隙變大，偶見細(xì)胞核碎裂；龍膽苦苷組可見部分死亡懸浮細(xì)胞，細(xì)胞核碎裂較多；順鉑+龍膽苦苷組可見較多細(xì)胞處于死亡懸浮狀態(tài)，細(xì)胞核碎裂嚴(yán)重。見圖1。

圖1 A2780/DDP細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（×200）

3.2 龍膽苦苷對(duì)A2780/DDP細(xì)胞增殖抑制率的影響與對(duì)照組比較，藥物干預(yù)24h后，各給藥組A2780/DDP細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）；藥物干預(yù)48后，各給藥組A2780/DDP細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，且高于24 h時(shí)同組的細(xì)胞增殖抑制率（P＜0.05）。藥物干預(yù)24 h和48 h后，各組增殖抑制率兩兩比較均表現(xiàn)出：順鉑+龍膽苦苷組＞龍膽苦苷組＞順鉑組＞對(duì)照組，且各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 A2780/DDP細(xì)胞增殖抑制率比較 （±s，%）

表2 A2780/DDP細(xì)胞增殖抑制率比較 （±s，%）

注：與同組24 h比較，*P＜0.05；與同期對(duì)照組比較，a P＜0.05；與同期順鉑+龍膽苦苷組比較，b P＜0.05；與同期龍膽苦苷組比較，c P＜0.05

24 h 48 h對(duì)照組組別 n 6 0 0順鉑組 6 19.74±1.28abc 22.15±3.34*abc龍膽苦苷組 6 28.81±2.37ab 31.37±2.66*ab順鉑+龍膽苦苷組 6 34.12±3.84a 45.14±4.90*a

3.3 龍膽苦苷對(duì)A2780/DDP細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響采用TUNEL法考察藥物干預(yù)48 h后，龍膽苦苷對(duì)A2780/DDP細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響。與對(duì)照組比較，藥物干預(yù)48 h后，A2780/DDP細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高（P＜0.05），且順鉑+龍膽苦苷組＞龍膽苦苷組＞順鉑組＞對(duì)照組，各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)果見圖2，表3。

圖2 TUNEL檢測A2780/DDP細(xì)胞凋亡（×100）

表3 A2780/DDP細(xì)胞凋亡指數(shù)（±s，%）

表3 A2780/DDP細(xì)胞凋亡指數(shù)（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與順鉑+龍膽苦苷組比較，b P＜0.05；與龍膽苦苷組比較，c P＜0.05

組別 n 細(xì)胞凋亡指數(shù)對(duì)照組5.06±0.52順鉑組 6 19.33±2.38abc龍膽苦苷組 6 36.40±5.31ab順鉑+龍膽苦苷組 6 65.27±10.55 6 a

3.4 龍膽苦苷對(duì)A2780/DDP細(xì)胞Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，p53 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），且順鉑+龍膽苦苷組＞龍膽苦苷組＞順鉑組＞對(duì)照組，各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）；Bcl-2、XIAP和Survivin的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），且對(duì)照組＞順鉑組＞龍膽苦苷組＞順鉑+龍膽苦苷組，各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 A2780/DDP細(xì)胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相對(duì)表達(dá)量 （±s）

表4 A2780/DDP細(xì)胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相對(duì)表達(dá)量 （±s）

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與順鉑+龍膽苦苷組比較，b P＜0.05；與龍膽苦苷組比較，c P＜0.05

mRNA對(duì)照組組別 n Bcl-2 mRNA p53 mRNA XIAP mRNA Survivin 6 1.13±0.12 0.74±0.10 0.85±0.14 1.01±0.11順鉑組 6 0.81±0.09abc 1.05±0.12abc 0.64±0.08abc 0.87±0.09abc龍膽苦苷組 6 0.67±0.08ab 1.43±0.11ab 0.49±0.08ab 0.62±0.10ab順鉑+龍膽苦苷組 6 0.55±0.07a 1.79±0.15a 0.33±0.07a 0.45±0.07 a

3.5 龍膽苦苷對(duì)A2780/DDP細(xì)胞Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表達(dá)水平及p53磷酸化水平的影響與對(duì)照組比較，p53蛋白表達(dá)量和磷酸化水平顯著升高（P＜0.05），且順鉑+龍膽苦苷組＞龍膽苦苷組＞順鉑組＞對(duì)照組，各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）；Bcl-2、XIAP和Survivin蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），且對(duì)照組＞順鉑組＞龍膽苦苷組＞順鉑+龍膽苦苷組，各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）。見圖3，圖4。

圖3 A2780/DDP細(xì)胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表達(dá)水平及p53磷酸化水平

圖4 A2780/DDP細(xì)胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白相對(duì)表達(dá)水平及p53磷酸化水平

4 討論

隨著我國老齡化日益嚴(yán)重，卵巢癌的發(fā)病率也逐漸提高［9］。卵巢位于盆腔內(nèi)，位置隱蔽，發(fā)病早期無明顯癥狀，又尚無早期特異性診斷標(biāo)志物，因此早期難以診斷［10］。未生育、高脂飲食等都是誘發(fā)該病的危險(xiǎn)因素［11］。目前，化療是中晚期卵巢癌患者治療的重要手段，以順鉑為主的第一代化療藥物具有廣譜抗癌、殺傷力強(qiáng)的特點(diǎn)，廣泛運(yùn)用于惡性腫瘤的臨床治療［12］。順鉑進(jìn)入細(xì)胞，通過與細(xì)胞核中DNA結(jié)合從而抑制其轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。但是，長期使用順鉑會(huì)使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，藥效大打折扣。卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥機(jī)制具有多種途徑，阻礙順鉑與DNA結(jié)合、干擾細(xì)胞凋亡等都是其產(chǎn)生耐藥性的可能機(jī)制［14］。因此，尋找加強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的方法，是解決腫瘤細(xì)胞耐藥問題的關(guān)鍵所在。

龍膽為我國傳統(tǒng)中草藥，具有瀉肝膽火、除下焦?jié)駸岬墓π?，龍膽苦苷為其主要成分，除保肝利膽，還有抗菌、消炎、止痛、抗腫瘤等功效［15］。研究表明，龍膽苦苷可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞凋亡［16-17］。本研究使用龍膽苦苷和順鉑作用于對(duì)順鉑耐藥的A2780/DDP細(xì)胞，24 h后細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的形態(tài)學(xué)改變，其中龍膽苦苷和順鉑聯(lián)合用藥組A2780/DDP細(xì)胞形態(tài)改變最嚴(yán)重。細(xì)胞增殖抑制率實(shí)驗(yàn)證明，龍膽苦苷可抑制A2780/DDP細(xì)胞增殖，并且順鉑+龍膽苦苷組A2780/DDP細(xì)胞增殖抑制效果最佳。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證實(shí)，龍膽苦苷可顯著促進(jìn)A2780/DDP細(xì)胞凋亡，其中順鉑+龍膽苦苷組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于其余各組，表明龍膽苦苷可抑制A2780/DDP細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)耐藥細(xì)胞株A2780/DDP的順鉑敏感性。

順鉑可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)制尚未完全明確。目前，已知p53、Bcl-2蛋白在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用［18］。p53為腫瘤抑制蛋白，研究表明，p53基因的激活可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，也是順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵所在，p53磷酸化水平與其穩(wěn)定、激活有直接關(guān)系［19］。順鉑可激活p53，誘導(dǎo)p53磷酸化，從而發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，而p53基因突變可使卵巢癌細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性下降，誘導(dǎo)順鉑耐藥［20］，因此，激活p53是提高順鉑化療敏感性的重要環(huán)節(jié)。Bcl-2家族蛋白位于線粒體中，對(duì)細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用，其中Bcl-2具有抑制凋亡作用，Bcl-2的過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞存活延長，凋亡抑制［21］。研究表明，順鉑耐藥腫瘤細(xì)胞中可觀察到Bcl-2的過表達(dá)，而降低Bcl-2表達(dá)水平可提高順鉑化療敏感性［22］。XIAP和Survivin屬于凋亡抑制蛋白，對(duì)細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡均有調(diào)節(jié)作用。凋亡抑制蛋白可以通過阻礙細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性［23］。XIAP的過表達(dá)可導(dǎo)致存活因子如caspase-3、caspase-7、caspase-9等蛋白磷酸化并失活，從而阻斷順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，順鉑可以抑制敏感細(xì)胞株中XIAP蛋白的表達(dá)并誘導(dǎo)caspase-3和caspase-9活化，引起細(xì)胞凋亡，而耐藥細(xì)胞株中XIAP蛋白高表達(dá)則細(xì)胞對(duì)順鉑化療敏感性降低［24］，因此，抑制XIAP基因和蛋白表達(dá)可增加癌細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性。Survivin在惡性腫瘤中存在過表達(dá)，而正常細(xì)胞中表達(dá)量極低。研究表明，向人卵巢癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Survivin基因，誘導(dǎo)Survivin表達(dá)量升高，可導(dǎo)致其順鉑耐藥性顯著增加，化療敏感性顯著降低［25］。本 研 究 對(duì)A2780/DDP細(xì) 胞 株 中p53、Bcl-2、XIAP、Survivin的表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，p53 mRNA和蛋白及其磷酸化水平表達(dá)增加而Bcl-2、XIAP、Survivin的mRNA和蛋白表達(dá)量均降低，表明龍膽苦苷可通過上調(diào)p53表達(dá)水平和磷酸化水平，下調(diào)Bcl-2、XIAP和Survivin表達(dá)水平，增強(qiáng)A2780/DDP細(xì)胞株順鉑敏感性，促進(jìn)A2780/DDP細(xì)胞凋亡。

綜上所述，龍膽苦苷可抑制細(xì)胞株A2780/DDP增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞變形、凋亡，且可增強(qiáng)耐順鉑A2780/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，推測其機(jī)制是通過上調(diào)p53表達(dá)水平及磷酸化水平，下調(diào)Bcl-2、XIAP和Survivin表達(dá)水平。本研究結(jié)果對(duì)克服卵巢癌順鉑耐藥性具有臨床意義，但是龍膽苦苷對(duì)正常細(xì)胞是否具有細(xì)胞毒性尚未討論，其臨床應(yīng)用可行性也尚未涉及，因此有待后續(xù)深入研究。