侯晶晶，殷梓辛，房傳賜，李雅娟，陳溪雯，孫卉，覃薇，錢亞云

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009

南蛇藤屬于衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物，具有解毒消腫、活血行氣等功效。已有研究表明，南蛇藤提取物（celastrus orbiculatus ethylacetate extract，COE）具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用［1-2］。課題組發(fā)現(xiàn)，COE可抑制胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial stromal transformation，EMT）［3］。胃癌的發(fā)生及早期轉(zhuǎn)移與EMT的程度呈正相關(guān)［4-5］，癌細(xì)胞通過EMT可獲得更具侵襲性的特點(diǎn)。為進(jìn)一步研究COE對(duì)MGC803/miR-144+細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究觀察COE對(duì)MGC803/miR-144+細(xì)胞增殖與遷移能力的影響，進(jìn)一步研究其與EMT之間的作用關(guān)系。

1 材料

1.1 細(xì)胞人胃癌MGC803細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，貨號(hào)C6582）；MGC803/miR-144+細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 藥物與試劑南蛇藤（廣州致信藥業(yè)有限公司，批號(hào)：070510）；5-氟尿嘧啶注射液（5-fluorouracil，5-Fu，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：1302201）。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司，貨號(hào)：SH308009）；胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)分別為：232700、M2128）；MTT粉（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：0222701）；細(xì)胞裂解液（上海Beyotime公司，貨號(hào)：P0013）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物公司，貨號(hào)：P0010S）；Tris-HCL溶液（pH6.8、pH8.8）（南京凱基生物公司，貨號(hào)分別為：KGB005、KGB009）；氯化鈉（上海Beyotime公司，貨號(hào)：ST347）；氯化鉀（上海Beyotime公司，貨號(hào)：ST345）；兔抗人E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體（美國(guó)CST公司，貨號(hào)分別為：14472S、13116S、5741T、3700S、14708S）。

1.3 儀器蛋白電泳槽、全自動(dòng)酶標(biāo)板分析儀、SDS-PAGE凝膠成像分析儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 藥物制備COE的制備過程如下［3-4］：將南蛇藤莖切成小段，并粉碎成粉，用95%乙醇提取3次，回收溶劑至干，加水分散后，再依次用石油醚和乙酸乙酯萃取3次，回收乙酸乙酯層，減壓濃縮并進(jìn)行真空凍干，最后得到的即是COE。其提取物在使用前用二甲基亞砜（DMSO）溶解，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基將其稀釋成所需要的濃度，并用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。COE的提取制備方法已獲得國(guó)家發(fā)明專利（專利號(hào)：ZL200710025343.3）。取適量的5-Fu，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基將其稀釋成終濃度50 mg·L-1，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803/miR-144+細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，將5×103個(gè)細(xì)胞數(shù)種于96孔板中，過夜貼壁。將不同濃度的COE（0 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1、160 mg·L-1、320 mg·L-1）加入到上述細(xì)胞中。加藥24 h后，每孔加20μL MTT，作用4 h后，加150μL DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，計(jì)算MGC803/miR-144+細(xì)胞的增殖率。根據(jù)半數(shù)抑制濃度，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

細(xì)胞增殖抑制率＝（1-COE組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803/miR-144+細(xì)胞，每孔5×105個(gè)，種于6孔板中，分別設(shè)立空白質(zhì)粒對(duì)照組、不加藥陰性組、COE組（100 mg·L-1）和陽(yáng)性對(duì)照組（5-Fu，50 mg·L-1）。待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，用10μL的無(wú)菌白色槍頭在6孔板的底部劃直線，用PBS洗2遍。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕寬度的變化并拍照。將不加藥陰性組、COE組（100 mg·L-1）和陽(yáng)性對(duì)照組（5-Fu，50 mg·L-1）加藥作用24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕的寬度，并拍照。

細(xì)胞遷移抑制率（%）＝（1-COE組細(xì)胞劃痕寬度差值/對(duì)照組細(xì)胞劃痕寬度差值）×100%

2.4 Western blot法檢測(cè)COE對(duì)MGC803/miR-144+細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803/miR-144+細(xì)胞，分別設(shè)置為空白質(zhì)粒對(duì)照組、不加藥陰性組、COE組（100 mg·L-1）和陽(yáng)性對(duì)照組（5-Fu，50 mg·L-1），將其消化并計(jì)數(shù)，取5×105個(gè)細(xì)胞種于6孔板中，藥物作用24 h后，細(xì)胞裂解，收集并提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)其濃度并定量。配膠后，加適量的蛋白樣品，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光、分析數(shù)據(jù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 COE對(duì)MGC803/miR-144+細(xì)胞增殖能力的影響藥物作用24 h后，與空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，COE能明顯抑制MGC803/miR-144+細(xì)胞的增殖，并呈一定的濃度依賴性。根據(jù)增殖率計(jì)算COE作用于MGC803/miR-144+細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為126.86 mg·L-1。為了獲得藥物作用于細(xì)胞的最佳濃度，并且排除藥物對(duì)細(xì)胞的毒性，后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)選用COE濃度為100 mg·L-1。見圖1。

圖1 COE對(duì)MGC803/miR-144+細(xì)胞增殖能力的影響

3.2 COE對(duì)MGC803/miR-144+細(xì)胞遷移能力的影響與空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，經(jīng)COE和5-Fu處理后的人胃癌MGC803/miR-144+細(xì)胞遷移的速率顯著變緩，傷痕愈合較慢，抑制作用更明顯。提示COE可抑制MGC803/miR-144+細(xì)胞的遷移能力。見圖2。

圖2 COE對(duì)MGC803/miR-144+細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

3.3 COE對(duì)MGC803/miR-144+細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響與空白質(zhì)粒組比較，COE組N-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)明顯降低，E-cadherin的蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。提示COE可抑制MGC803/miR-144+細(xì)胞株上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。見圖3。

圖3 EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平

4 討論

胃癌屬于胃黏膜上皮細(xì)胞癌，嚴(yán)重影響人類的健康。最新研究表明，胃癌是癌癥中的第三大死因，其發(fā)生與幽門螺桿菌［6-7］、E病毒感染［8］、家族遺傳［9］等密切相關(guān)。胃癌早期癥狀并不明顯，臨床上主要以手術(shù)治療和術(shù)后放化療為主，預(yù)后較差。早期患者的治愈率較高，中晚期胃癌患者的治愈率僅達(dá)30%［10］。因此，針對(duì)胃癌的早期診斷研究顯得尤為重要。

隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，有越來(lái)越多的miRNA及其靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，為胃癌的基因診斷和治療提供了更多的指導(dǎo)和依據(jù)［11-14］?，F(xiàn)有大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，miR-144在腫瘤中起抑癌作用［15-17］，可抑制腫瘤的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移等功能。miR-144為胃癌的治療與診斷提供新思路。

研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方及其活性成分，如滋陰化痰方［18］、健脾消癌方［19］、半枝蓮［20］、紫草素［21］等對(duì)腫瘤有一定的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)COE作用于MGC803/miR-144+細(xì)胞24 h后，可明顯抑制其增殖能力和遷移能力，且呈一定的濃度依賴性，且其半數(shù)抑制濃度為126.86 mg·L-1。

EMT是上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生理或病理過程，其中細(xì)胞發(fā)生表型改變，包括細(xì)胞極性喪失和細(xì)胞間黏附，細(xì)胞遷移和侵襲性等特性的獲得，這些都是腫瘤進(jìn)展的重要原因［22-24］。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的轉(zhuǎn)移與EMT相關(guān)［25］。本實(shí)驗(yàn)通過COE作用于MGC803/miR-144+細(xì)胞株，檢測(cè)COE對(duì)MGC803/miR-144+細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果顯示，COE組中N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)明顯降低，E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高。表明COE可抑制MGC803/miR-144+細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。