王平，趙澄，吳濤，張香港，盧芳國(guó)，吳碧清，吳賢倩，陳麗玄，鮑杰

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）已被證實(shí)是慢性胃炎和消化性潰瘍的病因之一，且與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)［1］。成功定植于胃黏膜是H.pylori感染的首要條件，而黏附又是定植的關(guān)鍵［2］。鞭毛動(dòng)力、尿素酶活性和黏附素是H.pylori在胃內(nèi)得以生存和定植的重要原因，與H.pylori致病性密切相關(guān)，成為根治H.pylori感染的重要靶點(diǎn)［3-4］。中醫(yī)藥治療在改善癥狀、提高幽門螺桿菌根除率、降低幽門螺桿菌復(fù)發(fā)率等方面有較大優(yōu)勢(shì)［5］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，中藥黃芪（Astragali Radix）對(duì)H.Pylori相關(guān)性胃炎和消化性潰瘍的治療效果顯著，但具體機(jī)制不清［6］。黃芪甲苷（Astragaloside IV，ASIV）是一種四環(huán)三萜類皂苷，為黃芪的主要活性成分，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察ASIV對(duì)H.pylori尿素酶活性、鞭毛運(yùn)動(dòng)功能及定植相關(guān)基因表達(dá)的影響，初步探討ASIV抗H.Pylori定植的可能機(jī)制，為黃芪及其活性成分的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論和實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料

1.1 菌株H.Pylori ATCC26695菌株由貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室惠贈(zèng)，由課題組保管于貴州中醫(yī)藥大學(xué)形態(tài)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥物及試劑ASIV（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MB1955，純度＞98%）；H.Pylori固體培養(yǎng)基、布氏肉湯干粉、腦心浸液肉湯干粉、H.Pylori添加劑（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：HB8646、HB0241、HB8297-1、HB8646a）；DMSO（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：D8370）；無(wú)菌脫纖維羊血（常德比克曼生物科技有限公司）；過(guò)氧化氫酶試劑、氧化酶試紙片（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：HB8650、HB2100）；尿素酶試紙（珠海市克迪科學(xué)技術(shù)開發(fā)公司，批號(hào)：121102）；無(wú)菌PBS緩沖液（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)：SH30256.01）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：PC0020）；細(xì)菌總蛋白提取試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，批號(hào)：BB3123-2）；細(xì)菌尿素酶比色法定量檢測(cè)試劑盒（美國(guó)GENMED公司，批號(hào)：GMS15022.2）；細(xì)菌總RNA提取試劑盒（離心柱型）（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：DP430）；cDNA合成試劑盒、NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司，批號(hào)：E047、E096）；目的基因PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；內(nèi)參基因（16S rRNA基因）引物參照文獻(xiàn)［7］由長(zhǎng)沙維爾生物有限公司合成。

1.3 儀器BSC-1300ⅡA2生物安全柜、SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；TP-200D電子分析天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；TGL 20M高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-tek公司）；LightCycler熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）；NanoDrop 2000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Scientz-650E超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；麥?zhǔn)媳葷醿x（法國(guó)Biomerieux SA公司）。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備嚴(yán)格參照說(shuō)明書要求進(jìn)行。固體培養(yǎng)基：取H.Pylori固體培養(yǎng)基5.2 g，加入93 mL純水，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至56℃左右，加入無(wú)菌脫纖維羊血7 mL及H.pylori添加劑1支，混勻，傾倒于90 mm無(wú)菌平皿中，培養(yǎng)基厚度約為3～4 mm，4℃?zhèn)溆谩：幣囵B(yǎng)基：根據(jù)計(jì)算出的最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）的1/2、1/4、1/8分別加入ASIV，與上述成分充分混勻后分裝至直徑90 mm的無(wú)菌平皿中，4℃?zhèn)溆?。半固體培養(yǎng)基：取布氏肉湯干粉2.81 g，加入100 mL純水，0.3 g瓊脂，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至56℃左右，加入無(wú)菌脫纖維羊血7 mL及H.pylori添加劑1支，含藥培養(yǎng)基按上述濃度加入ASIV充分混勻后，分裝至直徑為90 mm的無(wú)菌平皿中，培養(yǎng)基厚度約為3～4 mm。液體培養(yǎng)基：腦心浸液肉湯干粉3.85 g，加無(wú)菌純水90 mL，高壓滅菌，冷卻后加10 mL胎牛血清，分裝，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 幽門螺桿菌鑒定在微需氧環(huán)境中（培養(yǎng)罐中放置微需氧袋）培養(yǎng)H.pylori 48～72 h，連續(xù)培養(yǎng)3代，通過(guò)觀察其菌落形態(tài)、生化試驗(yàn)（觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、快速尿素酶試驗(yàn)）及革蘭染色對(duì)H.pylori進(jìn)行鑒定［8］。觸酶試驗(yàn)：根據(jù)說(shuō)明書操作，接種環(huán)挑取細(xì)菌菌落涂布于潔凈玻片上，在菌落上滴加3%過(guò)氧化氫1滴，觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生，如有氣泡產(chǎn)生，判斷為陽(yáng)性。氧化酶和快速尿素酶試驗(yàn)：接種環(huán)滅菌后刮取平板中疑似菌落放于氧化酶試紙片或快速尿素酶試紙條上，30 s至2 min內(nèi)觀察結(jié)果。氧化酶試紙?jiān)?0 s內(nèi)變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)紫色為強(qiáng)陽(yáng)性，2 min不變色為陰性；快速尿素酶試紙?jiān)?～2 min內(nèi)變紅，則尿素酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，如果試紙條顏色不變，則尿素酶試驗(yàn)為陰性。

2.3 瓊脂稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度采用瓊脂稀釋法測(cè)定ASIV的MIC，具體如下：刮取培養(yǎng)48～72 h H.pylori接種于液體培養(yǎng)基中，用無(wú)菌生理鹽水將其稀釋至1.5×108CFU·mL-1。滴加200μL菌液于培養(yǎng)基表面，用涂布棒均勻接種于不同終濃度ASIV（10 g·L-1、5 g·L-1、2.5 g·L-1、1.25 g·L-1）的含藥平板上，37℃微需氧培養(yǎng)72h后觀察，以未出現(xiàn)H.pylori生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。

2.4 尿素酶蛋白活性檢測(cè)將1.5×108CFU·mL-1H.pylori菌液200μL分別涂布于空白平皿及含1/2、1/4、1/8 MIC 3個(gè)不同濃度ASIV的平皿中，微需氧傳代培養(yǎng)3代，用無(wú)菌PBS將平板菌株洗脫并收集到無(wú)菌離心管中，4℃、5 000 r·min-1離心5 min，去上清，收集菌體，用細(xì)菌細(xì)胞漂洗液將細(xì)胞懸浮起后，4℃、12 000 r·min-1離心2 min，去除漂洗液，重復(fù)2次，加入細(xì)菌細(xì)胞蛋白裂解液、磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，混懸細(xì)菌細(xì)胞樣品，37℃搖床溫育20 min，置冰上放入超聲破碎儀，300 w、10 s超聲/10 s間隔超聲20 min，至菌液變清后，4℃、10 000 r·min-1離心15 min，上清即含蛋白質(zhì)粗提物。取上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。根據(jù)GENMED細(xì)菌尿素酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行樣品尿素酶活性檢測(cè)。

尿素酶活性抑制率＝（對(duì)照組尿素酶活性-實(shí)驗(yàn)組尿素酶活性）/對(duì)照組尿素酶活性×100%

2.5 細(xì)菌鞭毛動(dòng)力定量檢測(cè)參照文獻(xiàn)［7］方法，收集培養(yǎng)48 h且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H.pylori懸于腦心浸液，比濁儀調(diào)整菌液濃度至3×108CFU·mL-1，4℃?zhèn)溆?。用接種針取菌液穿刺接種于含不同濃度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC）ASIV的布氏肉湯半固體培養(yǎng)基平皿中，相同濃度各接種3個(gè)，以不含藥培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測(cè)量各組H.pylori菌膜暈圈直徑。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)幽門螺桿菌黏附定植相關(guān)基因的表達(dá)水平H.pylori在3個(gè)濃度含藥平板上培養(yǎng)48 h后，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組（ASIV大劑量組、ASIV中劑量組、ASIV小劑量組），同批未經(jīng)ASIV處理的H.pylori設(shè)為對(duì)照組。用腦心浸液將H.pylori制成1～9×108CFU·mL-1細(xì)菌懸液，采用離心柱法提取各組樣品的總RNA。利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品在波長(zhǎng)260 nm與280 nm處的吸光度值A(chǔ)260與A280。選擇A260/A280值在1.8～2.0之間的樣品，用RNase Freed H2O將樣品濃度調(diào)整至500～600 mg·L-1，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA做模板，按NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒說(shuō)明，分別加入16S rRNA、ureA、ureB、flaA、flaB、babA、sabA、alpA、alpB引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 2μL，UltraSYBR Mixture（Low ROX）25μL，10μM上下游引物各1μL，以dd H2O補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃10 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。方差齊時(shí)，用LSD進(jìn)行多重比較，方差不齊時(shí)用Games-Howell進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1H.pylori在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)現(xiàn)象觀察及革蘭氏染色結(jié)果在固體培養(yǎng)基上H.pylori菌落為直徑1～2 mm的透明針尖樣菌落，均勻散在分布。經(jīng)涂片、固定、革蘭染色后油鏡下觀察，呈紅色彎曲狀或短桿狀。觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)和快速尿素酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)現(xiàn)象

圖2 幽門螺桿菌鏡下形態(tài)（×1 000）

3.2 最小抑菌濃度測(cè)定瓊脂稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度發(fā)現(xiàn)，在10 g·L-1、5 g·L-1ASIV含藥平板中未培養(yǎng)出H.pylori，即5 g·L-1為MIC值。根據(jù)結(jié)果制備1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 3個(gè)藥物濃度的含藥平板，即2.5 g·L-1、1.25 g·L-1、0.625 g·L-1，分別為ASIV的小、中、大劑量。

3.3 ASIV對(duì)H.pylori尿素酶活性的影響與對(duì)照組比較，ASIV大劑量組和中劑量組尿素酶活性顯著降低（P＜0.05）。提示ASIV對(duì)H.pylori尿素酶活性具有抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表2，圖3。

表2 ASIV對(duì)H.pylori尿素酶活性的影響 （±s）

表2 ASIV對(duì)H.pylori尿素酶活性的影響 （±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；**P＜0.01

組別 尿素酶活性/mU·min-1 抑制率/%對(duì)照組322.14±26.42 -ASIV小劑量組 301.30±26.22 6.47±2.89 ASIV中劑量組 262.77±36.17* 18.01±11.82 ASIV大劑量組 234.99±32.56**27.05±10.10

圖3 ASIV對(duì)幽門螺桿菌尿素酶活性的影響

3.4 ASIV對(duì)H.pylori鞭毛動(dòng)力的影響與對(duì)照組比較，ASIV大、中、小劑量組H.pylori菌膜暈圈直徑減小，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示ASIV對(duì)幽門螺桿菌鞭毛動(dòng)力無(wú)明顯影響。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 ASIV對(duì)H.pylori菌膜暈圈直徑的影響 （±s）

表3 ASIV對(duì)H.pylori菌膜暈圈直徑的影響 （±s）

組別 菌膜暈圈直徑（l/mm）17.80±2.58 ASIV小劑量組 17.20±1.87 ASIV中劑量組 15.80±1.48 ASIV大劑量組對(duì)照組15.00±3.53

3.5 ASIV對(duì)H.pylori定植相關(guān)基因表達(dá)水平的影響以16S rRNA基因作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT對(duì)ASIV作用后H.pylori定植相關(guān)基因表達(dá)差異進(jìn)行分析。與對(duì)照組比較，ASIV大劑量組尿素酶基因ureA和ureB的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而其他定植相關(guān)基因表達(dá)未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）。提示ASIV可通過(guò)抑制尿素酶基因表達(dá)影響幽門螺桿菌的定植。見(jiàn)圖4。

圖4 黃芪甲苷對(duì)幽門螺桿菌定植相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

4 討論

H.pylori是一種螺旋狀革蘭氏陰性微需氧菌，主要定植于胃黏膜上皮細(xì)胞表面，全球有超過(guò)50%的人群感染，大多數(shù)感染者沒(méi)有癥狀，但少數(shù)感染者可發(fā)展為慢性胃炎和消化性潰瘍，極少數(shù)感染者可發(fā)生胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤［9］。尿素酶活性、鞭毛動(dòng)力及黏附素的表達(dá)是幽門螺桿菌在胃內(nèi)得以生存，并實(shí)現(xiàn)黏附定植的前提，與H.pylori致病性密切相關(guān)［10］。H.pylori尿素酶可以水解尿素生成氨和二氧化碳，氨溶于水生成氫氧化銨，調(diào)節(jié)胃內(nèi)pH值，緩解酸性環(huán)境，使H.pylori可以安全通過(guò)胃液。H.pylori尿素酶由尿素酶基因簇ureA/B、ureI、ureE-H等基因編碼，其中ureA/B具有高度保守性，是PCR檢測(cè)常選擇的目的基因［11］。同時(shí)，尿素酶還可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集，促進(jìn)IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生［12］。因此，尿素酶在細(xì)菌定植及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。鞭毛運(yùn)動(dòng)是H.pylori定植的關(guān)鍵因素，由鞭毛和菌體組成的特殊螺旋結(jié)構(gòu)，為H.pylori提供了省力的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)并為其穿梭胃黏液層定植于胃黏膜提供了便利條件。在鞭毛的作用下，H.pylori可通過(guò)胃黏膜上皮層向pH值接近7.0的基底層移動(dòng)［13］。H.pylori一端有4～7條鞭毛，主要由基體、鞭毛鉤及鞭毛絲組成。鞭毛絲又由FlaA和FlaB兩種鞭毛蛋白組成，分別由flaA和flaB兩種基因編碼產(chǎn)生。若同時(shí)缺乏FlaA和FlaB，鞭毛和動(dòng)力均消失，H.pylori失去致病性［14］。胃內(nèi)定植是H.pylori致病的前提，而黏附是定植的關(guān)鍵［15］，H.pylori的黏附作用主要是通過(guò)特異性黏附素介導(dǎo)［16］。目前已發(fā)現(xiàn)20多種黏附素，包括血型抗原結(jié)合黏附素（blood-group antigen-binding adhesion，BabA）、唾液酸結(jié)合黏附素（sialic acid-binding adhesion，SabA）、黏附相關(guān)脂蛋白A和B（The adherence-associated lipoprotein A and B，AlpA/B）等，分別由黏附素基因babA、sabA、alpA、alpB編碼。其中，BabA是研究比較明確的黏附素，能與胃黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的血型抗原Lewis b相結(jié)合［17］。SabA是一種細(xì)菌表面蛋白，主要與H.pylori感染后的炎癥反應(yīng)和持續(xù)黏附有關(guān)［18］。AlpA、AlpB是兩種具有特異性黏附功能的外膜蛋白，主要與宿主的黏連蛋白結(jié)合介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)胃黏膜上皮的黏附［19］。在黏附素基因突變情況下，幽門螺桿菌黏附能力明顯降低，失去致病性。

近年來(lái)，H.pylori對(duì)抗生素的耐藥性增強(qiáng)成為H.pylori根除治療失敗的主要原因［20］。中西醫(yī)結(jié)合治療可提高H.pylori根除率或改善患者癥狀，提高消化性潰瘍愈合質(zhì)量［21］。目前已發(fā)現(xiàn)多種中藥或其有效成分可通過(guò)干預(yù)H.pylori致病的多個(gè)生理病理環(huán)節(jié)發(fā)揮抗H.pylori作用［22］。

黃芪（Astragali Radix）為一類臨床上應(yīng)用較為廣泛的補(bǔ)益類中藥材，性微溫，味甘，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益氣固表、托毒生肌、利水退腫的功效。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有增強(qiáng)和調(diào)節(jié)免疫功能、廣譜抗病毒、抗衰老、清除過(guò)剩氧自由基等作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，黃芪與桂枝、白芍、甘草、生姜等配伍的黃芪建中湯加減方有很好的抗H.pylori療效［6］。陳昶洲等［23］通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)四聯(lián)療法（鉍劑+PPI+兩種抗菌藥物）聯(lián)合黃芪顆粒能有效提高慢性胃炎伴消化不良患者的H.pylori根除率，且具有良好的安全性。王成喜等［24］發(fā)現(xiàn)，黃芪具有殺滅H.pylori、抗?jié)?、抑制胃酸分泌等作用。ASIV為黃芪的主要活性成分，具有抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等功能。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ASIV有較好的抗菌作用，對(duì)大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌，甚至結(jié)核分枝桿菌的抑菌作用均有報(bào)道［25］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)考察ASIV對(duì)H.pylori定植相關(guān)因子（尿素酶活性、鞭毛動(dòng)力、ureA、ureB、flaA、flaB、babA、sabA、alpA、alpB等定植相關(guān)基因）的影響，發(fā)現(xiàn)ASIV能消弱H.pylori的定植能力，且主要是通過(guò)抑制尿素酶的活性和下調(diào)尿素酶相關(guān)基因（ureA、ureB）mRNA水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。