王 洋，張 建，楊忠路，蘭 懷，王輝山

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管外科，遼寧 沈陽 110016

心房顫動(dòng)的病理生理機(jī)制高度復(fù)雜且多變，不同的危險(xiǎn)因素在特定的個(gè)體中促發(fā)不良的心房重構(gòu)過程，從而導(dǎo)致心房顫動(dòng)[1-2]。心房顫動(dòng)的維持與心房重構(gòu)密切相關(guān)，心房重構(gòu)包括電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)，共同構(gòu)成心房顫動(dòng)發(fā)生與持續(xù)的病理基礎(chǔ)。心房增大及心肌纖維化被認(rèn)為是心房顫動(dòng)相關(guān)結(jié)構(gòu)重構(gòu)的標(biāo)志[3-4]。心房顫動(dòng)可促進(jìn)心房纖維化[5-7]。因此，防止心肌纖維化的形成對(duì)心房顫動(dòng)的治療具有重要意義。有研究表明，小檗堿是治療心血管疾病最有前途的天然產(chǎn)物衍生藥物之一，可通過激活觸發(fā)各種信號(hào)通路以防治心血管疾病[7-10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可抑制心肌纖維化的發(fā)展[11-12]。本研究通過建立心房纖維化模型，探討小檗堿對(duì)心肌纖維化心房重構(gòu)的影響及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 選取30只普通級(jí)健康雄性新西蘭大耳白兔為研究對(duì)象，體質(zhì)量2.8～3.2 kg，購自青島康大生物科技有限公司。鹽酸小檗堿(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司)；免疫組化試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Immunoway YM3365)；Masson三色染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；2.4 GHz科研型植入式動(dòng)物遙測(cè)刺激系統(tǒng)、植入子(型號(hào)：Ensense-2.4G)、六通道接收機(jī)系統(tǒng)(型號(hào)：Ensense-2.4G)。本研究對(duì)白兔的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 分組及模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為左心房快速起搏組(RAP組)、左心房快速起搏+小檗堿組(RAP+BBR組)、假手術(shù)組(SHAM組)、假手術(shù)+小檗堿組(SHAM+BBR組)、空白對(duì)照組(Control組)，每組各6只。RAP+BBR組及SHAM+BBR組術(shù)前給予小檗堿100 mg/(kg·d)灌胃，1次/d，持續(xù)1周。RAP組、SHAM組、Control組均給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)1周。術(shù)后給予發(fā)放間歇電刺激。具體參數(shù)設(shè)定為：刺激2 s暫停2 s、頻率20 Hz、強(qiáng)度2 mA、脈寬1 ms。按此程序刺激2周。同時(shí)RAP+BBR組及SHAM+BBR組給予小檗堿灌胃(同術(shù)前)，持續(xù)2周。RAP組、SHAM組、Control組均給予等量生理鹽水灌胃(同術(shù)前)。給予兔陸眠寧Ⅱ和咪達(dá)唑侖麻醉后，剪開左側(cè)中上腹部皮膚至皮下層，制作皮下囊袋置入植入子，4根電極導(dǎo)線經(jīng)皮下隧道延伸，在兩側(cè)腋下皮下縫置兩個(gè)心電采集電極，觀察心電圖。經(jīng)三肋間開胸，剪開心包，兩個(gè)刺激電極分別縫合于左心耳和左心房上，兩個(gè)電極間至少保持10 mm距離，縫合切口。應(yīng)用青霉素鈉抗感染。實(shí)驗(yàn)兔恢復(fù)后，開啟動(dòng)物遙測(cè)刺激系統(tǒng)，通過無線收發(fā)采集和刺激信號(hào)，利用PowerLab生理記錄儀連續(xù)監(jiān)測(cè)體表I導(dǎo)聯(lián)心電信號(hào)，通過專用計(jì)算機(jī)程序刺激軟件，發(fā)放間歇電刺激。各組實(shí)驗(yàn)兔均在術(shù)后2周處死，摘取整個(gè)左心房組織，稱重，部分心房心肌應(yīng)用4%多聚甲醛浸泡固定，后期脫水包埋蠟塊。部分液氮速凍后置于-80℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 組織學(xué)分析 切取4～5 μm的石蠟切片，進(jìn)行Masson染色及膠原容量分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)計(jì)算，評(píng)估纖維化面積。測(cè)量藍(lán)色區(qū)域顯示纖維化，紅色標(biāo)記心肌細(xì)胞。另取4～5 μm切片進(jìn)行HE染色，評(píng)估心肌細(xì)胞的膠原纖維變化。

1.4 免疫組織化學(xué)測(cè)定 心房組織標(biāo)本切成4～5 μm切片，在二甲苯和乙醇中脫蠟至水，抗體在4℃過夜。磷酸緩沖鹽溶液處理后，滴加羊抗兔二抗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，封片。

1.5 α-SMA表達(dá)的檢測(cè) 將心房組織勻漿，離心。采用二喹啉甲酸蛋白測(cè)定試劑盒(上海鉑萊生物科技有限公司)定量總蛋白。蛋白質(zhì)在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺變性凝膠上裝載與分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。分別用β-actin(1∶1 000，Abcam)、α-SMA(1∶500，Immunoway)一抗在4℃過夜。經(jīng)TBST洗滌后，加5%牛血清白蛋白稀釋熒光二抗，室溫下孵育1 h。采用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對(duì)各組實(shí)驗(yàn)兔左房質(zhì)量的影響 RAP組左房質(zhì)量顯著高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SHAM+BBR組左房質(zhì)量高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 小檗堿對(duì)各組實(shí)驗(yàn)兔左房質(zhì)量影響

2.2 各組心房組織Masson染色及CVF定量分析 各組心房組織Masson染色結(jié)果見圖2。膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色。RAP組心肌纖維化面積增多。RAP+BBR組心肌間質(zhì)纖維化較RAP組明顯減輕。SHAM組與SHAM+BBR組纖維化程度相當(dāng)。Control組心肌纖維排列整齊，細(xì)胞核大小正常。CVF定量分析顯示，與Control組比較，其他各組心肌間質(zhì)纖維化明顯增加(P<0.05)，RAP+BBR組膠原纖維數(shù)量較RAP組明顯減少(P<0.05)，SHAM組與SHAM+BBR組膠原纖維數(shù)量相當(dāng)(P>0.05)。見圖3。

圖2 各組心房組織標(biāo)本Masson染色分析(HE×20)

圖3 CVF定量分析染色結(jié)果

2.3 各組心房組織HE染色結(jié)果 Control組心肌纖維排列整齊致密，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞外基質(zhì)減少，而RAP組心肌纖維萎縮、排列紊亂，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與RAP組比較，RAP+BBR組上述病理改變明顯減輕。SHAM組與SHAM+BBR組病理改變程度相當(dāng)，介于RAP+BBR組與Control組之間。見圖4。

圖4 各組心房組織HE染色結(jié)果(HE×20)

2.4 RAP組與RAP+BBR組心房組織中α-SMA表達(dá)情況 RAP+BBR組心房組織α-SMA表達(dá)明顯低于RAP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5～6。

圖5 RAP組與RAP+BBR組心房組織中α-SMA與β-actin蛋白印跡圖

3 討論

心房重構(gòu)，特別是間質(zhì)纖維化，是心房顫動(dòng)發(fā)生的重要因素[13]。心房重構(gòu)包括電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)，心房纖維化是心房顫動(dòng)主要病理改變之一。心房增大和心肌纖維化是心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要特征[14]，該過程是不可逆的。心功能改變與心肌間質(zhì)膠原過度沉積是心肌纖維化的特征，心房組織中CVF為臨床上心肌纖維化程度的指標(biāo)[15]。成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物是α-SMA。α-SMA的表達(dá)對(duì)心房顫動(dòng)產(chǎn)生了明顯的影響，并且會(huì)引起心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，造模2周后，RAP組心房質(zhì)量明顯增大，RAP+BBR組心房重量較RAP組明顯減小。Masson染色發(fā)現(xiàn)，RAP+BBR組心肌纖維化程度較RAP組明顯減輕。以上結(jié)果提示，小檗堿能抑制RAP組心房纖維化。免疫組化結(jié)果顯示，與RAP組比較，RAP+BBR組α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減低，α-SMA表達(dá)水平受到抑制，說明小檗堿治療改善了這一變化。本研究證實(shí)，單獨(dú)的RAP可以引起膠原纖維在心房肌中的表達(dá)，提示心房顫動(dòng)期間的心動(dòng)過速可能引起心房纖維化導(dǎo)致的心房重構(gòu)，同時(shí)伴有左房質(zhì)量的增加。小檗堿可通過抑制a-SMA表達(dá)，有效抑制RAP誘導(dǎo)的心房纖維化和伴隨的心房顫動(dòng)易感性。

圖6 半定量分析α-SMA表達(dá)

綜上所述，小檗堿可能通過減輕心肌纖維化，進(jìn)而產(chǎn)生預(yù)防心房顫動(dòng)的作用，為心肌纖維化與心房顫動(dòng)的治療提供新的治療靶點(diǎn)。