唐藝旻， 李英杰， 高立娣， 秦世麗*， 靳鳳龍, 劉樹仁

( 1.齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江齊齊哈爾 161005；3.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院環(huán)境健康研究所，浙江杭州 310012)

鹽酸地爾硫卓和鹽酸維拉帕米同為鈣離子拮抗劑[1,2]，可用于治療高血壓，心絞痛等疾病，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。這兩種藥物的藥理藥效極其相似，在臨床用藥過程中，常常交換使用，但是鹽酸維拉帕米對冠狀動脈痙攣的預(yù)防效果僅為鹽酸地爾硫卓的1/8～1/3。值得關(guān)注的是這兩種藥均為手性藥物且以外消旋體供藥，這會導(dǎo)致藥效的降低甚至危害人體健康[3]，但有關(guān)這兩種藥物的手性拆分方法卻鮮見報道。因此，探索這兩種混合藥物的分離檢測方法無論對臨床治療還是在基礎(chǔ)研究方面都具有重要意義。

圖1 鹽酸地爾硫卓(A)和鹽酸維拉帕米(B)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of diltiazem hydrochloride(A) and verapamil hydrochloride(B)

在過去的幾十年中，基于高效液相色譜(HPLC)[4,5]、氣相色譜(GC)[6]、超臨界流體色譜(SFC)[7]、薄層色譜(TLC)[8]、毛細(xì)管電泳(CE)[9,10]和毛細(xì)管電色譜(CEC)[11]等方法的對映體拆分技術(shù)均得到不同程度的發(fā)展。CEC具備HPLC的高效性和CE的高選擇性，其與β-環(huán)糊精[12]或其衍生物的結(jié)合，改善了手性藥物在CEC中的分離效果。Zou等[13]通過將PDA/S-β-CD附著到涂覆有Au NPs的毛細(xì)管上制成開管柱，實現(xiàn)10種手性藥物的基線分離。CEC-MS法[14]在CEC的基礎(chǔ)上增加了具有定性分析功能的MS，這使得分析范圍更廣，靈敏度更高。Yan等[15]以HP-β-CD為手性選擇劑，應(yīng)用CEC-MS法同時對延胡索提取物中的四氫巴馬汀和卡丹汀進(jìn)行對映選擇性分析，該方法無需任何預(yù)純化即可直接用于測定復(fù)雜基質(zhì)中的分析物。本文采用實驗室自制的順丁烯二酸酐-β-環(huán)糊精(MAH-β-CD)[16]作為手性固定相，制備MAH-β-CD電色譜整體柱，采用毛細(xì)管電色譜-電噴霧電離-飛行時間質(zhì)譜(CEC-ESI-TOF MS)對鹽酸地爾硫卓和鹽酸維拉帕米混合手性藥物進(jìn)行分離檢測，獲得結(jié)果滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7100 CE毛細(xì)管電泳儀，6230 飛行時間質(zhì)譜儀(美國，安捷倫公司)；S-4300掃描電子顯微鏡(日本，日立公司)。

手性藥物標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%，中國藥品生物制品檢定所)；甲基丙烯酸-三甲基硅烷丙酯(γ-MAPS)、聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)(分析純，阿拉丁試劑)；偶氮二異丁腈(AIBN)、2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)(美國Fluka公司)。實驗用水均為超純水。

鹽酸地爾硫卓片劑、鹽酸維拉帕米片劑(中國天津田邊制藥有限公司)。

1.2 整體柱制備

將硅烷化試劑(γ-MAPS∶丙酮=1∶1)注入毛細(xì)管柱中后，將兩端封口。室溫放置24 h，甲醇沖洗，用N2吹干，待用。稱量0.15 g GMA，0.10 g EDMA，0.10 g 環(huán)己醇，0.24 g 正十二醇，0.0018 g AIBN，0.0016 g AMPS 和0.10 g MAH-β-CD的DMSO溶液(0.2 g/mL)，超聲混勻。將混合物填充至毛細(xì)管柱中24.0 cm處(柱總長130 cm)，40 ℃反應(yīng)12 h后，備用。

1.3 樣品的制備

取一片鹽酸地爾硫卓或鹽酸維拉帕米片劑重量的粉末，溶于10 mL甲醇中，超聲溶解，6 000 r/min離心10 min，上清液用甲醇稀釋至適當(dāng)濃度，每次用前過0.22 μm濾膜。

1.4 CEC分離條件

采用pH=4.50的20 mmol/L NH4Ac作為運(yùn)行緩沖溶液，運(yùn)行電壓20 kV，分離溫度20 ℃，壓力進(jìn)樣(5 kPa×3 s)，波長200 nm處紫外檢測。

1.5 ESI -TOF/MS 檢測條件

離子源：電噴霧電離，正離子模式；掃描范圍：m/z300～500，霧化氣壓力241 kPa，干燥氣為N2(純度99.999%)：溫度300 ℃，流速8 L/min；鞘流液為50%甲醇，流速為0.3 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 電色譜整體柱掃描電鏡表征

電色譜整體柱掃描電鏡(SEM)圖如圖2。可見聚合物成功鍵合到柱內(nèi)壁上，柱內(nèi)形成了致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其形態(tài)錯綜復(fù)雜，由此推測該柱有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度。而且柱內(nèi)較大的孔徑保證了一定的通透性。

圖2 手性柱內(nèi)固定相掃描電鏡(SEM)圖Fig.2 SEM images of the stationary phase in monolithic column A.cross-section；B.a part of cross-section.

2.2 CEC分離條件優(yōu)化

2.2.1 運(yùn)行緩沖溶液種類及濃度的選擇本實驗考慮到避免MS中霧化器堵塞，以及離子源污染進(jìn)而影響檢測，損壞儀器等問題，故選擇易揮發(fā)的NH4Ac為CEC-MS的運(yùn)行緩沖溶液。在一定濃度范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度和電滲流均隨緩沖溶液濃度的增加而增加，但濃度過大產(chǎn)生氣泡，不利于對映體分離。本實驗選擇20 mmol/L NH4Ac為緩沖體系的濃度。

2.2.2 緩沖溶液pH值的選擇毛細(xì)管表面電荷密度和電滲流平衡受緩沖溶液pH的直接影響，進(jìn)而影響組分分離。由于鹽酸地爾硫卓有2個手性中心，故其有4個異構(gòu)體；鹽酸維拉帕米有1個手性中心，其含有2個異構(gòu)體。而在本實驗所考察的pH范圍內(nèi)，兩混合藥物對映體6組分中有4組分被檢測出來，且實現(xiàn)不同程度的分離(混合手性藥物對映體的4組分峰分別用A、B、C、D表示)，4組分兩兩間在不同pH值下的分離度(Rs)見表1。結(jié)果表明，pH=4.50時4組分的分離效果較好，故最佳pH值選為4.50。

表1 pH對兩種混合手性藥物分離的影響

Rs1：Resolution of peak A and B；Rs2：Resolution of peak B and C；Rs3：Resolution of peak C and D.

2.2.3 運(yùn)行電壓的選擇分析物遷移時間隨著電壓增大而減小，分離度則是先增大后減小。分離度減小是由于過大的電壓使得柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡，進(jìn)而影響組分分離。圖3為不同電壓下混合手性藥物鹽酸地爾硫卓和鹽酸維拉帕米電色譜分離圖，電壓為20 kV時，兩混合手性藥物各組分間分離度達(dá)最大，從而確定運(yùn)行電壓為20 kV。

圖3 電壓對兩種混合手性藥物分離的影響Fig.3 Effect of voltage on separation of two chiral drugs mixtureConditions:20 mmol/L NH4Ac(pH=4.50);column temperature:20 ℃;detection wavelength:200 nm.

2.3 ESI-TOF/MS檢測條件的優(yōu)化

2.3.1 鞘流液的選擇分析物的電離強(qiáng)度，背景信號值等很大程度上受鞘流液的種類和濃度的影響。與異丙醇相比，甲醇為鞘流液時背景噪音較低且分析物電離強(qiáng)度較大。當(dāng)甲醇含量20%～60%時，分析物電離強(qiáng)度各有不同，結(jié)果如圖4。鞘流液中甲醇含量為50%時，混合手性藥物藥物的4組分(A、B、C、D)電離強(qiáng)度均達(dá)到最大值，故濃度為50%的甲醇作為本實驗的鞘流液。

圖4 鞘流液中甲醇含量對電離的影響Fig.4 Effect of methanol content on the ionization of the sheath fluid

2.3.2 鞘流液流速的選擇考察流速范圍：0.2～1.0 mL/min，當(dāng)流速由0.2 mL/min增至0.4 mL/min時，分析物電離強(qiáng)度略微增大；流速大于0.4 mL/min時，稀釋作用導(dǎo)致電離強(qiáng)度減小。故選擇0.3 mL/min作為鞘流液流速。

2.4 混合手性藥物的CEC-TOF MS定性分析

在本實驗優(yōu)化的條件下，檢測出兩混合手性藥物的4組分。圖5為混合手性藥物總離子流圖色譜圖。為了驗證檢測出兩混合手性藥物4組分的主要成分，采用MS對圖5中4組分峰進(jìn)行定性分析，各組分提取質(zhì)譜圖見圖6。

圖5 鹽酸地爾硫卓和鹽酸維拉帕米混合物的總離子流(TIC)色譜圖Fig.5 TIC chromatogram of diltiazem hydrochloride and verapamil hydrochloride mixtureConditions:20 mmol/L NH4Ac(pH=4.50);separation voltage:20 kV;column temperature:20 ℃;detection wavelength:200 nm.

圖6A、6B分別為保留時間16.41 min和16.54 min組分的質(zhì)譜圖，其中m/z為 415.04840和415.16501的離子峰均為鹽酸地爾硫卓的[M-HCl+H]+峰。圖6A中，其失去15(CH3)和32(H3CO)的碎片后分別產(chǎn)生m/z為400.02151 和383.88901的質(zhì)譜峰；圖6B中，其失去15(CH3)和32(H3CO) 碎片后分別產(chǎn)生m/z為 400.23206和383.18006的質(zhì)譜峰，由此推斷，圖6A、6 B為鹽酸地爾硫卓異構(gòu)體。圖6C、6D分別為保留時間17.61 min和17.91 min組分的質(zhì)譜圖，其中m/z455.28536和 455.28555的離子峰均為鹽酸維拉帕米的[M-HCl+H]+峰。圖6C中，其失去15(CH3)、32(H3CO)和44(CH(CH3)2)的碎片后分別產(chǎn)生m/z為 440.74425、423.96664和411.70574的質(zhì)譜峰；圖6D中，其失去15(CH3)、32(H3CO)和44(CH(CH3)2)的碎片后分別產(chǎn)生m/z為 440.26876、423.27350和411.15385的質(zhì)譜峰，由此推斷，圖6C、6D為鹽酸維拉帕米的對映異構(gòu)體。

圖6 四個組分的質(zhì)譜圖Fig.6 MS spectra of four componentsA,B:diltiazem hydrochloride isomer；C,D:verapamil hydrochloride isomer.

2.5 實際樣品的分離定性

為檢驗整體柱的實際應(yīng)用價值，使用該柱在“1.4”和“1.5”的最佳CEC及MS條件下，分離分析市售鹽酸維拉帕米和地爾硫卓混合手性藥物。如圖7所示，檢測出的4組分達(dá)到了基線分離，說明市售混合手性藥物被初步分離檢測。

圖7 混合實際藥品總TIC色譜圖Fig.7 TIC chromatogram of a mixture consisting of actual diltiazem hydrochloride and verapamil hydrochloride

3 結(jié)論

本文以MAH-β-CD整體柱為色譜分離柱，利用CEC-ESI-TOF MS聯(lián)用技術(shù)對鹽酸地爾硫卓和維拉帕米混合手性藥物進(jìn)行分離分析。在最佳條件下，混合藥物的6組分中有4組分達(dá)到基線分離并被檢測出來。由于鹽酸地爾硫卓含有2個手性中心，采用本實驗方法并沒有實現(xiàn)該藥物對映體的完全分離。但該方法可同時成功檢測出鹽酸地爾硫卓的2種異構(gòu)體及鹽酸維拉帕米的2種異構(gòu)體，為今后混合手性藥物的檢測及拆分奠定了一定的基礎(chǔ)。