史艷梅， 張 茜， 張俊霞， 李秀敏， 苗明三*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，河南鄭州 450001；2.紐約醫(yī)學(xué)院微生物和免疫學(xué)系，美國(guó)紐約 10595)

黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，其藥用價(jià)值廣泛，為臨床常用中藥之一。黃芩苷(Baicalin，BA)作為中藥黃芩的主要活性成分，具有抗炎[1]、抗過(guò)敏[2]、抗菌[3]、抗病毒[4]、抗腫瘤[5]的藥理作用。市場(chǎng)上含黃芩的中藥制劑種類繁多，而B(niǎo)A常被作為標(biāo)志物用于藥物的質(zhì)量控制，所以建立快速靈敏的BA檢測(cè)方法具有重要意義。目前，BA常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[6]、紫外分光光度法[7]、液-質(zhì)聯(lián)用法[8]和電化學(xué)方法[9]等。其中，電化學(xué)方法因具有儀器操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[10]。眾所周知，電化學(xué)傳感器的優(yōu)良性能取決于提高傳感材料的電活性面積及電子傳輸能力。因此，構(gòu)建高電活性的納米傳感復(fù)合材料在電化學(xué)分析中具有重要意義。

還原氧化石墨烯(rGO)是一種優(yōu)良的二維蜂窩狀納米材料，碳原子sp2的雜化方式使其具有獨(dú)特的片層結(jié)構(gòu)從而具有較大的比表面積[10]，廣泛應(yīng)用于電化學(xué)領(lǐng)域。然而rGO在制備過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)缺陷，影響其導(dǎo)電性能[11]。金納米粒子(Au NPs)具有導(dǎo)電性好和比表面積大的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合在rGO表面后通過(guò)協(xié)同作用可進(jìn)一步增強(qiáng)納米復(fù)合材料的比表面積及電子轉(zhuǎn)移速率，同時(shí)可以有效防止rGO片層間的聚集，提高rGO材料的電化學(xué)檢測(cè)性能[12]。本研究利用原位還原法制備了Au NPs@rGO納米復(fù)合材料，并應(yīng)用于構(gòu)建BA電化學(xué)傳感器。對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)BA的電化學(xué)反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；三電極系統(tǒng)：工作電極為玻碳電極(GCE，Φ=3 mm)或修飾GCE，參比電極為Ag/AgCl電極，對(duì)電極為鉑絲電極；高效液相色譜儀(Waters 2695);電子分析天平(ME204，Mettler Toledo)； pHS -3C pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；ELGA Centra R200超純水機(jī)(UK)。

黃芩苷(BA)(≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6](天津光復(fù)科技有限公司)；檸檬酸鈉、KCl、KH2PO4、Na2HPO4(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；Nafion溶液(Nafion D -520分散液，阿法埃莎化學(xué)有限公司)；石墨粉(≥325目，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；HAuCl4·3H2O(ACROS公司)。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

雙黃連口服液(河南太龍藥業(yè)股份有限公司)。

1.2 Au NPs@rGO納米復(fù)合材料的制備

采用Hummers法以石墨粉為原料制備氧化石墨烯(GO)[13]。取25 mL 4.0 mg/mL的GO懸浮液，超聲分散，在攪拌下加入200 μL 1%的HAuCl4并加熱至80 ℃，逐滴加入1.2 mL 80%的水合肼溶液，80 ℃下加熱回流2 h，8 000 r/min離心，水洗3次，重新分散在25 mL水中即得到Au NPs@rGO復(fù)合物。取5 mL Au NPs@rGO與0.5%Nafion溶液(1∶1)混合，即得修飾電極的納米復(fù)合材料AuNPs@rGO。

1.3 修飾電極的制備

分別用0.3、0.05 μm的Al2O3拋光粉將GCE表面打磨至鏡面狀，依次用乙醇和水各超聲清洗1 min，晾干后，吸取5 μL Au NPs@rGO -Nafion分散液滴涂在GCE表面，紅外燈下干燥后，即可得到修飾電極Au NPs@rGO -Nafion/GCE。

1.4 電化學(xué)檢測(cè)

在含有BA的0.25 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.0)中，采用三電極工作體系，在攪拌作用下富集3 min，然后在-0.2～0.7 V范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，利用循環(huán)伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量結(jié)束后，用水沖洗電極，隨后在空白PBS中掃描更新電極表面。所有測(cè)量均在室溫下進(jìn)行。

2 結(jié)果和討論

2.1 Au NPs@rGO復(fù)合材料的表征

利用掃描電鏡(SEM)對(duì)Au NPs@rGO復(fù)合材料形貌進(jìn)行分析。如圖1所示，電極表面具有眾多褶皺，顯著增大了電極的比表面積，同時(shí)看到Au NPs均勻的分布在rGO表面，表明Au NPs@rGO復(fù)合材料構(gòu)建成功。

圖1 Au NPs@rGO復(fù)合材料的掃描電子顯微鏡(SEM)照片F(xiàn)ig.1 SEM image of Au NPs@rGO composite material

2.2 Au NPs@rGO -Nafion/GCE的電化學(xué)表征

為了評(píng)價(jià)Au NPs@rGO -Nafion/GCE的電化學(xué)性能，以[Fe(CN)6]3-/4-溶液作為探針，進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描。由圖2可知，裸GCE上有一對(duì)典型的氧化還原峰，峰電位差為73 mV，接近理論值69 mV，說(shuō)明電極狀態(tài)良好，適用于制備修飾電極。在rGO -Nafion/GCE上進(jìn)行測(cè)定時(shí)，探針響應(yīng)峰電流及背景電流明顯增加；且在Au NPs@rGO-Nafion/GCE上時(shí)，響應(yīng)峰電流及背景電流進(jìn)一步顯著提升，推測(cè)可能是由于Au NPs@rGO復(fù)合材料顯著提高了電極比表面積，進(jìn)而增加了反應(yīng)的活性位點(diǎn)致使其電化學(xué)信號(hào)顯著增強(qiáng)。為了更好地闡釋復(fù)合材料Au NPs-@rGO對(duì)電活性比表面積的影響，利用CV法對(duì)其進(jìn)行了探究，根據(jù)Randles-Sevcik公式[14]可計(jì)算出Au NPs@rGO -Nafion/GCE和GCE的電活性比表面積分別為0.229 cm2和0.117 cm2。

圖2 GCE(a)、rGO -Nafion/GCE(b) 和Au NPs@rGO -Nafion/GCE(c)在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循環(huán)伏安(CV)圖Fig.2 CVs of bare GCE(a),rGO -Nafion/GCE(b) and Au NPs@rGO -Nafion/GCE(c) in [Fe(CN)6]3-/4-solutionscan rate:125 mV/s.

2.3 BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的電化學(xué)行為

圖3(A)分別為GCE、rGO -Nafion/GCE、Au NPs@-rGO -Nafion/GCE在5 μmol/L BA中，在125 mV/s掃速下的CV曲線。GCE在0.177 V處出現(xiàn)一個(gè)弱的氧化峰，說(shuō)明裸GCE的吸附能力較弱，電化學(xué)反應(yīng)較慢；在rGO -Nafion/GCE上出現(xiàn)一對(duì)典型的氧化還原峰，且響應(yīng)電流明顯增加；而在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上，響應(yīng)電流進(jìn)一步增強(qiáng)，說(shuō)明由于Au NPs@rGO納米復(fù)合材料大的比表面積和良好的導(dǎo)電能力，增強(qiáng)了BA的電化學(xué)反應(yīng)性能。為了研究反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，考察了BA在不同掃描速度下的電化學(xué)行為。如圖3(B)所示，隨著掃速的增加，響應(yīng)電流也逐漸增加。在掃描速率在0.025～0.3 V/s的范圍內(nèi)，峰值電流與掃描速度之間呈良好的線性關(guān)系(圖3(C))，推斷BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上是吸附控制的過(guò)程。同時(shí)，由圖3(B)可知響應(yīng)峰電位隨掃速的變化也隨之變化，其氧化峰電位(Epa)與掃描速率的對(duì)數(shù)(lnv)線性關(guān)系良好(圖3(D))，根據(jù)Laviron理論[15]，可計(jì)算出BA的電子傳遞數(shù)n為2.2≈2，α值是0.69。采用計(jì)時(shí)電量法(Q-t)評(píng)估BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的飽和吸附量。圖3(E)為Au NPs@-rGO -Nafion/GCE在5 μmol/L BA溶液(a)及PBS空白溶液(b)中的Q-t曲線，對(duì)應(yīng)的Q-t1/2曲線展示在圖3(F)中。如圖3(F)所示，曲線a和b的斜率幾乎相等，進(jìn)一步證明了該電化學(xué)反應(yīng)是吸附控制的過(guò)程。根據(jù)公式:Q=nFAΓ*計(jì)算，BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的飽和吸附量(Γ*)為3.8×10-9mol/cm2。

圖3 (A)不同電極在BA溶液中的CV圖；(B)BA在不同掃描速率下的CV圖(a→l：0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3 V/s)；(C)電流和掃描速率之間的校正曲線；(D)Epa和lnv之間的校正曲線；(E)Au NPs@rGO -Nafion/GCE在BA溶液(a)和空白溶液(b)中的計(jì)時(shí)電量曲線(Q-t)；(F)Q和t1/2之間的校正曲線Fig.3 (A) CVs of different electrodes in baicalin solution;(B) CVs of baicalin at different scan rates(a→l:0.025,0.05,0.075,0.1,0.125,0.15,0.175,0.2,0.225,0.25,0.275,0.3 V/s);(C) Calibration curve between oxidized current and scan rate;(D) Calibration curve between Epa and lnv;(E) Chronocoulometric curve(Q -t) of Au NPs@rGO -Nafion/GCE in baicalin solution(curve a) and blank solution(curve b);(F) Calibration curve between Q and t1/2

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1 底液pH值和濃度的影響在5 μmol/L BA溶液中，對(duì)支持電解質(zhì)PBS的pH值(2.0～9.0)和濃度(0.1～0.35 mol/L)進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4(A)所示，pH=7.0時(shí)峰電流達(dá)到最大值，隨后開(kāi)始減小，因此選擇7.0作為測(cè)定BA的最佳pH值。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨pH增大，響應(yīng)峰電位向負(fù)電位方向移動(dòng)，說(shuō)明有質(zhì)子參與該電極反應(yīng)[16]。由圖4(B)可知Epa與pH之間存在線性關(guān)系，回歸方程為：Epa=-0.0537pH+0.5821，R2=0.9922。方程的斜率與理論值0.059 V/pH相近，說(shuō)明BA在修飾電極上是等質(zhì)子等電子的過(guò)程，鑒于計(jì)算所得電子轉(zhuǎn)移數(shù)為2，可知兩個(gè)質(zhì)子兩個(gè)電子參與了BA的電化學(xué)反應(yīng)。如圖4(B)所示，PBS濃度在0.1～0.25 mol/L范圍內(nèi)，BA氧化峰電流隨PBS濃度的增大而增大，而后繼續(xù)增加其濃度，響應(yīng)電流反而減小，故PBS的最佳濃度設(shè)定為0.25 mol/L。

2.4.2 富集時(shí)間的影響在吸附控制的電化學(xué)反應(yīng)中，富集時(shí)間是影響檢測(cè)靈敏度的又一重要參數(shù)?？疾炝烁患瘯r(shí)間對(duì)5 μmol/L BA氧化峰電流的影響，結(jié)果如圖4(C)所示，隨富集時(shí)間增加，響應(yīng)電流逐漸增大，至180 s時(shí)，吸附量趨于飽和，之后變化緩慢，選擇180 s為最佳的富集時(shí)間。

圖4 (A)pH對(duì)響應(yīng)電流的影響；(B) PBS濃度對(duì)響應(yīng)電流的影響；(C) 富集時(shí)間對(duì)響應(yīng)電流的影響Fig.4 (A)Effect of pH on response current;(B) Effect of PBS concentration on response current;(C) Effect of enrichment time on response current

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利用差分脈沖伏安法(DPV)研究了不同濃度BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的電化學(xué)響應(yīng)。圖5可以觀察到峰電流隨著B(niǎo)A濃度的增大而增加，在0.05～10 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Ipa=-18.953c-6.8269，R2為0.9961，檢出限(S/N=3)為0.01 μmol/L。說(shuō)明BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上具有較高靈敏度。

圖5 不同濃度BA(a→h:0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 μmol/L)在PBS(pH=7.0中的DPV圖(插圖是BA濃度與電流之間的校正曲線)Fig.5 DPV of different concentration of BA(a→h:0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 μmol/L) in PBS buffer (pH=7.0)(The insert was the calibration plot between current and BA concentration)

2.6 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和干擾實(shí)驗(yàn)

按照上述制備方法，平行制備5根修飾電極，在最佳條件下放入2 μmol/L的BA溶液中依次測(cè)定，結(jié)果顯示，傳感器相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.53%，具有良好的重現(xiàn)性。將使用過(guò)的修飾電極，在冰箱中放置7 d后再次進(jìn)行測(cè)量，響應(yīng)電流值為初始電流的92.20%，具有較好的穩(wěn)定性。

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，評(píng)估了幾種可能的干擾物對(duì)電極檢測(cè)能力的影響。當(dāng)BA濃度為2 μmol/L，在允許相對(duì)誤差為5%時(shí)，300倍Ca2+、Mg2+、Zn2+，100倍尿酸，50倍的多巴胺、抗壞血酸對(duì)BA信號(hào)無(wú)影響。說(shuō)明該方法具有良好的選擇性，可以應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用所建立的方法，對(duì)雙黃連口服液中BA含量進(jìn)行測(cè)定。分析前取適量的雙黃連口服液，用pH為7.0的0.25 mol/L的PBS稀釋50倍，0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定，計(jì)算得到稀釋后口服液中BA的含量為2.78 μmol/L。進(jìn)一步在該待測(cè)液中進(jìn)行BA加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，其回收率在99.60%～105.3%之間，RSD低于3.12%。為了驗(yàn)證該傳感器的準(zhǔn)確性，利用HPLC法對(duì)雙黃連口服液中BA的濃度進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：0.6%冰HAc(A相)，乙腈(B相)；洗脫條件：0～4 min，15%→18%B；4～10 min，18%→25%B；10～20 min，25%→30%B；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。測(cè)得實(shí)際樣品中BA的含量為2.65 μmol/L，RSD為1.89%。電化學(xué)方法與HPLC法所得結(jié)果相吻合，證明所制備的Au NPs@rGO -Nafion/GCE對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)定具有較高的準(zhǔn)確度。

表1 實(shí)際樣品中BA的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

利用原位還原法制備了Au NPs@rGO納米復(fù)合材料，并用于構(gòu)建高靈敏的BA電化學(xué)傳感器。在最優(yōu)條件下，BA在0.05～10 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.01 μmol/L。所構(gòu)建的Au NPs-@rGO -Nafion/GCE傳感器為中藥制劑中BA的快速靈敏檢測(cè)提供了新方法。