張 驄，劉 暢

（吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，長春 130021）

牙囊屬于一種松散的外胚間源性結(jié)締組織，它在萌發(fā)期間圍繞著正在發(fā)育的牙胚［1］。牙囊細(xì)胞來自于牙胚發(fā)育中的牙囊組織，被認(rèn)為是成牙骨質(zhì)細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞。以往研究表明，牙囊細(xì)胞具有多向分化潛能，其在一定條件誘導(dǎo)下可向成骨方向分化牙囊細(xì)胞包含由牙周膜（PDL），牙槽骨和礦化的牙骨質(zhì)組成的牙周組織的祖細(xì)胞，它對于牙根和牙齒發(fā)育的協(xié)調(diào)至關(guān)重要［2-3］。文獻(xiàn)研究表明，分離的人類牙囊細(xì)胞（DFC）能夠分化成礦化細(xì)胞。而人口腔中的鈣化組織就是由牙齒成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞或由牙槽骨成骨細(xì)胞樣細(xì)胞組成［4-5］。然而，牙囊細(xì)胞向功能細(xì)胞（如成骨細(xì)胞/成牙骨質(zhì)細(xì)胞）分化的調(diào)節(jié)機(jī)制仍知之甚少。因此，如何誘導(dǎo)牙囊細(xì)胞成骨定向分化成為牙齒硬組織結(jié)構(gòu)再生研究的關(guān)鍵之一［6］。

微小RNA（miRNA）是干細(xì)胞生長發(fā)育中非常重要的調(diào)節(jié)因子［7］。這些短的RNA（大約22nt）是屬于一類非編碼內(nèi)源性RNA，可以通過結(jié)合其靶蛋白的編碼信使RNA（mRNA）的30個非翻譯區(qū)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)［8］。而且，miRNA能夠通過轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)沉默來影響翻譯抑制和mRNA分裂［9］。在胚胎干細(xì)胞自我更新中miRNA同樣起著關(guān)鍵的作用，而且它們對于調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化、骨骼肌發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、壓力和免疫反應(yīng)都有著非常重要的作用［10-11］。一個miRNA可以靶向數(shù)百個基因，同樣，一個基因則可以被多個miRNA靶向調(diào)控，然后有研究報道，miRNA更傾向與靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子［12］。

雖然關(guān)于miRNA調(diào)控成骨轉(zhuǎn)錄分化的研究很多，但是直到目前為止，DFCs中miRNA表達(dá)與成骨轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)之間的關(guān)系仍然未被闡述清楚。為了研究miRNA在DFC成骨分化過程中的作用，本研究采用體外轉(zhuǎn)染和RT-PCR技術(shù)，研究了miRNA101在牙囊細(xì)胞成骨分化期間的差異表達(dá)，首次揭示了miRNA101在人牙囊細(xì)胞成骨分化過程中的關(guān)鍵作用。

1 資料與方法

1.1 儀器和試劑DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；胰蛋白酶（Gibco，美國）；總RNA抽提試劑盒（Giagen GmbH公司，德國）；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitativereal-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）；試劑盒（TaKaRa公司，日本）；超凈工作臺（ESCO，加拿大）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國）；DFCs（ALL Cells，美國）；miRNA101模擬物（Qiagen，Hilden，Germany）；RT-PCR儀（Bio-rad，美國）；引物由軟件primer5設(shè)計，Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)DFCs培養(yǎng)于含10% FBS、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，溫度37℃，CO2含量5%。每兩天換液一次，待細(xì)胞長滿皿底70%～80%時用0.25%胰酶按1：2 傳代，取第3 代細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 成骨分化誘導(dǎo)為了成骨分化，將基本培養(yǎng)基替換為誘導(dǎo)成骨分化的培養(yǎng)基（ODM）。ODM的組成成分為：DMEM、10%FBS、10-7M地塞米松、100mM磷酸抗壞血酸、10mMβ-甘油磷酸和20mM HEPES緩沖液。

1.2.3 轉(zhuǎn)染和RNA分離細(xì)胞以每孔6×104個接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，進(jìn)行miRNA轉(zhuǎn)染實驗。miRNA-101用無血清培養(yǎng)稀釋至5mM，然后加入HiPerfect轉(zhuǎn)染試劑，混合均勻，室溫孵育15～20min（具體操作步驟見試劑盒說明書），亂序siRNA作為對照。然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔板中，于孵箱中培養(yǎng)24h。孵育24h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。實驗終點時用miRNeasy mini Kit提取總RNA。用miScript miRNA PCR Array 試劑盒進(jìn)行PCR分析，具體操作見試劑盒說明書。

1.2.4 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測細(xì)胞以每孔6×104個接種于6孔板，miRNA轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞裂解液，采用LabAssayTM ALP檢測試劑盒檢測細(xì)胞裂解液中的ALP活性。各組細(xì)胞裂解液的ALP活性值均用相應(yīng)的細(xì)胞總蛋白濃度予以校準(zhǔn)，求得各組ALP活性值。

1.2.5 qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)細(xì)胞以每孔1×105個接種于6孔板，轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后48h，采用RNeasy Mini Kit和RNase-Free DNase Set試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成相應(yīng)cDNA，β-actin為內(nèi)參基因。配制real-time PCR 10μL反應(yīng)體系，進(jìn)行qRTPCR定量檢測分析（具體應(yīng)參數(shù)及操作步驟均參考試劑盒使用說明書）。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，行單因素方差分析，以LSD法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨分化對miRNA101表達(dá)的影響ODM培養(yǎng)基誘導(dǎo)DFCs成骨分化第3天和第7天進(jìn)行總RNAs提取和檢測。結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)基相比，ODM培養(yǎng)基誘導(dǎo)第3天時miRNA101的表達(dá)略微升高，沒有顯著性差異。ODM培養(yǎng)基誘導(dǎo)第7天時，miRNA101的表達(dá)顯著升高，實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 誘導(dǎo)DFCs成骨分化對miRNA101表達(dá)的影響（**P<0.01，n=3）

2.2 miRNA101模擬物對成骨分化相關(guān)基因表達(dá)及ALP活性的影響為了探討miRNA101對DCFs成骨分化的影響，本研究用miRNA101模擬物體外轉(zhuǎn)染DFCs細(xì)胞。并用miScript miRNA PCR Array檢測miRNA101表達(dá)情況；LabAssayTM ALP檢測試劑盒檢測ALP活性；qPCR檢測成骨分化相關(guān)基因表達(dá)情況，結(jié)果見圖2、圖3和圖4。由圖2結(jié)果可知，與Control組和siNT組相比，miRNA101模擬物轉(zhuǎn)染過后顯著增加miRNA101的表達(dá)。為探討miRNA101高表達(dá)過后DFCs成骨分化情況，實驗進(jìn)一步檢測了ALP活性及成骨相關(guān)基因OCN和Runx2的表達(dá)情況，結(jié)果見圖3和圖4。由實驗結(jié)果可知，與對照組相比，miRNA101高表達(dá)組的ALP活性顯著增加，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。成骨相關(guān)基因Rnux2和ALP mRNA的表達(dá)也顯著升高，而OCN mRNA的表達(dá)不受miRNA101表達(dá)的影響。實驗結(jié)果提示miRNA101能夠促進(jìn)DFCs細(xì)胞的成骨分化。

圖2 miRNA101模擬物對DFCs的miRNA101表達(dá)的影響（***P<0.001，n=3）

圖3 miRNA101模擬物對DFCs的ALP活性的影響（***P<0.001，n=3）

圖4 miRNA101模擬物對成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響（**P<0.01，n=3）

2.3 miRNA101對成骨轉(zhuǎn)錄因子SATB2表達(dá)的影響為進(jìn)一步探討miRNA101誘導(dǎo)成骨分化的相關(guān)機(jī)制，實驗進(jìn)一步測定了成骨相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)情況。結(jié)果表明miRNA101轉(zhuǎn)染過后成骨轉(zhuǎn)錄因子SATB2的基因表達(dá)顯著增加（見圖5）。實驗結(jié)果表明miRNA101參與DFCs的成骨分化，可能機(jī)制為調(diào)控成骨轉(zhuǎn)錄因子SATB2的表達(dá)。

圖5 miRNA101模擬物對成骨轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響（***P<0.001，n=3）

3 討論

外胚間充質(zhì)干細(xì)胞DFCs的使用對于體外研究牙槽成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化具有非常大的好處，在臨床應(yīng)用中也具有巨大的前景［4］。盡管迄今為止對DFC中成骨分化的信號傳導(dǎo)途徑有了很深入的研究，但是對于miRNA在DFCs成骨分化中的作用仍然難以闡述清楚。研究表明miR144、miR125b和miR-20a在小鼠和人的3T3細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞以及人脂肪組織來源的干細(xì)胞的成骨分化中具有重要的調(diào)節(jié)作用［13-15］。但是關(guān)于miRNA對DFCs成骨分化的作用及其具體機(jī)制尚未有深入研究。

本實驗研究中表明，在長期培養(yǎng)的DFC中，miRNA101的基因表達(dá)顯著增加。而與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基相比，在ODM培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下，miRNA101的表達(dá)進(jìn)一步顯著增加。有研究表明miRNA101能夠抑制在礦化性牙周膜細(xì)胞中差異表達(dá)的PLAP1的表達(dá)，而PLAP-1是公認(rèn)的抑制的牙周韌帶礦化的負(fù)調(diào)節(jié)因子［16］。這些研究表明miRNA101能夠通過影響成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)而參與調(diào)節(jié)成骨分化相關(guān)因子的表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)miRNA101模擬物轉(zhuǎn)染DFCs后顯著增加了成骨分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)及ALP活性。而且miRNA101尤其增加了DFC中SATB2的表達(dá)，SATB2作為成骨分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，對DCFs成骨起到重要調(diào)節(jié)作用［17］。

本研究首次揭示了miRNA101可能通過調(diào)控DCFs中成骨轉(zhuǎn)錄因子SATB2的表達(dá)來調(diào)節(jié)成骨分化。由于SATB2為新近發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能區(qū)域（包括啟動子區(qū)、增強(qiáng)子區(qū)）的具體定位尚不明確，有待進(jìn)一步深入探索。鑒于SATB2 在成骨分化中的核心作用，其具體機(jī)制的進(jìn)一步研究將推動骨形成機(jī)制的闡明及相關(guān)骨代謝疾病的合成治療，具有巨大的市場應(yīng)用前景。

本研究證明了miRNA101具有明顯的促進(jìn)人牙囊細(xì)胞成骨細(xì)胞分化的效果，并且其可能機(jī)制通過調(diào)節(jié)成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SATB2的表達(dá)來調(diào)節(jié)DFCs的成骨分化。