張思琴，敖 翩，陳少勇，柴 溶，王紹軍，韋 力，徐 楊，陳 晨

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院，南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，南寧 530021)

放射療法是一種主要用于頭頸部惡性腫瘤治療的有效方法，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)卻不可避免的會(huì)對(duì)其周圍的正常組織也造成不同程度的損傷[1]?？诟砂Y是其最常見的并發(fā)癥，它會(huì)引起一系列的不良后果，包括齲齒、吞咽困難、味覺障礙、粘膜感染等，嚴(yán)重影響了頭頸部放療患者的生活質(zhì)量[2]。但是，目前臨床上的治療方法仍然是治標(biāo)不治本，未能取得令人滿意的效果。研究表明，輻射會(huì)誘導(dǎo)活性氧自由基的產(chǎn)生，從而引起組織的氧化應(yīng)激損傷和功能障礙[3-4]。因此，尋求一種天然有效無(wú)害的抗氧化藥物具有重要的臨床意義。海帶屬于褐藻綱海帶科的植物，中醫(yī)入藥時(shí)稱作昆布，有軟堅(jiān)化痰、利水泄熱等多種藥用價(jià)值，其多種生物活性主要與多糖成分有關(guān)。有研究報(bào)道，海帶多糖(laminaria japonica polysaccharide，LJP)具有抗腫瘤[5]、降血脂[6]、清除氧自由基和抗炎等[7]多種生物學(xué)功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)LJP對(duì)受照射后小鼠的腦損傷具有保護(hù)作用[8]，因此，本研究擬建立放射性唾液腺損傷的小鼠模型，旨在觀察LJP干預(yù)后唾液腺功能以及下頜下腺中與氧化應(yīng)激有關(guān)的重要基因——沉默信息調(diào)節(jié)因子3(Sirtuin3, Sirt3)和錳超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase, MnSOD)的表達(dá)，探討LJP對(duì)放射性下頜下腺損傷的防護(hù)作用及機(jī)制的研究，以期為未來(lái)防治放射性口干癥提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

將購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)8周齡雌性昆明小鼠，體重(30±2)g，放于12 h光照和12 h黑暗的交替環(huán)境下飼養(yǎng)，正常攝食和飲水，室溫(25±2)℃，濕度45%～55%，定期檢測(cè)環(huán)境衛(wèi)生，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(桂)2014-0002。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵守國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)和使用準(zhǔn)則。

1.1.2主要試劑及儀器

LJP購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：SLBM6723V，純度≥98%)；兔抗MnSOD多克隆抗體(批號(hào)：ab13533)、兔抗Sirt3單克隆抗體(批號(hào)：ab86671)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(批號(hào)：ab6721)、DAB試劑盒(批號(hào)：ab64264)，均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；通用RNA提取試劑盒(批號(hào)：9767)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：R036A)、定量試劑盒(批號(hào)：R820A)，均購(gòu)于大連TaKaRa公司；電子分析天平(北京賽多利斯，型號(hào)：BSA124 S)；60Co遠(yuǎn)距離治療機(jī)(中國(guó)核動(dòng)力研究設(shè)計(jì)院，型號(hào)：CWXJ80)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：DP80)。

1.2 方法

1.2.1LJP準(zhǔn)備

臨用前稱取0.4 g LJP粉劑溶于40 mL 0.9%NaCL中，配制成濃度為1%的LJP溶液，錫箔紙包裹于瓶外，于4 ℃避光保存。

1.2.2動(dòng)物分組及處理

采取隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照組(Control group, Con)、LJP組(LJP group, LJP)、單純照射組(Irradiation alone group, IR)和照射+ LJP組(Irradiation plus LJP group, IR+LJP)，5只/組。給予LJP組和照射+LJP組小鼠腹腔注射LJP[100 mg/(kg·d)][9]，每天一次，于照射前3 d開始持續(xù)到照射后4 d；對(duì)照組和單純照射組小鼠給予等同容積生理鹽水注射。在進(jìn)行60Co γ射線照射之前，先用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)進(jìn)行腹腔注射。參照已發(fā)表的照射方法[10]，將已麻醉的小鼠仰臥位固定于自制的放療定位罩模具中，僅將小鼠頭頸部暴露于照射區(qū)域，照射源與體表距離為80 cm，劑量率1 250 cGy/min，身體其他部分均被12 mm厚的鉛板所保護(hù)。單純照射組和照射+LJP組小鼠接受一次性15 Gy的照射劑量，而對(duì)照組和LJP組小鼠麻醉后置于同樣環(huán)境中，接受0 Gy的照射劑量。

1.2.3唾液收集

于照射結(jié)束后28 d將各組麻醉的小鼠給予0.02%毛果蕓香堿(0.2 mg/kg)頸部皮下注射，注射完成后立即將3～5個(gè)預(yù)先稱重的小棉球放入小鼠口內(nèi)舌下，15 min后用鑷子立即將小棉球從口內(nèi)取出，放于歸零的精密天平稱重，并計(jì)算出唾液分泌的總重量。最后，將所得的每只小鼠唾液分泌量按照其體重進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2.4HE及免疫組化染色

將唾液采集完成的小鼠進(jìn)行安樂(lè)死并收集下頜下腺組織(Submandibular gland, SMG)。將取下的頜下腺組織固定在10%中性福爾馬林中，24 h后進(jìn)行石蠟包埋。將蠟塊切成5 μm厚的組織切片用于HE和免疫組化染色。

將檸檬酸鹽緩沖液(pH值為6.0)修復(fù)(98 ℃水浴5 min)后的切片用PBS清洗(5 min×3 次)，再用5%牛血清室溫封閉20 min后，給予一抗Sirt3和MnSOD(稀釋濃度均為1∶150)，4 ℃過(guò)夜，第2 d用PBS洗5 min×4 次后，滴加山羊抗兔二抗(1∶500)，室溫孵育 1.5 h，DAB顯色。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照其說(shuō)明書步驟提取下頜下腺組織的總RNA，然后將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在冰上配置實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)體系的總體積為25 μL，其中引物由TaKaRa生物公司合成，序列見表1。使用Applied Biosystems Step One實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，設(shè)置如下反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s一個(gè)循環(huán)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s, 共40次循環(huán)。用2-△△Ct的方法計(jì)算Sirt3和MnSOD基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0軟件分別對(duì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和制圖，以均值±單次測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用One-Way ANOVA，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，用SNK法進(jìn)行分析；若不齊，則采用Dunnet’t3法進(jìn)行分析，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠唾液流量的比較

結(jié)果示于圖1。由圖1可見，與對(duì)照組比較，單純照射組小鼠唾液流量降低(p<0.05)；與單純照射組比較，LJP組及照射+LJP組唾液流量均明顯升高(p<0.05)。

注：*與對(duì)照組比較，p<0.05；▲與單純照射組比較, p<0.05。

2.2 下頜下腺組織鏡下觀察

圖2為各組小鼠下頜下腺組織鏡下觀察結(jié)果。由圖2可見，對(duì)照組小鼠下頜下腺鏡下顯示其導(dǎo)管腺泡結(jié)構(gòu)正常，排列整齊；單純照射組下頜下腺鏡下顯示腺泡導(dǎo)管結(jié)構(gòu)損傷破壞，不完整，可見空泡化，而給予LJP干預(yù)后照射小鼠頜下腺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯改善。

注：A為對(duì)照組；B為L(zhǎng)JP組；C為單純照射組；D為照射+LJP組；Bar = 50 μm。

2.3 下頜下腺中Sirt3和MnSOD的表達(dá)及分布

圖3為各組小鼠下頜下腺中Sirt3和MnSOD的表達(dá)及分布結(jié)果，圖4為各組小鼠Sirt3和MnSOD陽(yáng)性表達(dá)平均光密度值比較與對(duì)照組比較結(jié)果。由圖3、圖4可見，單純照射組下頜下腺Sirt3和MnSOD陽(yáng)性表達(dá)明顯降低(p<0.05)；與單純照射組比較，LJP組及照射+LJP組Sirt3和MnSOD陽(yáng)性表達(dá)均明顯升高(p<0.05)。

注：A1, A2為對(duì)照組；B1, B2為L(zhǎng)JP組；C1, C2為單純照射組；D1, D2為照射+LJP組；Bar = 50 μm。

注：A為各組小鼠Sirt3平均光密度值比較；B為各組小鼠MnSOD 平均光密度值比較；*與對(duì)照組比較，p<0.05；▲與單純照射組比較，p<0.05。

2.4 下頜下腺Sirt3和MnSOD mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖5為各組小鼠Sirt3和MnSOD mRNA相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果。由圖5可見，與對(duì)照組比較，單純照射組下頜下腺Sirt3和MnSOD mRNA表達(dá)量明顯降低(p<0.05)；與單純照射組比較，LJP組及照射+LJP組Sirt3和MnSOD mRNA表達(dá)量均明顯升高(p<0.05)。

注：A為各組小鼠Sirt3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較；B為各組小鼠MnSOD mRNA相對(duì)表達(dá)量比較；*與對(duì)照組比較，p< 0.05；▲與單純照射組比較，p<0.05。

3 討論

電離輻射可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)活性氧(reactive oxygen species, ROS)自由基的產(chǎn)生，包括超氧自由基、羥自由基、過(guò)氧化氫等[11]。這些自由基會(huì)破壞組織細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和死亡。因此，若能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)則可以減輕放射治療中所引起的各種不良反應(yīng)[12]。有研究表明Sirt3和MnSOD可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中ROS水平，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活[13]。Sirt3主要位于線粒體中，在改善氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙中起關(guān)鍵作用，并且有研究顯示Sirt3可調(diào)節(jié)MnSOD和8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶的乙?；饔茫瑢⒂泻Φ某趸镒杂苫D(zhuǎn)化為無(wú)毒的氧氣，而這對(duì)于維持細(xì)胞線粒體DNA的完整性和減輕細(xì)胞凋亡至關(guān)重要[14]。有研究發(fā)現(xiàn)Sirt3基因敲除小鼠體內(nèi)許多器官中會(huì)自發(fā)形成纖維化，部分原因是糖原合酶激酶-β的乙?；黾樱瑥亩鴮?dǎo)致TGF-β1合成增加[15]。線粒體抗氧化劑MnSOD由基因組DNA編碼，其線粒體中的歧化酶功能被完全激活，以解毒線粒體呼吸產(chǎn)生的氧自由基。一項(xiàng)關(guān)于成年果蠅的研究發(fā)現(xiàn)MnSOD過(guò)表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)許多細(xì)胞信號(hào)通路激活[16],而MnSOD對(duì)多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)可能會(huì)增強(qiáng)正常細(xì)胞對(duì)輻射的耐受性[17]，這也表明了MnSOD介導(dǎo)的輻射防護(hù)機(jī)制可能是新的治療靶點(diǎn)。此外，也有研究通過(guò)Nrf2/Sirt3/MnSOD信號(hào)傳導(dǎo)，保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞免受高葡萄糖誘導(dǎo)的線粒體ROS產(chǎn)生和自噬細(xì)胞死亡[18]。

海帶多糖因其低毒并具有多種藥理作用，近年來(lái)開始受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本研究顯示在給予LJP干預(yù)后的照射小鼠唾液流量減少以及下頜下腺腺泡導(dǎo)管結(jié)構(gòu)破壞均有明顯的改善，這說(shuō)明LJP可以保護(hù)照射后的唾液腺功能損傷。前期研究報(bào)道LJP可以抑制放療后下頜下腺細(xì)胞的凋亡[19]和血管的損傷[20]，然而其分子機(jī)制尚不清楚。此外，已有研究證明從海帶中提取的多糖具有很好的抗氧化功效，因此，推測(cè)LJP可能通過(guò)抑制輻射過(guò)程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)保護(hù)輻射誘導(dǎo)的下頜下腺功能損傷。為了探討其保護(hù)作用可能的分子機(jī)制，進(jìn)一步觀察了下頜下腺組織中與抗氧化應(yīng)激有關(guān)的重要分子Sirt3/MnSOD的表達(dá)。在本研究中免疫組化和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，單純照射組小鼠下頜下腺組織中Sirt3和MnSOD表達(dá)明顯降低，而給予LJP干預(yù)后兩者的表達(dá)明顯升高，這提示LJP可能通過(guò)上調(diào)Sirt3和MnSOD表達(dá)發(fā)揮抗氧化的作用[21]。HU等[22]在衰老小鼠皮膚模型中也發(fā)現(xiàn)LJP可以增強(qiáng)其皮膚組織中各種抗氧化酶(如超氧化物歧化酶，過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等)的表達(dá)來(lái)抑制衰老過(guò)程中ROS的產(chǎn)生，從而延緩小鼠固有皮膚的衰老，再次表明了LJP是一種有效的抗氧化劑。

綜上，筆者推測(cè)LJP可能通過(guò)激活氧化應(yīng)激相關(guān)Sirt3/MnSOD信號(hào)通路有效地抑制了輻射誘導(dǎo)的下頜下腺的損傷。在本次研究中，探討了抗氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路Sirt3/MnSOD在下頜下腺組織輻射損傷中的表達(dá)和分布以及LJP干預(yù)后對(duì)其表達(dá)的影響。這為今后LJP用于臨床上治療頭頸癌放療患者口干提供了新的理論依據(jù)和分子治療靶點(diǎn)。但是，此研究未進(jìn)行細(xì)胞層面上信號(hào)通路的驗(yàn)證，下一步將完善相關(guān)的體外實(shí)驗(yàn)。