閻長鑫，劉玉連，焦 玲，張文藝

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津 300192)

隨著核能利用的增加，核與輻射帶來的潛在危害也在增長。在事故發(fā)生時(shí)快速、有效的回顧性劑量測定也就變得更加重要[1]。電子順磁共振[2-3](electron paramagnetic resonance，EPR)譜是評估吸收劑量方法之一，它是基于對輻射引起的生物或物理效應(yīng)的分析。這些效應(yīng)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的自由基，這些自由基的濃度取決于吸收劑量。人體中的牙齒、骨骼和指甲經(jīng)過輻照后都會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的自由基。其中牙齒和骨骼中的碳酸羥基磷灰石因輻射產(chǎn)生的自由基十分穩(wěn)定，長達(dá)107a之久。但牙齒與骨骼的處理較復(fù)雜，且會(huì)對取材者造成一定的傷害，所以研究者一直在尋找可以替代牙齒、骨骼的材料。指甲作為非侵入、收集方便的一種生物材料，得到研究者的關(guān)注[4]。

指甲中含有大量的α角蛋白[5]，當(dāng)受到電離輻射的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生自由基，EPR圖譜中，指甲中自由基的含量(濃度)可由圖譜二次積分(所圍面積)來表示，即自由基濃度越高，圖譜所圍成的面積越大，因此可以利用兩者的關(guān)系來進(jìn)行劑量估算[6]。

指甲受到電離輻射后，會(huì)產(chǎn)生輻射誘發(fā)信號(hào)(radiation-induced signals，RIS)，根據(jù)其產(chǎn)生原理不同分別將其命名為RIS1～RIS5。人體的受照劑量一般不會(huì)超過50 Gy，因此我們只對兩個(gè)較低劑量區(qū)的RIS感興趣，RIS2與RIS5。但是并非只有電離輻射會(huì)在指甲中產(chǎn)生自由基，Chandra H等[7]發(fā)現(xiàn)剪切后的指甲EPR圖譜顯示：“剪切”產(chǎn)生了信號(hào)，并將其命名為機(jī)械誘發(fā)信號(hào)(mechanically-induced signals,MIS)，即剪切信號(hào)。由于部分MIS信號(hào)與RIS信號(hào)位置相同(g值一樣)或是在其附近，在EPR圖譜中會(huì)重疊在一起。對于利用RIS信號(hào)進(jìn)行劑量估算來說，MIS是一個(gè)干擾信號(hào)，應(yīng)將MIS信號(hào)除去。除了上述RIS與MIS信號(hào)外，其他信號(hào)被稱為本底信號(hào)(background signal,BKG)。完成估算的重點(diǎn)在于將RIS從重疊在一起的信號(hào)中分離出來，與劑量建立關(guān)系，映射到坐標(biāo)軸上建立劑量回歸曲線。Romanyukha 等[8]比較了各種去除MIS的化學(xué)方法，相比之下，D，L-二硫蘇糖醇處理效果比較好。王宏力等人[9]比較了靜置法、浸泡法、毛刷法和濾紙法，提出用潮濕濾紙包裹指甲去除MIS效果最佳。趙徵鑫等[10]給出了劑量重建中誤差來源的分析，張騰達(dá)等[11]給出了定量測量理論，為劑量定量分析和劑量回歸曲線的建立提供了基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的估算方法是將照射已知?jiǎng)┝縀PR譜線減去未照射劑量EPR譜線(0 Gy)，達(dá)到去除本底的目的，將其差值作為受照劑量譜線，并對譜線的峰峰值進(jìn)行計(jì)算，將其對質(zhì)量與標(biāo)樣(g-marker)峰峰值做歸一化處理，此方法稱為譜減法。本研究提出擬合法即通過數(shù)學(xué)模擬的方法解譜以去除本底來降低誤差，這種研究方法將輻照后指甲EPR信號(hào)視為由BKG與RIS兩種信號(hào)疊加，利用數(shù)學(xué)模型來模擬BKG與RIS得到兩個(gè)模型函數(shù)，這兩個(gè)模型函數(shù)通過線性組合來擬合EPR信號(hào)。本研究同時(shí)對RIS不同組成進(jìn)行了模擬，包括RIS2+RIS5和只有RIS5的兩種情況。對于每一個(gè)受到已知?jiǎng)┝空丈涞闹讣譋PR譜，通過擬合計(jì)算出BKG與RIS在受照波譜中的面積占比，其中RIS面積占比用來表征吸收劑量，即從受照波譜中去除了BKG，建立劑量與RIS面積占比的回歸曲線。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)所用指甲樣品3組來自天津市(2男，1女，年齡20～55歲之間)，對其編號(hào)為A、B、C；2組來自河北省(每組約10人混合指甲，平均年齡40歲)，編號(hào)為D、D-RIS5。使用同一把指甲刀進(jìn)行剪切，剪切后儲(chǔ)存在-18 ℃冰箱中或立即處理。

1.2 樣品處理

(1)實(shí)驗(yàn)1——RIS2+RIS5的EPR波譜分析實(shí)驗(yàn)

對收集的4組樣品(A、B、C、D)進(jìn)行剪切，尺寸為2 mm×2 mm，同一個(gè)人的十個(gè)手指的指甲隨機(jī)分成8份，每一份約20 mg，剪切后全部混合以20 mg為標(biāo)準(zhǔn)取8份，其余樣品放于冰箱保存留用于其他實(shí)驗(yàn)。因?yàn)闈駷V紙包裹后，會(huì)出現(xiàn)指甲粘在濾紙上的現(xiàn)象，不方便轉(zhuǎn)移，本文直接在小燒杯中用蒸餾水對樣品浸泡10 min，去除剪切信號(hào)(MIS)，使用真空干燥箱(予華 DZF-6050型)對其進(jìn)行干燥，條件70 ℃，-0.1 MPa,干燥1 h，用于去除由于浸泡指甲所引入的水，并對水處理后的樣品進(jìn)行稱重處理，稱重后對每組7份樣品進(jìn)行照射，每組預(yù)留一組作為本底對照(記為0 Gy)，照射后記錄其EPR波譜。

(2)實(shí)驗(yàn)2——RIS5的EPR波譜分析實(shí)驗(yàn)

收集10人混合指甲，編號(hào)D-RIS5，以每份30 mg，分為13份，12份進(jìn)行照射,剩余一組作為本底(0 Gy)，照射后將13份樣品進(jìn)行剪切，尺寸2 mm×2 mm，蒸餾水浸泡10 min,真空干燥1 h,樣品處理后進(jìn)行EPR測量，模擬真實(shí)照射事故場景下的劑量分析(即：照射后再剪碎)。

1.3 樣品照射

將樣品放入透明自封袋中用137Cs源根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求在室溫下進(jìn)行照射。放射源使用的是加拿大Gammacell-40型137Cs伽馬射線源(劑量率為0.88 Gy/min)，均勻照射，放射源有出廠標(biāo)定且每年進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。對于實(shí)驗(yàn)1中A、B、C、D中每組7份樣品分別照射1，2，3，5，8，10，50 Gy。對于實(shí)驗(yàn)2的D-RIS5組12份樣品分別照射5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60 Gy。

1.4 樣品EPR測量

本次研究采用的儀器是德國布魯克公司生產(chǎn)的X波段的電子順磁共振波譜儀(型號(hào)為A300)。定量研究采用ER 4119HS-2100 marker accessory作為標(biāo)樣，以相對信號(hào)面積進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)具體條件：中心磁場3 530 G，掃場寬度150 G，調(diào)制頻率100 kHz，調(diào)制幅度5 G，時(shí)間常數(shù)40.96 ms，掃描次數(shù)10，微波功率1.01 mW，掃場時(shí)間83.89 s，實(shí)驗(yàn)溫度24 ℃左右，相對濕度40%。

1.5 模擬方法

用于模擬的基本函數(shù)為高斯函數(shù)的一階微分：

式中，A為峰峰值的一半；X0為函數(shù)中心(磁場中心，可通過,g=0.714 477 36×v(MHz)/X0轉(zhuǎn)換為g值,其中v為頻率)；Hpp為線寬；X為譜圖橫坐標(biāo)即磁場值，單位均為G。模擬時(shí)通過原圖譜提供A、X0、Hpp初始值用于后續(xù)迭代，三個(gè)數(shù)值越接近原譜線真實(shí)值迭代次數(shù)越小，所用時(shí)間越少。

用該函數(shù)來分別模擬預(yù)留本底(0 Gy)與50 Gy(對于實(shí)驗(yàn)2為60 Gy)的高劑量圖譜，預(yù)留本底(0 Gy)模擬結(jié)果作為純凈本底的模型函數(shù)記為LBKG，50 Gy模擬結(jié)果作為只有RIS信號(hào)的模型函數(shù)記為LRIS，LRIS的模擬選用高劑量的原因是因?yàn)樵诟邉┝織l件下可忽略本底影響而將其模擬結(jié)果作為純RIS模型函數(shù)，此處出于人體實(shí)際受照情況選用50 Gy(實(shí)驗(yàn)2為60 Gy)。得出兩個(gè)模型函數(shù)后，對于受到已知照射劑量譜圖都可通過LBKG與LRIS的線性疊加表示，即F=A0×LBKG+B0×LRIS，其中F為已知?jiǎng)┝繄D譜函數(shù)，A0，B0分別為LBKG和LRIS的面積貢獻(xiàn)。對于吸收譜線(高斯函數(shù))的面積計(jì)算可通過高斯函數(shù)一次微分中參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，Dy為峰峰值(波峰縱坐標(biāo)與波谷縱坐標(biāo)的差值)，S為吸收譜線的面積：

S∝Dy×Hpp2

1.6 模擬流程

利用布魯克Acquisit軟件獲取樣品EPR圖譜，測得圖譜以ASC文件導(dǎo)出。在Windows 10 平臺(tái)利用免費(fèi)的Visual Studio 2019社區(qū)版作為開發(fā)IDE處理ASC文件，程序語言選用C++。畫圖利用平臺(tái)調(diào)用Python的matplotlib[12]。

模擬流程如圖1所示。將實(shí)驗(yàn)得到的圖譜保存為ASC文件，將文件導(dǎo)入程序，程序先對未照射樣品(0 Gy)圖譜進(jìn)行模擬，先提取圖譜的特征部分，包括信號(hào)的峰-峰值(Dy)，線寬(Hpp)，以g=2.005，Dy，Hpp為非線性最小二乘(Levenberg-Marquardt)的輸入，通過高斯函數(shù)的一階微分對未照射樣品的波譜進(jìn)行模擬，得到LBKG(理論本底波譜)；以同樣方式模擬高劑量波譜(實(shí)驗(yàn)1為50 Gy,實(shí)驗(yàn)2為60 Gy)，得到理論高劑量波譜(LRIS)，將兩個(gè)理論波譜進(jìn)行保存，為之后的模擬做準(zhǔn)備。

圖1 模擬流程圖

將每組樣品中除0 Gy與50 Gy(實(shí)驗(yàn)2為60 Gy)的圖譜分別導(dǎo)入程序中，對于每個(gè)波譜提取波譜頻率、g-marker(標(biāo)樣)的面積(SM)、樣品質(zhì)量(m)和樣品劑量(后兩項(xiàng)存儲(chǔ)在圖譜文件名中)，并在組內(nèi)按照劑量從小到大進(jìn)行排序，按照每個(gè)波譜的頻率在g=2.005的位置產(chǎn)生之前保存好的LBKG，LRIS，并利用公式F=A0×LBKG+B0×LRIS對其進(jìn)行非線性最小二乘擬合。B0乘吸收譜線面積(Ss)對質(zhì)量和SM進(jìn)行歸一化處理得到B1，將劑量作為橫坐標(biāo)，B1作為縱坐標(biāo)做線性擬合，其流程如圖1所示。對于每一組樣品分別利用組內(nèi)0 Gy與高劑量得到組內(nèi)LBKG與LRIS，以消除個(gè)體差異。

為了得到較為純凈的LRIS，本實(shí)驗(yàn)在選用較高劑量的同時(shí)，在構(gòu)建LRIS之后，再從LRIS中扣除LBKG，因此高劑量純凈波譜是由模擬得到的LRIS與LBKG模型函數(shù)的差值，作為新的LRIS，記為L′RIS，即L′RIS=LRIS-LBKG。

2 實(shí)驗(yàn)及模擬結(jié)果

指甲經(jīng)過離體剪切和剪碎過程(方便裝入內(nèi)徑4 mm石英管中)中會(huì)產(chǎn)生MIS，而實(shí)驗(yàn)研究表明水處理會(huì)消除MIS[13]。經(jīng)過水處理干燥后未照射(0 Gy)的樣品作為本底信號(hào)BKG,模擬效果最優(yōu)的波譜作為LBKG，其EPR圖譜與模擬如圖2(a)所示。經(jīng)過水處理干燥后照射50 Gy，得到高劑量波譜。50 Gy圖譜模擬及其模型函數(shù)LRIS如圖2(b)所示，圖2為示例組模擬圖，實(shí)驗(yàn)組BKG與RIS的模擬參數(shù)列于表1。判斷模擬精度的標(biāo)準(zhǔn)為殘譜(實(shí)驗(yàn)譜與模擬譜的差值)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，從表1中可以看出對于B組BKG殘譜平均值占圖譜峰峰值的0.050 1%，RIS2+RIS5殘譜平均值占峰峰值0.006 90%。殘譜平均值所占比例比較小，其標(biāo)準(zhǔn)偏差只有少數(shù)超過圖譜峰峰值的10%。因?yàn)闅堊V數(shù)值有正有負(fù)，取平均值會(huì)相互抵消，因此殘譜平均值較小，但標(biāo)準(zhǔn)差不會(huì)抵消，數(shù)值較大。在模擬兩個(gè)模型函數(shù)時(shí)，擬合感興趣區(qū)域在信號(hào)部分，意在得到信號(hào)部分的線型，即得到信號(hào)部分峰峰值與信號(hào)部分的線寬，因此得到的殘譜與實(shí)驗(yàn)譜g-marker重合，為了消除殘譜平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算時(shí)g-marker的影響，將感興趣區(qū)域取在3 490～3 530 G之間。

圖2 示例組單人樣品的BKG與RIS(50 Gy)的EPR測量及模擬圖譜

表1 EPR波譜擬合參數(shù)

利用對應(yīng)組產(chǎn)生的LBKG與LRIS作為F=A0×LBKG+B0×LRIS中的輸入，對導(dǎo)入的實(shí)驗(yàn)波譜進(jìn)行擬合，A組擬合結(jié)果如圖3所示。A組中利用B1(B1=B0×Ss/(Sm×m))與照射劑量做劑量回歸曲線(圖4)，回歸方程為y= 0.004 59x+0.035 6，R2=0.941 432，擬合誤差=0.719 Gy。其他4組的擬合結(jié)果列于表2，從表2可以看出，同一個(gè)人的指甲所做的樣品線性度較好(R2>0.9)，擬合誤差在1 Gy以下(A、B、C組)，而對于10人混合樣品，線性度相對一人組樣品線性度稍差，擬合誤差在1 Gy左右(D組)。表2中D-RIS5組為實(shí)驗(yàn)2的結(jié)果，從中可以看出擬合法線性度與擬合誤差都優(yōu)于譜減法。表3給出兩種方法的A、B、C、D四組各劑量值下的相對偏差，給出數(shù)據(jù)中大部分?jǐn)M合法的劑量準(zhǔn)度優(yōu)于譜減法，只有6個(gè)點(diǎn)譜減法相對擬合法相對偏差更小，總體來說擬合法估算值與照射值之間偏差小于譜減法。

圖3 A組2Gy擬合圖譜

圖4 A組劑量回歸曲線

表2 EPR波譜擬合結(jié)果

表3 擬合法和譜減法與照射劑量的相對偏差1)

3 討論

在2008年突尼斯，2010年加蓬，2012年秘魯?shù)?92Ir事故[14]中，研究人員利用指甲作為生物材料對事故進(jìn)行了劑量估算，事故中利用RIS5完成了回顧性劑量測定。Romanyukha[15]利用健康人的指甲建立“通用”劑量回歸曲線，這種方法利用Reyes[16]提出在保證樣品尺寸與含水量相同的條件下，樣品的劑量響應(yīng)很類似，這也為快速劑量估算提供了方法。上述方法都是利用的譜減法進(jìn)行估算，并沒有從波譜分解上對圖譜進(jìn)行解析。而本研究通過控制水處理與照射先后順序，分別對RIS2+RIS5與RIS5從圖譜組成上進(jìn)行了模擬，實(shí)驗(yàn)1在水處理之后進(jìn)行照射，所得輻射信號(hào)為RIS2+RIS5，而實(shí)驗(yàn)2經(jīng)過照射后水處理會(huì)去除RIS2[17]，水處理操作后輻射信號(hào)只有RIS5，即所測得的圖譜信號(hào)是本底與RIS5的疊加[18]。

在實(shí)驗(yàn)中，每一次測量的圖譜g值有輕微浮動(dòng)，同時(shí)部分波譜也會(huì)出現(xiàn)上下浮動(dòng)的情況，因此實(shí)驗(yàn)中將擬合所用的高斯公式進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)，對高斯公式加入了垂直移動(dòng)分量與水平移動(dòng)分量，使擬合結(jié)果更加完善。而對于D-RIS5的估算，預(yù)測誤差相對其他較大，在照射相差5 Gy時(shí)才能明顯看到譜圖差別，在以后的研究過程中也會(huì)探究提高探測精度的方法，為輻射事故作出更好的分型分度。同時(shí)由于指甲樣品在磁場方向上的各項(xiàng)異性原因，可考慮將樣品分3個(gè)角度進(jìn)行測量，測量后取平均值來消除各向異性的影響。對于多人D-RIS5組擬合法與譜減法的劑量估算準(zhǔn)確性列于表4，擬合法只有少數(shù)劑量點(diǎn)優(yōu)于譜減法，分析其原因可能是由于60 Gy與0 Gy信號(hào)區(qū)分度并不是很大，60 Gy峰峰值約是0 Gy的2倍，扣除后近似1∶1進(jìn)行擬合，所以擬合效果沒有其余4組好。雖然可以繼續(xù)提高RIS5的照射劑量，但是文獻(xiàn)[17]指出RIS5在28 Gy到60 Gy之間存在飽和,繼續(xù)增加劑量譜線將成下降趨勢，更加難分辨RIS5與本底。

表4 D-RIS5組擬合法和譜減法與照射劑量的相對偏差

4 總結(jié)

本研究編程實(shí)現(xiàn)擬合法，先對兩個(gè)預(yù)設(shè)譜圖進(jìn)行模擬，模擬過程中先對目標(biāo)譜圖進(jìn)行特征提取，包括g值、峰峰值、線寬、頻率和質(zhì)量，提取后根據(jù)峰峰值、線寬對目標(biāo)進(jìn)行非線性最小二乘模擬，在殘譜最小時(shí)，保存模擬得到的譜圖函數(shù)(兩個(gè)函數(shù)∶本底與高劑量)，利用模擬的兩個(gè)函數(shù)通過線性疊加擬合已知?jiǎng)┝繄D譜，計(jì)算出高劑量函數(shù)在其中占比，再將占比乘高劑量函數(shù)面積，之后對其分別進(jìn)行質(zhì)量、g-marker面積歸一化，并與劑量進(jìn)行線性最小二乘擬合得出劑量回歸曲線及參數(shù)。

將EPR圖譜重疊部分進(jìn)行分解一直都是波譜解析的難題，本實(shí)驗(yàn)利用編程實(shí)現(xiàn)了對水處理后指甲信號(hào)的解析，相對于傳統(tǒng)的譜減法，本實(shí)驗(yàn)方法從波譜組成上進(jìn)行了解析，同時(shí)利用面積代替?zhèn)鹘y(tǒng)的峰峰值，減小因線寬變化所帶來的誤差，同時(shí)編程也大大縮短了計(jì)算所用的時(shí)間，節(jié)省人力。Trompier[19]指出RIS5+RIS2與劑量的線性度高達(dá)125 Gy，在本實(shí)驗(yàn)中利用RIS總(RIS2+RIS5)進(jìn)行估算時(shí),在0～10 Gy范圍內(nèi)，個(gè)人樣品R2大于0.9，擬合誤差最低在0.6 Gy，多人組樣品R2接近0.9，相對誤差總體優(yōu)于譜減法。對于利用RIS5在0～60 Gy進(jìn)行劑量回歸的R2大于0.9，擬合誤差4.78 Gy。

綜上，本文通過編程以高斯函數(shù)一階微分作為模型，Levenberg-Marquardt作為算法從譜線組成上對圖譜進(jìn)行解析，分解出其中輻射誘發(fā)部分與已知?jiǎng)┝啃纬勺鴺?biāo)對投射到坐標(biāo)系中完成劑量估算。相對于傳統(tǒng)關(guān)心圖譜峰值的譜減法，擬合法將圖譜線型考慮在其中，對于RIS2+RIS5擬合相比于譜減法，精度與準(zhǔn)確度較好，為指甲EPR圖譜去除本底之后做劑量估算提供了一種方法。