馮淦熠 楊浩然 項(xiàng) 軒 殷 磊 賀 喜 曹 蓉*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長(zhǎng)沙410128； 2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長(zhǎng)沙410125)

桑葉是桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥葉，具有良好的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。桑葉中含有豐富的維生素、礦物質(zhì)以及生物堿、黃酮、多糖和多酚等活性成分，具有降血糖、降血脂、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒和抑菌等功效。其中，多酚類物質(zhì)作為構(gòu)成桑葉抗氧化能力的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，近年來研究主要集中在其最優(yōu)提取工藝和體內(nèi)抗氧化作用等方面，而對(duì)桑葉體外抗氧化作用與其所含多酚類物質(zhì)之間的量效關(guān)系的研究甚少。因此，本試驗(yàn)測(cè)定了在不同濃度(60%、70%、80%)的乙醇提取條件下桑葉多酚的絕對(duì)量和含量，分析了各組之間的差異情況；并選定其中桑葉多酚的絕對(duì)量和含量最高的60%乙醇提取組，經(jīng)過不同倍數(shù)的稀釋處理后再次測(cè)定其多酚的絕對(duì)量、含量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除率，并以水溶性維生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)為陽(yáng)性對(duì)照，以半抑制濃度(IC50)為參考依據(jù)，分析了各乙醇提取組的不同稀釋水平之間體外抗氧化能力的差異情況，將多酚絕對(duì)量與IC50進(jìn)行了相關(guān)性分析，并構(gòu)建擬合方程，為揭示桑葉多酚含量與其體外抗氧化能力之間的量效關(guān)系提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桑葉采摘于國(guó)家中藥材(湖南)生產(chǎn)技術(shù)中心。新鮮桑葉樣品經(jīng)65 ℃烘干至恒重，粉碎后過60目篩后備用。

主要試劑：DPPH、福林酚(Folin-ciocalteu)試劑、沒食子酸(分析純)、乙醇(分析純)、冰醋酸(分析純)、醋酸鈉(分析純)、Trolox、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。

主要儀器：HC-100T型多功能粉碎機(jī)(廣東河城工貿(mào)有限公司)、FA1004B型分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)、SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器(江蘇省常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)、MH-1500S型超聲波清洗器(湖南米函儀器科技有限公司)、帝肯Infinite F50型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)、85-2型恒溫磁力攪拌器(江蘇省常州市國(guó)華儀器制造有限公司)、PH-10/100型筆式酸度計(jì)(上海邦西儀器科技有限公司)。

1.2 桑葉多酚提取液的制備

準(zhǔn)確稱取1.0 g桑葉粉碎樣品18份，分為3組，每組6份，分別溶解于25 mL 60%、70%、80%的乙醇溶液中，在70 ℃恒溫水浴鍋加熱30 min后，經(jīng)功率為240 W的超聲波提取10 min，迅速趁熱過濾，合并濾液，最終共計(jì)得到18份桑葉多酚提取液，儲(chǔ)藏于4 ℃冰箱中備用。

1.3 桑葉多酚絕對(duì)量及含量的測(cè)定

試驗(yàn)參考Folin-ciocalteu法測(cè)定并加以改進(jìn)。以沒食子酸為標(biāo)樣，在可見光區(qū)595 nm處測(cè)定吸光度，不同濃度(60%、70%、80%)的乙醇提取組各設(shè)3個(gè)重復(fù)樣品孔。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，所測(cè)吸光度為縱坐標(biāo)，測(cè)定桑葉多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.219 7X+0.008 6 (R2=0.993 8)(圖1)。桑葉多酚絕對(duì)量和含量計(jì)算公式為：

圖1 桑葉多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

桑葉多酚絕對(duì)量(mg/mL)=(A1-A2- 0.008 6)/1.219 7； 桑葉多酚含量(mg/g)=桑葉多酚絕對(duì)量×V/M。

式中：A1為10 μL桑葉多酚提取液+200 μL 2% Na2CO3+10 μL 50% Folin-ciocalteu試劑混合液的吸光度；A2為220 μL純水的吸光度；M為所稱取的桑葉樣品質(zhì)量(g)；V為每份桑葉多酚提取液的總體積(mL)。

1.4 桑葉多酚提取液的稀釋

選取桑葉多酚含量最高組的桑葉多酚提取液，將其進(jìn)行逐級(jí)稀釋，分別稀釋至原來的25%、50%、75%后，參照1.3所述方法測(cè)定各稀釋組的桑葉多酚絕對(duì)量和含量。

1.5 DPPH自由基清除率的測(cè)定

試驗(yàn)參考符晨星等的方法測(cè)定，并加以改進(jìn)。預(yù)先配制25 mL 0.1 mol/L醋酸和200 mL 0.1 mol/L醋酸鈉，將兩者混勻后，調(diào)節(jié)pH至5.5，制成0.1 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液；將0.1 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液與70%的乙醇溶液按10∶9的體積比混合均勻，制成試驗(yàn)Buffer液；配制0.2 mg/mL DPPH乙醇溶液。

稱取5 mg Trolox粉末，溶解于1 mL DMSO中，隨后稀釋成試驗(yàn)所需的5個(gè)濃度，分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL。以不同濃度的Trolox溶液及其相應(yīng)的清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定，Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-0.755 6X+0.584 2 (R2=0.994 0)(圖2)。以Trolox清除DPPH自由基的能力為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)桑葉多酚提取液的體外抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。DPPH自由基清除率計(jì)算公式為：

圖2 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線

DPPH自由基清除率(%)=1-[(1- A2-A3)/(A4-A3)]。

式中：A1為5μL桑葉多酚提取液+5μL純水+190μL試驗(yàn)Buffer+50μLDPPH混合液的吸光度；A2為10μL桑葉多酚提取液+240μL純水混合液的吸光度；A3為250μL純水的吸光度；A4為200μLBuffer+50μLDPPH混合液的吸光度。

將不同混合液溶解于96孔板中，混合均勻。室溫避光孵育30min后，于517nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，不同濃度的乙醇提取組各設(shè)3個(gè)重復(fù)樣品孔。

1.6 桑葉多酚提取液的稀釋

對(duì)各組桑葉多酚提取液進(jìn)行稀釋處理，分別將桑葉多酚提取液稀釋2、4、8、16倍，參照1.5所述方法測(cè)定各稀釋組的DPPH自由基清除率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件中的ANOVA過程進(jìn)行單因子方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，差異顯著時(shí)用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)桑葉多酚絕對(duì)量和含量的影響

如表1所示，60%乙醇提取組的桑葉多酚絕對(duì)量和含量最高，但各提取組之間無顯著差異(P>0.05)。

表1 乙醇濃度對(duì)桑葉多酚絕對(duì)量和含量的影響

2.2 稀釋處理對(duì)桑葉多酚絕對(duì)量和含量的影響

選取多酚絕對(duì)量和含量最高的60%乙醇提取組，將該組的桑葉多酚提取液分別稀釋至原液的25%、50%、75%，再次測(cè)定各稀釋組的桑葉多酚絕對(duì)量和含量。如表2所示，隨著稀釋程度的增加，桑葉多酚絕對(duì)量和含量逐漸降低，各稀釋組之間差異極顯著(P<0.01)。

表2 稀釋處理對(duì)桑葉多酚絕對(duì)量和含量的影響

2.3 各乙醇提取組在不同稀釋處理下的DPPH自由基清除率

如表3所示，將桑葉多酚提取液稀釋2、4、8、16倍后，各提取組的DPPH自由基清除率均隨稀釋水平的增加而降低；在60%乙醇提取組中，2倍稀釋組的DPPH自由基清除率極顯著高于其他各組(P<0.01)；4倍稀釋組的DPPH自由基清除率顯著高于8倍稀釋組(P<0.05)，極顯著高于16倍稀釋組(P<0.01)。

表3 各乙醇提取組在不同稀釋處理下的DPPH自由基清除率

在70%乙醇提取組中，2倍稀釋組的DPPH自由基清除率顯著高于16倍稀釋組(P<0.05)，4倍稀釋組的DPPH自由基清除率顯著高于16倍稀釋組(P<0.05)。

在80%乙醇提取組中，各稀釋組之間的DPPH自由基清除率差異均極顯著(P<0.01)。

2.4 桑葉多酚提取液的抗氧化能力評(píng)價(jià)

以Trolox溶液的各個(gè)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，與之對(duì)應(yīng)的DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，繪制Trolox質(zhì)量濃度-DPPH自由基清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=265.52X+11.639 (R2=0.994)。計(jì)算得到Trolox標(biāo)準(zhǔn)品的IC50=0.144 mg/mL。

圖3 Trolox質(zhì)量濃度-DPPH自由基清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線

如表4所示，60%乙醇提取組的IC50極顯著低于70%乙醇提取組(P<0.01)，顯著低于80%乙醇提取組(P<0.05)。與Trolox標(biāo)準(zhǔn)品相比，各乙醇提取組的IC50均相對(duì)較高，這說明雖然桑葉多酚提取液的抗氧化活性較Trolox標(biāo)準(zhǔn)品弱，但仍然具有一定的抗氧化能力。

表4 各乙醇提取組的IC50

通過對(duì)桑葉多酚絕對(duì)量與IC50之間的相關(guān)性分析，計(jì)算出桑葉多酚絕對(duì)量與IC50呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r)=-0.474；即多酚絕對(duì)量越高，IC50越小，提取液的體外抗氧化能力越強(qiáng)；但相關(guān)關(guān)系不顯著(P>0.05)。通過曲線擬合的方式，構(gòu)建起桑葉多酚絕對(duì)量(X)與IC50(Y)的擬合方程為：Y=-43.757X2+44.503X+11.263 (R2=0.314)。

3 討 論

3.1 桑葉多酚的提取工藝

本試驗(yàn)采取超聲波輔助提取法，探究了乙醇濃度對(duì)桑葉多酚提取的影響。其中，超聲波輔助提取法是利用超聲波輻射壓強(qiáng)，使提取溶劑內(nèi)所有的分子產(chǎn)生較為劇烈的物理效應(yīng)，進(jìn)而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，提高目標(biāo)成分的提取率。與傳統(tǒng)的醇提法相比，超聲波輔助提取法充分利用了超聲波的機(jī)械破碎作用和空化效應(yīng)，加快了桑葉多酚向溶劑中擴(kuò)散的速率，大大縮短了桑葉多酚的提取時(shí)間，超聲波輔助提取法的優(yōu)勢(shì)在于提取效率較高，所使用的溶劑較少，提取溫度較低，成本較低，適宜于在生產(chǎn)中大批量的使用。而近年來興起的微波提取法則是讓植物細(xì)胞在微波的作用下，產(chǎn)生巨大的熱量，促進(jìn)提取物從細(xì)胞中擴(kuò)散出來，微波提取法的優(yōu)勢(shì)在于效率較高且操作簡(jiǎn)單，并能夠有效地保護(hù)多酚不受氧化，但缺點(diǎn)是設(shè)備比較昂貴且維修保養(yǎng)較為繁瑣[8-10]。楊上鶯等[11]采用超聲波輔助提取乙醇的方法提取桑葉多酚，確定濃度為60%的乙醇是最佳的溶劑，這與本試驗(yàn)所得結(jié)論一致。初步推測(cè)濃度為60%的乙醇與桑葉中的多酚類物質(zhì)極性可能是最為接近的，有利于這些活性物質(zhì)的溶出，故而在此提取條件下多酚含量最高。祁偉亮等[12]亦采取了超聲波輔助提取法提取桑葉多酚，發(fā)現(xiàn)在乙醇濃度為30%、固液比為1∶35、提取時(shí)間為70 min、超聲波溫度為70 ℃的條件下桑葉多酚含量最高，并推測(cè)更低濃度的乙醇可能與桑葉多酚結(jié)構(gòu)更加相似。這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果不同，其原因可能是：1)本試驗(yàn)所采摘的桑葉品種與之不同，且采摘時(shí)間也存在差異，上述2個(gè)因素對(duì)桑葉多酚含量影響較大。2)桑葉多酚含量受到提取溫度、料液比、超聲提取時(shí)間、超聲波功率等多個(gè)因素共同作用，而本試驗(yàn)只研究了乙醇濃度這一個(gè)因素的影響，沒有采取響應(yīng)面法[13]對(duì)多個(gè)因素進(jìn)行嚴(yán)格地控制并探究出桑葉多酚的最佳提取工藝，因此有必要在后續(xù)試驗(yàn)中完善其他因素對(duì)桑葉多酚提取的影響。

3.2 桑葉多酚含量與DPPH自由基清除率之間的量效關(guān)系

3.3 桑葉多酚的體外抗氧化能力評(píng)價(jià)

植物多酚因能使未成對(duì)電子離域而激發(fā)其化學(xué)活性，能夠通過清除自由基、與金屬離子螯合、抑制體內(nèi)多種氧化酶的活性而起到抗氧化作用[19]。且這種抗氧化作用在動(dòng)物體內(nèi)主要表現(xiàn)為提高其生產(chǎn)性能和提升機(jī)體抗氧化損傷的能力；在體外則表現(xiàn)為清除特定自由基的能力。曹蓉等[20]研究發(fā)現(xiàn)，厚樸總酚顯著提升了29～56日齡黃羽肉雞的平均日增重，并對(duì)改善其肉品質(zhì)有一定的促進(jìn)作用；此外，厚樸總酚還可顯著提高黃羽肉雞血清中過氧化氫酶(catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低肝臟中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，因而增強(qiáng)了黃羽肉雞的抗氧化功能。王彥陽(yáng)等[21]研究發(fā)現(xiàn)，腰果葉多酚提取物具有天然抗氧化活性，當(dāng)其濃度為5 mg/L時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)62%，且較同濃度條件下的維生素C高；巫永華等[22]研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉多酚在純化前后對(duì)清除DPPH自由基的IC50分別為1.28和0.78 μg/mL，體外抗氧化活性非常優(yōu)越；謝佳函等[23]對(duì)紅豆皮多酚的抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著濃度的增大，紅豆皮多酚粗提物、多酚純化物和維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率呈先增加后平緩的趨勢(shì)，當(dāng)濃度為150 μg/mL時(shí)，多酚純化物與維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率大致相等，達(dá)96.53%，說明純化后的紅豆皮多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果較維生素C弱。桑葉多酚作為眾多植物多酚中的一種，亦具有良好的體外抗氧化活性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，60%乙醇提取組中的桑葉多酚提取液對(duì)DPPH自由基的IC50最低，對(duì)DPPH自由基的清除效果最好，且該組對(duì)應(yīng)的桑葉多酚含量最高；而70%乙醇提取組的桑葉多酚含量最低，對(duì)DPPH自由基的IC50最高，其對(duì)DPPH自由基的清除效果最弱；且根據(jù)桑葉多酚絕對(duì)量與IC50的相關(guān)性分析可知，兩者呈負(fù)相關(guān)，這一結(jié)論驗(yàn)證了上述試驗(yàn)結(jié)果的正確性，進(jìn)一步反映出桑葉多酚含量與體外抗氧化能力之間的量效關(guān)系，初步推測(cè)桑葉多酚含量可以作為評(píng)價(jià)桑葉體外抗氧化能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)，這與沈維治等[14]的研究報(bào)道一致。

4 結(jié) 論

綜上所述，桑葉多酚作為桑葉中的一類重要的天然活性物質(zhì)，具有良好的體外抗氧化作用。桑葉多酚含量與體外抗氧化能力之間存在一定的量效關(guān)系，雖然桑葉多酚提取液的體外抗氧化能力弱于Trolox標(biāo)準(zhǔn)品，但桑葉多酚仍然具有良好的體外抗氧化性能，可作為一種潛在的抗氧化添加劑被應(yīng)用于飼料生產(chǎn)與加工領(lǐng)域。