樊啟文 陳 芳 張 巍 郭萬正 黃少文 趙 娜 杜恩存 魏金濤

(湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢430064)

厚樸酚是中藥厚樸中重要的有效活性成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗炎癥、抗抑郁等多種生物學功效[1]。研究顯示，厚樸酚具有顯著的抗氧化功效，在多種細胞和動物模型中均可有效減緩氧化應激[2-3]。同時，厚樸酚也可廣泛地參與多種重要細胞信號通路和關(guān)鍵蛋白功能的調(diào)節(jié)。它可參與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2(NRF2)和核因子-κB(NF-κB) 功能的調(diào)節(jié)，也可作為過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ)和維甲酸X受體α(RXRα)的配體發(fā)揮PPARγ激動劑功能[4-6]。此外，厚樸酚也能經(jīng)由蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)通路誘導自噬的發(fā)生，或通過誘導細胞凋亡抑制腫瘤生長[7-8]。

前期研究顯示，厚樸酚(80 μmol/L)可緩解小鼠妊娠期間多種不利因素的影響和促進后代小鼠的發(fā)育，其抗抑郁功效可通過神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)影響妊娠過程[9]。此外，有研究表明，厚樸酚可濃度依賴地抑制母鼠子宮肌肉收縮[10]，顯示出對妊娠過程及結(jié)局的潛在調(diào)節(jié)功效。然而，厚樸酚在妊娠動物上的研究仍未見報道，其對妊娠動物胚胎發(fā)育、血清抗氧化及子宮內(nèi)膜關(guān)鍵基因表達的影響依舊未知。水楊酸鈉是一種非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥(NSAIDs)，具有一定的妊娠毒性，大劑量使用會導致胎兒畸變。研究顯示，300 mg/kg水楊酸鈉灌胃妊娠母鼠可導致子宮內(nèi)膜同源盒(HOX)基因表達異常，并可引發(fā)后代小鼠多余肋骨的產(chǎn)生[11-12]。此外，一些研究也發(fā)現(xiàn)，使用濃度大于200 mg/kg的水楊酸鈉灌胃妊娠母鼠可引起胚胎吸收率和死亡率顯著上升，表現(xiàn)出顯著的胚胎毒性[13-14]。厚樸酚對炎癥等相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)作用可能有助于緩解水楊酸鈉引發(fā)的損傷。因此，本研究通過構(gòu)建水楊酸鈉誘導妊娠損傷模型，以研究厚樸酚在妊娠小鼠妊娠損傷條件下對其胚胎發(fā)育、血清抗氧化及子宮內(nèi)膜關(guān)鍵基因表達的影響，并對其可能的作用機制進行探究。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

厚樸酚購于成都某生物科技有限公司；水楊酸鈉為分析純(含量>99%)，購于上海國藥集團；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)分析試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗動物

試驗用昆明小鼠購于湖北省武漢市疾病控制中心實驗動物中心。

1.3 試驗設(shè)備與儀器

低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)、微型移液器(德國Eppendorf公司)、超微量分光光度計(德國IMPLEN公司)、實時熒光定量PCR儀(德國Roche公司)、多功能分光光度計(日本島津公司)。

1.4 試驗設(shè)計

選取6～8周齡、體重[(37.24±3.53) g]接近的雌鼠96只，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復4只，分別為對照組、模型組(Ⅰ組)和修復組(Ⅱ和Ⅲ組)。正常飼養(yǎng)5 d后，開始合籠，以陰栓出現(xiàn)記為妊娠第0天(GD0)，因此妊娠第4天記為GD4，妊娠第9天記為GD9。所有小鼠飼喂基礎(chǔ)飼糧，對照組給予正常飲水[含1%二甲基亞砜(DMSO)]，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組于飲水(含1% DMSO)中加入厚樸酚，使其濃度分別為0、80和800 μmol/L。同時，在GD1～GD4期間，于每日09：00通過灌胃針給予妊娠小鼠按體重灌胃280 mg/kg的水楊酸鈉，灌胃后禁水1 h，其他時間保證自由采食和飲水。

1.5 血清和組織樣品的收集

于GD4、GD9時，分別從每組各取3只小鼠(共12只)進行眼球采血，并斷頸處死，器官稱重后，取子宮分離胎盤和胚胎后稱重，再次分離子宮內(nèi)膜，并將胎盤、胚胎和子宮內(nèi)膜分別保存于-80 ℃冰箱。

1.6 基因表達的檢測分析

于GD4、GD9時，子宮內(nèi)膜組織樣品使用RNAiso Plus(TaKaRa)進行總RNA的提取，所得總RNA進行純度與濃度的測定后，從每個樣品中分別取1.5 μg用于cDNA的合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)。應用Primer Premier 5.0分別設(shè)計NRF2、還原型輔酶/醌氧化還原酶1(NQO1)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、同源盒基因A10(HOXA10)、白血病抑制因子受體(LIFR)、E-鈣黏蛋白1(CDH1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因引物，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 血清抗氧化性能檢測

血清中MDA含量、SOD活性、T-AOC的檢測使用南京建成生物工程研究所相關(guān)試劑盒，并嚴格按照說明書，使用多功能分光光度計檢測。

1.8 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析利用Graphpad prism 5軟件進行，其中對照組與Ⅰ組采用Student’st檢驗分析，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間比較采用one-way ANOVA檢驗處理?？寡趸阅堋⒒虮磉_分析數(shù)據(jù)均來自至少3次獨立重復試驗。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，當P<0.05時表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 厚樸酚及水楊酸鈉處理對妊娠小鼠體增重的影響

如圖1所示，各組妊娠小鼠體增重無顯著差異(P>0.05)，顯示出水楊酸鈉并不顯著影響妊娠小鼠自然增重，厚樸酚添加對妊娠小鼠體增重也無顯著影響(P>0.05)。

圖1 厚樸酚及水楊酸鈉處理對妊娠小鼠體增重的影響

2.2 厚樸酚可緩解水楊酸鈉處理引發(fā)的胚胎損傷

如表2所示，各組間妊娠體重及器官重無顯著差異(P>0.05)。相較于對照組，Ⅰ組子宮全重和胚胎數(shù)顯著降低(P<0.05)，而Ⅱ組子宮全重及Ⅲ組子宮全重和胚胎數(shù)相較于Ⅰ組顯著增加(P<0.05)，并與對照組無顯著差異(P>0.05)，表明厚樸酚的添加可緩解水楊酸鈉引起的妊娠小鼠子宮失重和胚胎損失。

表2 厚樸酚及水楊酸鈉處理對妊娠小鼠器官重和胚胎數(shù)的影響

2.3 厚樸酚可緩解水楊酸鈉處理引發(fā)的血清抗氧化能力的降低

如圖2所示，血清中MDA含量、SOD活性和T-AOC的測定結(jié)果顯示，相比于對照組，Ⅰ組在GD9時血清中SOD活性和T-AOC顯著下降(P<0.05)，MDA含量顯著上調(diào)(P<0.05)；而厚樸酚處理可抑制這一變化，Ⅲ組血清中SOD活性和T-AOC顯著上升(P<0.05)，而MDA含量顯著下降(P<0.05)。這一現(xiàn)象表明水楊酸鈉處理可引起妊娠中期小鼠體內(nèi)抗氧化能力的下降，加重氧化應激，而厚樸酚的加入有助于緩解這一應激反應。

2.4 厚樸酚可調(diào)節(jié)水楊酸鈉引起的子宮內(nèi)膜相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達的改變

在GD4時，相比于對照組，Ⅰ組中子宮內(nèi)膜NQO1基因相對表達量顯著降低(P<0.05)，而LIFR基因相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，Ⅲ組中子宮內(nèi)膜NQO1和LIFR基因相對表達量趨近對照組(圖3-A)。在GD9時，與對照組相比，Ⅰ組子宮內(nèi)膜中CDH1和NRF2基因相對表達量顯著降低(P<0.05)，HO-1和HOXA10基因相對表達量顯著上升(P<0.05)，而相比于Ⅰ組，Ⅲ組子宮內(nèi)膜CDH1基因相對表達量顯著上升(P<0.05)，HO-1和HOXA10基因相對表達量顯著下降(P<0.05)，上述結(jié)果表明，厚樸酚可消除水楊酸鈉對多個基因表達的影響，顯示出厚樸酚對水楊酸鈉作用的抑制(圖3-B)。

數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

3 討 論

水楊酸鈉所屬NSAID類藥物具有抗氧化、抗炎癥等多種藥理功效，是一類廣泛使用的抗炎藥物，但其大劑量使用可引發(fā)胚胎損失，甚至導致妊娠動物孕產(chǎn)期死亡[15]。本研究中，對妊娠早期小鼠灌胃280 mg/kg水楊酸鈉可引起胚胎數(shù)和子宮全重顯著降低，顯示出高濃度水楊酸鈉對妊娠小鼠具有顯著的胚胎毒性，可誘導妊娠小鼠胚胎損傷發(fā)生。80和800 μmol/L厚樸酚均可顯著抑制水楊酸鈉引發(fā)的子宮全重降低，并抑制胚胎死亡，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，表明厚樸酚可緩解高濃度水楊酸鈉對妊娠小鼠的胚胎毒性。

圖A和圖B分別為GD4和GD9時基因相對表達量。

有報道指出，水楊酸鈉的抗氧化功效與其對HO-1蛋白表達的誘導密切相關(guān)[16-17]。HO-1蛋白是NRF2的下游蛋白，可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化狀態(tài)[4]。SOD是存在于動植物體內(nèi)重要的抗氧化酶類，而T-AOC可直接顯示待測樣品的抗氧化能力，是評估機體抗氧化水平的重要指標。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其高低可反映機體發(fā)生脂質(zhì)過氧化的水平，是評估機體抗氧化水平的負向指標。本研究中，水楊酸鈉處理可誘導子宮內(nèi)膜中HO-1表達水平在GD4時呈上升趨勢，而在GD9時顯著上調(diào)。然而，高濃度水楊酸鈉處理并未緩解妊娠小鼠體內(nèi)氧化壓力，血清SOD的活性和T-AOC均顯著下調(diào)，而MDA含量顯著上升，反映出妊娠小鼠體內(nèi)氧化應激水平呈上升狀態(tài)，這一現(xiàn)象可能與水楊酸鈉濃度過高有關(guān)。機體內(nèi)自由基，如活性氧(ROS)、羥自由基、氧自由基等，除引發(fā)機體氧化損傷反應外，也可作為重要的細胞信號分子。研究發(fā)現(xiàn)，適量過氧化氫可以誘導抗氧化酶基因表達，提高細胞及機體抗氧化能力[18]。同時，研究表明NSAID類藥物也可引起細胞內(nèi)ROS等上調(diào)，增加機體氧化壓力[19-20]。因此，母鼠體內(nèi)氧化應激水平的上調(diào)可能是由于高濃度水楊酸鈉處理引發(fā)的抗氧化功能升高不足以覆蓋其帶來的氧化壓力，引發(fā)氧化應激。相對于水楊酸鈉處理，水楊酸鈉灌胃后再添加800 μmol/L厚樸酚可顯著提高血清SOD活性和T-AOC，而降低MDA含量，顯示出厚樸酚對水楊酸鈉引起的妊娠小鼠血清抗氧化損傷的恢復作用。

母體代謝系統(tǒng)的改變與胚胎發(fā)育的階段密切相關(guān)。妊娠小鼠中，胚胎在GD4時開始著床，胚胎植入及子宮內(nèi)膜的蛻膜化調(diào)節(jié)最終影響活胚胎數(shù)。白血病抑制因子(LIF)是機體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)因子，可廣泛參與細胞分化、促炎癥和/或細胞凋亡等進程，并對妊娠的開始與維持發(fā)揮著重要功能[21]。LIFR是LIF的受體，可以募集gp130形成復合物并激活Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT3)途徑[22]。LIFR基因的缺失或干擾會導致胚胎植入失敗，引發(fā)不孕，但其過表達的影響依舊未知。有研究顯示，LIFR基因在整個妊娠階段子宮內(nèi)膜均有表達，但其表達水平和對STAT3的激活作用則呈現(xiàn)妊娠階段的特異性，并受孕激素水平高度調(diào)控[23]。本研究中，水楊酸鈉處理引發(fā)GD4時子宮內(nèi)膜LIFR基因上調(diào)表達，推測這一基因表達上調(diào)可能對胚胎植入形成干擾，引起胚胎植入與發(fā)育障礙，導致胚胎數(shù)降低。而添加厚樸酚濃度為800 μmol/L時可顯著抑制水楊酸鈉處理引發(fā)的LIFR基因上調(diào)，并可顯著抑制水楊酸鈉引發(fā)的胚胎死亡，表明適當濃度的厚樸酚對LIFR基因相對表達量具有調(diào)節(jié)作用，該調(diào)節(jié)作用可能有助于緩解水楊酸鈉引發(fā)的妊娠損傷。

小鼠胚胎器官發(fā)育約起始于GD6，這一過程受母體和胚胎組織釋放的多種激素和細胞因子等調(diào)節(jié)。CDH1編碼的蛋白質(zhì)-E-鈣黏蛋白，其下調(diào)或缺失能夠解離β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，并可進一步激活無翼型MMTV整合位點家族/β-catenin(Wnt/β-catenin)信號通路[24-25]，該通路能廣泛地參與調(diào)節(jié)器官組織的生長發(fā)育。研究認為NSAIDs藥物可通過啟動子甲基化和miRNA途徑調(diào)節(jié)CDH1基因表達[26]，已有報道指出，水楊酸類藥物可調(diào)節(jié)CDH1基因啟動子的甲基化[27]。在對照組中，CDH1在GD9時子宮內(nèi)膜的表達水平是GD4時的10倍，這一結(jié)果顯示出CDH1對妊娠早、中期子宮內(nèi)膜可能具有重要調(diào)節(jié)的作用。水楊酸鈉處理可顯著抑制GD9時子宮內(nèi)膜中CDH1表達水平，當添加厚樸酚濃度達到800 μmol/L時可恢復水楊酸鈉引起的CDH1基因相對表達量下調(diào)，使其達到對照組水平。此外，Taylor等[28]研究表明，HOXA10基因缺失小鼠的排卵正常，但胚胎植入受到了干擾。同時，該研究還發(fā)現(xiàn)HOXA10缺失胚胎可以植入正常小鼠的子宮中，但是正常胚胎不能植入具有HOXA10基因缺失的小鼠子宮中[28]。這些結(jié)果表明，HOXA10在調(diào)節(jié)胚胎植入過程中具有重要作用。本研究中，HOXA10在GD4時各組中的基因相對表達量無顯著差異，但在GD9時，受水楊酸鈉調(diào)節(jié)而顯著上調(diào)，這一上調(diào)可在厚樸酚的處理下恢復至對照組水平。厚樸酚對HOXA10的調(diào)節(jié)作用與其濃度未呈現(xiàn)出相關(guān)性，較低濃度厚樸酚即可實現(xiàn)對子宮內(nèi)膜中HOXA10基因相對表達量的調(diào)節(jié)，表明HOXA10可能是厚樸酚調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜功能的重要靶點。

4 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明，高濃度水楊酸鈉處理可引起妊娠小鼠胚胎數(shù)和子宮全重顯著降低，引發(fā)血清SOD活性和T-AOC下調(diào)，提高血清MDA含量，并能顯著影響子宮內(nèi)膜LIFR、CDH1和HOXA10等基因相對表達量。厚樸酚的添加可提高妊娠小鼠胚胎數(shù)和子宮全重，上調(diào)血清SOD活性和T-AOC，降低MDA含量，抑制水楊酸鈉引起的子宮內(nèi)膜LIFR、CDH1和HOXA10基因相對表達量變化，有效緩解水楊酸鈉引起的胚胎毒性和妊娠小鼠氧化損傷。