曹謹(jǐn)玲 陳劍杰 李麗娟 常藕琴 黃志斌*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷030801； 3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，太谷030801；4.中國水產(chǎn)科學(xué)院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物 創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510380)

炎癥是機(jī)體對各種外源致炎因素刺激而產(chǎn)生的一種生理和病理性過程，是機(jī)體對外界刺激防御反應(yīng)的重要組成部分，但是過度的炎癥也是許多疾病的重要組成部分，嚴(yán)重的還導(dǎo)致生命威脅[1-3]。許多研究表明一些疾病的發(fā)生發(fā)展都會伴隨有炎癥的發(fā)生，二者擁有比較緊密的關(guān)系，如哮喘、癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病等[4-6]。艾葉(Artemisiaeargyi)為菊科植物艾的葉，在我國大部分地區(qū)都有生長。艾葉揮發(fā)油(Artemisiaargyiessential oils，AAEO)是艾葉的主要有效成分，具有多種藥理功效。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，AAEO具有殺蟲藥效，可用于殺滅谷物和中草藥中昆蟲；Akhbari等[8]研究表明，AAEO具有清除自由基的活性；丁圓平等[9]研究表明，AAEO可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；葛德鵬等[10]研究表明，AAEO可作用于微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)從而起到抑菌作用；Xiang等[11]研究表明，AAEO對金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等具有抑制作用。但是，目前對于AAEO抗炎活性特別是抗炎機(jī)制方面的研究還鮮有報道。

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體非特異性免疫的重要參與者，不但可以參與到較多的機(jī)體免疫反應(yīng)中，且在炎癥反應(yīng)的進(jìn)程中也起著不可替代的作用[12-13]。在炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞能夠通過分泌細(xì)胞因子及抗原提呈等作用對炎癥反應(yīng)進(jìn)程起到影響和調(diào)控作用[14-16]。因此，本試驗(yàn)通過脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7細(xì)胞)建立細(xì)胞炎癥模型來研究AAEO的抗炎能力，為進(jìn)一步探討AAEO的抗炎功效及為其作為綠色安全飼用添加劑的可能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑與儀器

AAEO提取參照《中國藥典》(2015版)水蒸氣蒸餾法進(jìn)行：稱取艾葉500 g，粉碎后放于10 L的圓底燒瓶中，加入5 L蒸餾水浸泡過夜，水蒸氣蒸餾法提取6 h，收集揮發(fā)油，經(jīng)無水Na2SO2干燥后封裝備用，測定AAEO產(chǎn)率為0.48%。AAEO主要成分為：1,8桉葉素(1,8 eucalyptol，2.89%)、4-萜烯醇[4-methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclohexen-1-ol，6.56%]、龍腦(borneol，5.94%)、樟腦(camphor，3.31%)、松油醇(p-menth-1-en-8-ola，3.82%)、2,4,6-三甲基苯基-2,4,6-三甲基苯甲酸酯(2,4,6-trimethylphenyl 2,4,6-trimethyl enzoate，4.85%)、石竹烯(caryophyllene，5.84%)。

RAW264.7細(xì)胞、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)試劑盒購自索萊寶科技有限公司。細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK8)、LPS購自美國Sigma公司。一氧化氮(NO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、AYBR Green PCR Kit購自大連TaKaRa公司。

主要儀器包括CJX41S倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀(奧地利Molecular Devices公司)、熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、低溫高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、SW-CJ-1F潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、3111型二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠RAW264.7細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素)中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞毒性的測定[17]

調(diào)整對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞密度到4×105個/mL，接種于48孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。試驗(yàn)設(shè)置空白對照組[添加濃度為0.1%二甲基亞砜(DMSO)的培養(yǎng)基]和試驗(yàn)組[分別添加濃度為5、10、20、40、80、160 μg/mL的AAEO(提取的AAEO加入DMSO助溶，培養(yǎng)基稀釋到試驗(yàn)用濃度，DMSO濃度為0.1%)]，并設(shè)置3個重復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，除去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔添加100 μL的含有10% CCK8溶液的培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 h后采用酶標(biāo)儀測定每孔在波長450 nm時的吸光度。

1.2.3 試驗(yàn)分組及NO含量的測定

調(diào)整對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞密度到5×105個/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔500 μL。設(shè)置對照組(添加濃度為0.1% DMSO的培養(yǎng)基)、LPS組(添加濃度為1 μg/mL LPS的培養(yǎng)基)、不同濃度AAEO組(分別添加5、10、20 μg/mL的AAEO，預(yù)處理1 h，再添加濃度為1 μg/mL LPS的培養(yǎng)基)，每組設(shè)置3個重復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，收集上清用于NO含量的測定，其含量應(yīng)用Griess法，按照試劑盒的步驟進(jìn)行測定。

1.2.4 細(xì)胞炎癥因子含量的測定

將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種于12孔板(細(xì)胞密度為5×105個/mL)進(jìn)行培養(yǎng)。依據(jù)試驗(yàn)分組孵育24 h后，收集細(xì)胞上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1含量，具體測定步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.5 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的檢測

將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種于24孔板(細(xì)胞密度為1×106個/mL)，依據(jù)試驗(yàn)分組孵育24 h后，收集細(xì)胞提取mRNA并轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用熒光定量PCR儀檢測TNF-α、IL-1β、IL-6和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表達(dá)量，具體操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行，β-肌動蛋白(β-actin)作為管家基因，2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。NCBI數(shù)據(jù)庫查詢得到的基因序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer Premier 6設(shè)計引物序列(表1)。

表1 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 AAEO對RAW264.7細(xì)胞毒性評價

由圖1可知，與AAEO濃度為0 μg/mL時相比，AAEO濃度為5～20 μg/mL時，RAW264.7細(xì)胞活力分別上升了5.34%(P<0.05)、14.76%(P<0.05)和34.68%(P<0.05)；AAEO濃度為40～160 μg/mL時，RAW264.7細(xì)胞活力分別下降了0.81%(P>0.05)、2.06%(P>0.05)和19.98%(P<0.05)。RAW264.7細(xì)胞活力在AAEO濃度為20 μg/mL時最高，在AAEO濃度為160 μg/mL時最低。因此，選擇5、10、20 μg/mL作為后續(xù)試驗(yàn)AAEO濃度。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 AAEO對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO含量的影響

由圖2可知，與對照組相比，LPS組RAW264.7細(xì)胞NO含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細(xì)胞NO含量均顯著降低(P<0.05)，分別下降了24.4%、35.0%和47.8%。相關(guān)性分析表明，AAEO濃度與NO含量呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.907，P<0.05)。

#表示與對照組比較差異顯著(P<0.05)，*表示與LPS組比較差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.3 AAEO對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎性因子含量的影響

由圖3可知，與對照組相比，LPS組RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1含量均顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細(xì)胞TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了14.45%、24.29%和32.71%。相關(guān)性分析表明，AAEO濃度與TNF-α含量呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.877，P<0.05)。

圖3 AAEO對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎性因子含量的影響

與LPS組相比，10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細(xì)胞IL-1β含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了37.08%和52.97%。相關(guān)性分析表明，AAEO濃度與IL-1β含量呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.706，P<0.05)。

與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細(xì)胞IL-6含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了25.19%、35.87%和38.86%。相關(guān)性分析表明，AAEO濃度與IL-6含量呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.753，P<0.05)。

與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細(xì)胞MCP-1含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了11.18%、28.15%和39.20%。相關(guān)性分析表明，AAEO濃度與MCP-1含量呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.806，P<0.05)。

2.4 AAEO對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎性因子mRNA相對表達(dá)量的影響

由圖4可知，與對照組相比，LPS組RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOSmRNA相對表達(dá)量均升高顯著(P<0.05)。與LPS組相比，10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細(xì)胞TNF-αmRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。相關(guān)性分析表明，AAEO濃度與TNF-αmRNA相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.856，P<0.05)。

圖4 AAEO對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎性因子mRNA相對表達(dá)量的影響

與LPS組相比，10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細(xì)胞IL-1βmRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。相關(guān)性分析表明，AAEO濃度與IL-1βmRNA相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.752，P<0.05)。

與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細(xì)胞IL-6 mRNA相對表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。相關(guān)性分析表明，AAEO濃度與IL-6 mRNA相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.873，P<0.05)。

與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細(xì)胞iNOSmRNA相對表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。相關(guān)性分析表明，AAEO濃度與iNOSmRNA相對表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.806，P<0.05)。

3 討 論

炎癥反應(yīng)是一種復(fù)雜的宿主防御過程，是通過免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)清除不利因素侵入的過程[17]。正常情況下炎癥反應(yīng)體現(xiàn)的是對人體有利的方面，但是隨著炎癥介質(zhì)的持續(xù)增多，會對機(jī)體組織產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響，導(dǎo)致疾病的發(fā)生、加重。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要組成部分，不但可以誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的釋放，還可以促使炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，被認(rèn)為是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的因素之一[18-19]。巨噬細(xì)胞作為免疫細(xì)胞具有多種功能，不但能夠消除細(xì)胞碎片及病原微生物，還能夠分泌細(xì)胞因子等介質(zhì)，小鼠RAW264.7細(xì)胞擁有穩(wěn)定性好、可傳代培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)[20-21]。因此，在體外試驗(yàn)中常常使用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞作為體外炎癥細(xì)胞模型[22-23]。為了明確AAEO對細(xì)胞活力的作用，本試驗(yàn)應(yīng)用CCK8法測定了不同濃度AAEO對RAW264.7細(xì)胞的毒性，并明確了試驗(yàn)中AAEO的安全濃度范圍，結(jié)果顯示，AAEO濃度在5～20 μg/mL時對RAW264.7細(xì)胞活性無抑制作用，提示此濃度范圍的AAEO對RAW264.7細(xì)胞無細(xì)胞毒性作用，進(jìn)一步說明本研究所采用的5、10和20 μg/mL的AAEO在LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥中呈現(xiàn)的抗炎活性并不是通過降低細(xì)胞活性來完成的。

細(xì)胞因子是由細(xì)胞釋放的小分子生物活性物質(zhì)，可以通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和參與炎癥反應(yīng)[12,24]。LPS可以誘導(dǎo)刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1等炎性細(xì)胞因子。TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中具有關(guān)鍵作用的炎癥介質(zhì)，TNF-α在自身分泌的過程中還能夠誘導(dǎo)白細(xì)胞介素的分泌，進(jìn)一步促使炎癥的反應(yīng)，TNF-α分泌的增加還可以刺激MCP-1的形成，進(jìn)一步引起炎癥損傷[25-26]。IL-1β是一種可以誘發(fā)炎癥反應(yīng)以及機(jī)體防御反應(yīng)的炎性細(xì)胞因子，能夠激活多種免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞，形成與TNF-α類似的生理及代謝作用，與TNF-α協(xié)同作用，是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)重要的介質(zhì)之一[17,27]。IL-6來源于經(jīng)過TNF-α和IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞和組織，參與機(jī)體內(nèi)信號分子之間的傳遞并引起炎癥反應(yīng)，其含量高低能夠反映機(jī)體的炎癥和組織損傷程度[28-29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞可以使其分泌的細(xì)胞因子含量增加，這與于笛等[12]、高銘彤等[24]、李帥帥[30]研究結(jié)果一致。AAEO能夠抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的過多分泌，提示AAEO可以通過調(diào)控細(xì)胞炎癥因子的分泌來體現(xiàn)其抗炎作用。

NO是一種生物活性物質(zhì)，擁有促炎和抗炎雙重作用，過多NO是有害的且能夠引起各種炎癥和疾病[24]。本研究通過檢測發(fā)現(xiàn)，LPS組RAW264.7細(xì)胞NO含量比對照組顯著升高，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細(xì)胞NO含量比LPS組均顯著降低，且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。由此可見，AAEO在一定程度上可以通過抑制NO的釋放來呈現(xiàn)其抗炎功能。本試驗(yàn)還進(jìn)一步檢測了AAEO對NO的上游關(guān)鍵酶iNOS的mRNA和促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示AAEO可以抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表達(dá)，說明AAEO可以通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表達(dá)來發(fā)揮抗炎活性。

4 結(jié) 論

綜上所述，AAEO可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞炎性因子的基因表達(dá)以及調(diào)控細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌來發(fā)揮抗炎作用。