呂可欣 敖長金* 趙亞星 安雅雯 段嘉鈺 張 昊 張喜勝

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，呼和浩特010018； 2.錫林浩特市鼎安生物科技有限公司，錫林浩特026000)

植物源生物活性肽主要是豆類蛋白和谷物蛋白的水解產(chǎn)物，常見的有大豆肽、花生肽、大米肽、玉米肽和小麥肽等，可作為功能性飼料添加劑，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中應用前景廣闊。植物源肽除了參與機體的消化、吸收和代謝的調(diào)節(jié)外，還具有降低膽固醇[1]、降血壓[2]、抗腫瘤[3]、提高機體免疫力和抗氧化能力[4-5]及改善骨結(jié)構(gòu)[6]等生理機能。研究表明，飼糧中添加大豆活性肽可以提高母豬血清中功能性氨基酸含量并改善其抗氧化性能，縮短產(chǎn)仔間隔，提高哺乳仔豬的生長性能[7]；提高育雛雞的日增重和免疫器官指數(shù)[8]。小麥低聚肽則能提高急性酒精中毒小鼠體內(nèi)的抗氧化能力，并對肝損傷具有一定的緩解作用[9]。飼糧中添加大豆肽可以改善肉牛瘤胃發(fā)酵，提高瘤胃微生物含量[10]，提高魯西黃牛瘤胃中氨、丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)的濃度，改善其營養(yǎng)物質(zhì)的消化和瘤胃發(fā)酵[11]；灌注大豆肽可提高瘤胃內(nèi)菌體蛋白(MCP)產(chǎn)量，增加氮沉積，改善腸道氨基酸平衡[12]。在飼糧中添加抗菌肽可改善山羊瘤胃微生物群結(jié)構(gòu)，改變瘤胃發(fā)酵模式，提高飼料利用效率從而提高了潛在的生長性能[13-14]。目前關于植物源生物活性肽的國內(nèi)外研究多集中于單胃動物，而對肉羊瘤胃微生物活性和瘤胃代謝的影響卻鮮有報道。因此，本試驗通過研究不同添加水平的小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，從而篩選出其適宜添加量，以期為小麥低聚肽在肉羊生產(chǎn)中進一步應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥低聚肽產(chǎn)品由錫林浩特市某生物科技有限公司提供。小麥低聚肽以谷阮粉為原材料，采用復配專用蛋白酶進行深層水解，總蛋白質(zhì)含量達到80%以上，其中游離氨基酸含量在10%左右，肽含量在70%左右。

1.2 試驗動物及飼糧

選取6只年齡相同(1.5歲)、體重[(68.00±1.56) kg]相近、裝有永久性瘤胃瘺管的健康小尾寒羊作為瘤胃液供體動物，供體羊自由飲水，于每日08:00和17:00飼喂基礎飼糧。

1.3 試驗設計

試驗采用單因素完全隨機試驗設計，共分為7個組，對照組采用基礎培養(yǎng)底物(基礎飼糧)，試驗組在基礎培養(yǎng)底物中分別添加0.05%、0.10%、0.15%、0.25%、0.35%和0.45%的小麥低聚肽，每組6個重復，每個重復取1 g培養(yǎng)底物在體外進行瘤胃發(fā)酵，分別培養(yǎng)2、4、8、12和24 h?；A飼糧的精粗比為30∶70，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

續(xù)表1項目 Items含量 Content葫蘆籽皮 Gourd seed skin12.15干酒糟及其可溶物 DDGS4.33亞麻籽餅 Flax seed meal4.62向日葵仁餅 Sunflower seed meal6.09小麥麩 Wheat bran4.29紅棗 Red dates1.68石粉 Limestone1.48磷酸氫鈣 CaHPO40.69食鹽 NaCl 0.72預混料 Premix1)1.40合計 Total 100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)16.83粗蛋白質(zhì) CP 15.32酸性洗滌纖維 ADF 29.69中性洗滌纖維 NDF50.98粗脂肪 EE 3.09 鈣 Ca1.02 磷 P 0.55

1.4 體外瘤胃發(fā)酵培養(yǎng)

于晨飼前1 h內(nèi)進行瘤胃液采集，將采集到的瘤胃液灌入到預熱至39 ℃并始終通有二氧化碳(CO2)的保溫瓶中，灌滿后立即蓋嚴瓶口，迅速帶回實驗室，經(jīng)4層精細紗布過濾后持續(xù)沖入CO2氣體5 min直至分裝使用。體外培養(yǎng)液參考Menke等[15]的方法進行配制。由瘤胃液與人工培養(yǎng)液以1∶2的比例配制而成。裝有培養(yǎng)底物的發(fā)酵瓶中加入培養(yǎng)液40 mL和瘤胃液20 mL，通入CO2排盡空氣，保持無氧環(huán)境，蓋緊瓶塞，放于39 ℃水浴搖床上開始厭氧培養(yǎng)24 h。

1.5 樣品收集與處理

待各時間點培養(yǎng)結(jié)束后，立即將發(fā)酵瓶置于冰上進行冷卻，以確保各發(fā)酵瓶同時終止發(fā)酵，并按照如下操作依次進行取樣：發(fā)酵至2、4、8、12和24 h時，收集各時間點各組培養(yǎng)液，用4層紗布過濾，收集濾液，去除殘渣，將濾液搖勻倒入50 mL離心管內(nèi)立即測定pH后，將離心管于4 000 r/min離心15 min，用移液槍吸出0.5 mL上清液，置于預先裝好4.5 mL 0.2 mol/L HCl的10 mL離心管中，并用手搖勻放入-20 ℃冰箱，待測氨態(tài)氮(NH3-N) 濃度；再用5 mL的移液槍吸取4 mL上清液，移入預先裝有1 mL 25%的偏磷酸(HPO3)和蟻酸(CH2O2)混合液(3∶1)的10 mL離心管中，冷藏在-20 ℃冰箱，用來待測揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度；剩余的上清液緩慢吸入20 mL離心管中，-20 ℃保存，用來測定MCP濃度；采樣的過程中，每次樣品采集結(jié)束后，該時間點的培養(yǎng)瓶棄用。

1.6 測定指標及方法

瘤胃液pH采用高精度便攜式pH計(pHS-3S)測定。NH3-N濃度參照馮宗慈等[16]改進的比色法進行測定，用酶標儀在700 nm波長下進行吸光度檢測，將測得的吸光值代入標準曲線回歸公式，計算樣品中的NH3-N濃度。MCP濃度的測定采用差速離心法對體外培養(yǎng)液中的細菌進行分離，用超聲波儀進行細胞壁的破碎，再采用考馬斯亮藍法[17]對蛋白進行染色，利用酶標儀進行比色測定，根據(jù)測定的吸光值和標準曲線回歸公式計算出MCP濃度。VFA濃度參考曹慶云等[18]的氣相色譜法進行測定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行初步整理，運用SAS 9.2軟件進行單因素方差、線性和二次項分析，并采用Duncan氏法進行多重比較。當P<0.05時，表示組間差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液中pH的影響

由表2可知，發(fā)酵2 h時，0.25%組pH顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵4和8 h，0.25%組pH顯著高于對照組(P<0.05)，其他試驗組pH與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵12 h時，0.10%、0.15%、0.35%和0.45%組pH顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵24 h時，0.10%～0.45%組pH均顯著低于對照組(P<0.05)，其中0.25%組pH最低。隨著發(fā)酵時間的延長，pH逐漸降低。

表2 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液中pH的影響

2.2 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液中NH3-N濃度的影響

由表3可知，發(fā)酵4、8和24 h時，小麥低聚肽的不同添加水平對NH3-N濃度均有顯著影響(P<0.05)。發(fā)酵4 h時，0.25%組NH3-N濃度顯著高于對照組(P<0.05)，其他試驗組間均不顯著(P>0.05)；發(fā)酵8 h時，0.35%組NH3-N濃度顯著高于對照組(P<0.05)；發(fā)酵24 h時，0.25%～0.45%組NH3-N濃度顯著高于對照組(P<0.05)，其中0.25%組NH3-N濃度最高。發(fā)酵2和12 h時，試驗組NH3-N濃度與對照組相比均不顯著(P>0.05)。NH3-N濃度隨發(fā)酵時間的增加，呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢。

表3 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液NH3-N濃度的影響

2.3 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液中MCP濃度的影響

由表4可知，發(fā)酵2、8和24 h時，小麥低聚肽的不同添加水平對體外瘤胃發(fā)酵液中MCP濃度均有顯著影響(P<0.05)。發(fā)酵2 h時，0.15%、0.25%和0.45%組的MCP濃度顯著高于對照組(P<0.05)；發(fā)酵8 h時，0.05%～0.45%組MCP濃度均顯著高于對照組(P<0.05)；發(fā)酵12 h時，0.45%組MCP濃度顯著高于對照組(P<0.05)，其余試驗組均不顯著(P>0.05)；發(fā)酵24 h時，0.10%～0.25%組MCP濃度顯著高于對照組(P<0.05)，其他試驗組均不顯著(P>0.05)。MCP濃度隨發(fā)酵時間的增加，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。

表4 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液中MCP濃度的影響

2.4 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液中VFA濃度的影響

由表5可知，發(fā)酵2 h時，0.35%和0.45%組的乙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵4 h時，0.05%組乙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵8 h時，0.25%和0.35%組乙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)，其他試驗組顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵12 h時，0.45%組乙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)，其他試驗組顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵24 h時，0.15%、0.25%和0.45%組乙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)。

表5 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液中乙酸濃度的影響

由表6可知，在發(fā)酵2 h時,0.35%組丙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵4 h時，0.05%組丙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵8 h時，0.25%和0.35%組丙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05),0.05%、0.10%和0.15%組丙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵12 h時，0.45%組丙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)，0.10%、0.25%和0.35%組丙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵24 h時，0.15%、0.25%、0.35%和0.45%組丙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)。

表6 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液中丙酸濃度的影響

由表7可知，發(fā)酵8 h時，0.25%和0.35%組丁酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)，0.05%和0.15%組丁酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)。發(fā)酵12 h時，0.45%組丁酸濃度顯著高于對照組及其他試驗組(P<0.05)，0.25%和0.35%組丁酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)。發(fā)酵24 h時，除0.45%組外，其他試驗組丁酸濃度均顯著高于對照組(P<0.05)。

表7 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液中丁酸濃度的影響

由表8可知，發(fā)酵8 h時，0.05%和0.10%組乙丙比顯著高于對照組(P<0.05)，0.25%和0.35%組乙丙比顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵24 h時，0.45%組乙丙比顯著高于對照組及其他試驗組(P<0.05)。隨著發(fā)酵時間的延長，由乙酸型發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)楸嵝桶l(fā)酵。

表8 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液中乙丙比的影響

2.5 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵干物質(zhì)降解率的影響

由表9可知，發(fā)酵12 h時，0.05%、0.10%和0.15%組干物質(zhì)降解率顯著高于對照組(P<0.05)，其他各時間點的試驗組干物質(zhì)降解率與對照組相比差異均不顯著(P>0.05)。同一試驗組隨著發(fā)酵時間的增加，干物質(zhì)降解率均呈現(xiàn)上升的趨勢。

表9 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液中干物質(zhì)降解率的影響

3 討 論

3.1 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵pH的影響

瘤胃pH是衡量瘤胃發(fā)酵狀況的重要指標之一，主要受飼糧組成、唾液分泌和有機酸積累的影響。研究表明，瘤胃液pH的變化范圍在6.0～7.0時有利于MCP的生物合成[19]。當pH低于6.2時，纖維素分解菌的活性將受到抑制，并降低粗飼料在反芻動物瘤胃內(nèi)的消化率，但瘤胃內(nèi)pH的下降，會加快瘤胃上皮細胞對揮發(fā)性脂肪酸的吸收速度。本試驗中，發(fā)酵2、12和24 h時，添加不同水平的小麥低聚肽可顯著降低其體外瘤胃發(fā)酵的pH，但其值均在瘤胃微生物代謝的適宜范圍內(nèi)，說明不同水平的小麥低聚肽能促進瘤胃微生物對底物的發(fā)酵而增加了酸的生成量，這與殷云浩[20]的研究結(jié)果一致，即與對照組相比，各時間點試驗組pH均顯著降低，其原因可能是發(fā)酵瓶中產(chǎn)生的氣體不能及時排出所致。

3.2 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液NH3-N濃度的影響

反芻動物瘤胃內(nèi)NH3-N主要是由飼糧中的蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮物質(zhì)的脫氨基作用而產(chǎn)生，是反映瘤胃內(nèi)氮代謝的重要指標之一。瘤胃內(nèi)NH3-N濃度的高低與微生物對飼糧中蛋白質(zhì)的降解和利用機制有關[21]。因此，通過瘤胃內(nèi)NH3-N濃度的動態(tài)曲線可間接了解反芻動物瘤胃內(nèi)發(fā)酵過程的變化。瘤胃NH3-N濃度的適宜范圍為5～30 mg/dL[22]，在本試驗中，NH3-N濃度在10.92～12.74 mg/dL，均處于NH3-N濃度最適范圍內(nèi)，如果超出范圍就說明瘤胃NH3-N利用處于失衡狀態(tài)。柏峻等[23]研究報道，NH3-N濃度一旦超過瘤胃微生物利用氨氮合成MCP的最大限度，多余的NH3-N不僅會加重機體氮代謝的負擔，還會抑制瘤胃微生物的生長繁殖，破壞瘤胃微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，不利于瘤胃發(fā)酵。本試驗中，0.45%組除發(fā)酵24 h外，其余各時間點間NH3-N濃度均無顯著差異。原因可能是在發(fā)酵前期，瘤胃微生物加快瘤胃蛋白質(zhì)及非蛋白氮的降解，提高氮利用率，從而加快合成MCP的速率。隨著發(fā)酵時間的延長，各組NH3-N濃度表現(xiàn)為先降低后升高再降低的趨勢。

3.3 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液MCP濃度的影響

MCP可為反芻動物提供重要的蛋白質(zhì)來源，其濃度是衡量瘤胃發(fā)酵最重要的指標之一。MCP是瘤胃微生物利用非蛋白氮進行合成的，可為機體提供氨基酸合成蛋白質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加小肽可增加瘤胃發(fā)酵液中NH3-N和MCP的濃度[24]；Wang等[11]將大豆小肽注入到黃牛瘤胃中可增加MCP的合成，其原因可能是氨氮利用率的提高和發(fā)酵液之間的同步性改善。本試驗中，發(fā)酵2、8和24 h時，不同水平的小麥低聚肽對微生物的促進效果顯著升高，說明小麥低聚肽可促進反芻動物瘤胃發(fā)酵，提高MCP的產(chǎn)量。

3.4 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃發(fā)酵液VFA濃度的影響

瘤胃中的VFA主要是由瘤胃內(nèi)的微生物降解碳水化合物而產(chǎn)生，其中乙酸、丙酸和丁酸是最主要的VFA，占TVFA的95%[25]。VFA作為瘤胃微生物發(fā)酵碳水化合物的終產(chǎn)物之一，是反芻動物主要的能源。本試驗中，0.25%、0.35%和0.45%組的乙酸濃度在發(fā)酵8 h后顯著高于對照組；0.15%、0.25%、0.35%和0.45%組的丙酸濃度在發(fā)酵24 h后顯著高于對照組，說明不同水平的小麥低聚肽均可促進瘤胃微生物對碳水化合物的發(fā)酵，從而提高瘤胃對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。

3.5 小麥低聚肽對肉羊體外瘤胃干物質(zhì)降解率的影響

飼糧干物質(zhì)在瘤胃中的降解率是衡量瘤胃發(fā)酵的重要參數(shù)，它與飼糧蛋白質(zhì)降解率、氨基酸降解率、淀粉降解率都有一定的相關性。本試驗結(jié)果表明，在發(fā)酵12 h,添加小麥低聚肽對肉羊瘤胃干物質(zhì)降解率有顯著影響，且隨著發(fā)酵時間的延長，干物質(zhì)降解率呈逐漸升高的趨勢。

4 結(jié) 論

① 在本試驗體外培養(yǎng)條件下，添加小麥低聚肽可顯著降低瘤胃液pH，提高NH3-N和VFA濃度，促進瘤胃內(nèi)MCP的合成，降低乙酸/丙酸，從而提高瘤胃發(fā)酵速率，改善瘤胃發(fā)酵內(nèi)環(huán)境。

② 多項指標綜合指數(shù)表明，飼糧中添加小麥低聚肽可有效促進肉羊體外瘤胃發(fā)酵，且最佳添加量為0.25%。