馬曉玲 舒 適 黃 榮 張 君*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧810016；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016)

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原地區(qū)的主要反芻動物之一，為我國青藏高原地區(qū)提供了主要的生活支持和經(jīng)濟來源。牦牛繁殖率是牦牛生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟指標之一，但目前牦牛繁殖率低下已成為亟待解決的問題。就經(jīng)產(chǎn)母牦牛而言，傳統(tǒng)自由放牧的飼養(yǎng)模式使其圍產(chǎn)期常常處于冬春季的枯草期，這一時期的草場狀況和環(huán)境較為惡劣，直接影響牦牛的營養(yǎng)狀況[1]。另外，青藏地區(qū)的牧民幾乎對圍產(chǎn)期牦牛沒有任何保健護理的措施，這使牦牛在圍產(chǎn)期常處于營養(yǎng)缺乏狀態(tài)[2-4]，牦牛的營養(yǎng)供給不足是降低其繁殖性能的主要原因之一[5]。目前已有圍產(chǎn)期營養(yǎng)顯著影響奶牛下一次妊娠的研究報道[6]，但牦牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)與下一次妊娠的關(guān)系尚未明確。圍產(chǎn)期一般界定為產(chǎn)前第28天至產(chǎn)后第28天，該階段是母畜生產(chǎn)中的一個重要時期，包括牦牛[7]。有相關(guān)研究顯示，圍產(chǎn)期奶牛容易表現(xiàn)出能量負平衡[8]。能量負平衡是指母畜分娩后體內(nèi)血糖水平下降并伴隨脂肪動員，造成體內(nèi)游離脂肪酸[又稱非酯化脂肪酸(nonestesterified fatty acid，NEFA)]和酮體濃度大量增加[9]。酮體作為機體發(fā)生能量負平衡時的標志產(chǎn)物，其主要成分β羥丁酸(β hydroxybutyric acid，BHBA)濃度在奶牛圍產(chǎn)后期的血液中升高，存在明顯的消長規(guī)律。血液中酮體濃度的升高直接影響奶牛生產(chǎn)性能、泌乳性能及免疫狀態(tài)等，并嚴重影響其繁殖性能[10]。然而，對于青藏地區(qū)牦牛圍產(chǎn)期的研究在國內(nèi)外報道甚少，而且酮體對牦牛繁殖的影響也屬于研究空白?；诖耍驹囼炑芯苛藝a(chǎn)期母牦牛血清酮體的消長規(guī)律以及酮體對牦牛產(chǎn)后生殖激素分泌的影響，旨在探究母牦牛由于產(chǎn)犢間隔過長引起繁殖性能低下的原因。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計和樣品采集

試驗選擇25頭年齡[(7.00±1.23)歲]、胎次[(2.00±0.07)次]和體況[(3.00±0.63)分]相近的經(jīng)產(chǎn)母牦牛作為試驗動物。牦牛自由放牧，早出牧、晚歸牧，延長放牧時間，讓牦牛多采食。從4月開始每7 d采集1次試驗動物自產(chǎn)前第28天至產(chǎn)后第28天的血液，用以探究母牦牛圍產(chǎn)期血清酮體的消長規(guī)律，分為9個時間點：產(chǎn)前第28天、產(chǎn)前第21天、產(chǎn)前第14天、產(chǎn)前第7天、分娩當天(第0天)、產(chǎn)后第7天、產(chǎn)后第14天、產(chǎn)后第21天及產(chǎn)后第28天。直到6月結(jié)束。另外，繼續(xù)跟蹤試驗動物至產(chǎn)后第49天，同樣每7 d采集試驗動物血液，分為3個時間點：產(chǎn)后第35天、產(chǎn)后第42天和產(chǎn)后第49天，用以研究母牦牛酮體對生殖激素分泌的影響。并借助直檢或肉眼觀測試驗?zāi)戈笈ｊ帒袅鞒龅酿ひ呵闆r、是否頻繁排尿、相互舔嗅和外陰部等發(fā)情情況。

采用頸靜脈采血法采集全血10 mL，不做抗凝處理，靜置4 h后用離心機離心10 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，收集血清分裝后，再次離心5 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min。收集上清液后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 血清指標的檢測

各時間點血清樣品應(yīng)用多功能酶標儀(型號：SYNERGY2，美國BioTek公司)進行檢測，包括酮體指標(BHBA)、肝功能指標[NEFA、葡萄糖(glucose，GLU)、甘油三酯(triglyceride，TG)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，AST)]、蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀況指標[總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)和球蛋白(globulin，GLO)]及生殖激素指標[雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P4)、促卵泡素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和促黃體素(luteinizing hormone，LH)]。其中，GLU濃度應(yīng)用葡萄糖氧化酶法進行檢測，試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司(批號：1023-01-01-07)；其余指標應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法檢測，試劑盒購自江蘇酶標生物科技有限公司(BHBA批號：MB-9690A；NEFA批號：MB-5201A；TG批號：MB-4922A；AST批號：MB-9689SA；TP批號：MB-9693A；ALB批號：MB-9688A；GLO批號：MB-4899A；E2批號：MB-2163A；P4批號：MB-4772A；FSH批號：MB-5413A；LH批號：MB-5289A)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗應(yīng)用SPSS 26.0軟件對各時間點數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，其中各時間點間的比較應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以平均值±標準差(mean±SD)表示；對圍產(chǎn)期(產(chǎn)前28 d至產(chǎn)后28 d)的BHBA濃度和生殖激素指標之間應(yīng)用雙變量相關(guān)的方法進行相關(guān)性分析，以皮爾遜相關(guān)系數(shù)(R)表示。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酮體指標檢測結(jié)果

根據(jù)表1可知，試驗?zāi)戈笈Ｑ錌HBA濃度自分娩當天開始升高，并在產(chǎn)后第7天達到峰值，產(chǎn)后第14天開始下降，產(chǎn)后第21天恢復(fù)至產(chǎn)前水平。分娩當天、產(chǎn)后第7天和產(chǎn)后第14天的血清BHBA濃度顯著高于其他各時間點(P<0.05)。以上結(jié)果表明，試驗?zāi)戈笈Ｔ诋a(chǎn)后第0～14天可能發(fā)生了能量負平衡。

表1 試驗動物血清BHBA濃度檢測結(jié)果

2.2 肝功能指標檢測結(jié)果

根據(jù)表2可知，試驗?zāi)戈笈Ｑ錑LU濃度在分娩當天開始降低，并隨著產(chǎn)后時間的推移逐漸升高。分娩當天、產(chǎn)后第7天和產(chǎn)后第14天的血清GLU濃度顯著低于產(chǎn)前各時間點(P<0.05)。

表2 試驗動物血清肝功能指標檢測結(jié)果

試驗?zāi)戈笈Ｑ錘EFA濃度在產(chǎn)后第7天達到峰值，產(chǎn)后第14天開始下降，產(chǎn)后第21天恢復(fù)至產(chǎn)前水平。產(chǎn)后第7天和產(chǎn)后第14天的血清NEFA濃度顯著高于其他各時間點(P<0.05)。

血清AST活性在分娩當天開始升高，并在產(chǎn)后第7天、產(chǎn)后第14天、產(chǎn)后第21天和產(chǎn)后第28天持續(xù)升高。分娩當天、產(chǎn)后第7天、產(chǎn)后第14天、產(chǎn)后第21天和產(chǎn)后第28天的血清AST活性顯著高于產(chǎn)前各時間點(P<0.05)。

血清TG濃度在當天達到峰值，產(chǎn)后開始降低，并低于產(chǎn)前。產(chǎn)后第21天和產(chǎn)后第28天的血清TG濃度顯著低于其他各時間點(P<0.05)。

以上結(jié)果表明，試驗?zāi)戈笈７置鋾r消耗大量糖類，分娩后血清GLU濃度伴隨機能恢復(fù)而提高。分娩使母牦牛的能量大量消耗，機體通過過度的脂肪動員為其供能，這也是在分娩當天開始產(chǎn)生大量BHBA的原因，進一步說明試驗?zāi)戈笈Ｔ诋a(chǎn)后可能發(fā)生能量負平衡的推論，進而引起了機體的代謝障礙。

2.3 蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀況指標的檢測結(jié)果

根據(jù)表3可知，試驗?zāi)戈笈Ｑ錞P濃度自分娩當天開始升高，至產(chǎn)后第14天達到峰值，雖然在產(chǎn)后第21天有所降低，但仍高于產(chǎn)前。分娩當天、產(chǎn)后第7天、產(chǎn)后第14天、產(chǎn)后第21天和產(chǎn)后第28天的血清TP濃度顯著高于產(chǎn)前各時間點(P<0.05)。

表3 試驗動物血清蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀況指標檢測結(jié)果

血清ALB濃度在產(chǎn)后第7天達到峰值，雖然在產(chǎn)后第21天有所降低，但仍高于產(chǎn)前。產(chǎn)后各時間點的血清ALB濃度無顯著差異(P>0.05)，產(chǎn)后第7天、產(chǎn)后第14天和產(chǎn)后第28天的血清ALB濃度顯著高于分娩當天和產(chǎn)前各時間點(P<0.05)。

血清GLO濃度從分娩當天至產(chǎn)后第14天緩慢升高，在產(chǎn)后第21天降至最低。產(chǎn)后第14天的血清GLO濃度顯著高于其他各時間點(P<0.05)。

以上結(jié)果表明，試驗?zāi)戈笈C體在產(chǎn)后蛋白質(zhì)濃度整體升高，表明機體蛋白質(zhì)代謝也參與了能量供給。

2.4 生殖激素指標的檢測結(jié)果

通過對母牦牛從產(chǎn)前第28到產(chǎn)后第49天進行跟蹤式監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，試驗?zāi)戈笈＝?jīng)過休情期之后仍未出現(xiàn)發(fā)情行為。

根據(jù)表4可知，試驗?zāi)戈笈Ｑ錚4、FSH和LH濃度在產(chǎn)后均維持在較高水平，血清E2濃度在產(chǎn)后逐漸降低并在產(chǎn)后第49天略有升高。分娩當天和產(chǎn)后各時間點的血清FSH和LH濃度顯著高于產(chǎn)前各時間點(P<0.05)。

表4 試驗動物血清生殖激素指標濃度檢測結(jié)果

以上結(jié)果表明，試驗?zāi)戈笈Ｔ诋a(chǎn)后乏情可能與生殖激素發(fā)生紊亂有關(guān)。

2.5 圍產(chǎn)期酮體與生殖激素指標相關(guān)性分析的結(jié)果

根據(jù)表5可知，血清BHBA濃度與E2濃度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與P4和LH濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與FSH濃度不相關(guān)(P>0.05)。血清E2濃度與P4和LH濃度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與FSH濃度不相關(guān)(P>0.05)。血清P4濃度與FSH、LH濃度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。血清FSH濃度與LH濃度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

表5 試驗動物圍產(chǎn)期血清酮體與生殖激素指標相關(guān)性分析

以上結(jié)果表明，試驗?zāi)戈笈Ｑ錌HBA濃度影響了后期生殖激素的分泌，由此推測高原地區(qū)母牦牛圍產(chǎn)后期發(fā)生能量負平衡影響了生殖激素的分泌模式，導(dǎo)致其產(chǎn)犢間隔延長，進而引起繁殖率低下。

3 討 論

牦牛營養(yǎng)代謝是影響其繁殖性能的主要原因之一，而圍產(chǎn)期營養(yǎng)代謝與牦牛繁殖性能的關(guān)系尚未明確。酮體是脂肪代謝產(chǎn)物之一，也是機體發(fā)生能量負平衡時的代謝產(chǎn)物[11-12]，可以作為判定能量負平衡的指標。本研究對試驗?zāi)戈笈a(chǎn)期血清酮體、肝功能指標、蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀況指標和生殖激素指標進行跟蹤式監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗?zāi)戈笈Ｔ趪a(chǎn)后期發(fā)生了能量負平衡，并伴隨糖類、脂類及蛋白質(zhì)代謝的異常。另外，研究還發(fā)現(xiàn)試驗牦牛產(chǎn)后E2和LH分泌發(fā)生異常，且與BHBA濃度呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，說明能量負平衡的發(fā)生影響了生殖激素的分泌模式，這與Tsukamura等[13]的研究結(jié)果一致。

3.1 牦牛圍產(chǎn)期酮體的消長規(guī)律

母畜由于分娩消耗機體大量的能量，產(chǎn)犢后碳水化合物加速代謝，一方面補充分娩時的能量消耗，另外一方面為乳汁合成供能。當機體消耗量大于供給量時，就會發(fā)生能量負平衡[14]。在本研究中，試驗?zāi)戈笈Ｔ诜置洚斕煅錑LU濃度降低，說明試驗?zāi)戈笈７置鋾r血清GLU的代謝消耗提高。在機體GLU濃度降低時，原本進入到三羧酸循環(huán)消耗GLU的草酰乙酸參與到糖異生過程合成GLU[15]。與此同時，機體會動員脂肪以繼續(xù)提供能量，在這過程中會產(chǎn)生大量的NEFA[16-17]，而NEFA濃度升高與能量負平衡有關(guān)[18]。母牦牛產(chǎn)后第7～14天血清NEFA濃度達到了峰值，并且血清TG濃度降低，說明試驗?zāi)戈笈０l(fā)生能量負平衡，且機體在GLU濃度低時，動員脂肪以提供能量。根據(jù)試驗結(jié)果可知，血清TG濃度的降低持續(xù)至圍產(chǎn)期結(jié)束，且低于產(chǎn)前，這說明母牦牛在產(chǎn)后發(fā)生著過度的脂肪動員。脂肪動員中產(chǎn)生大量的乙酰輔酶A，當大量的草酰乙酸參與到糖異生時，乙酰輔酶A同樣無法進入三羧酸循環(huán)中，進而轉(zhuǎn)向其他途徑，其中之一就是生成酮體[19]。在奶牛的研究中，圍產(chǎn)后期常發(fā)生能量負平衡，酮體的產(chǎn)生是診斷能量負平衡的金標準。當血清BHBA濃度高于1.2 mmol/L時，則認定奶牛發(fā)生了能量負平衡[20-21]。雖然在母牦牛的研究中，沒有相關(guān)的標準對是否處于能量負平衡進行判定，但是試驗?zāi)戈笈Ｗ苑置溟_始直至產(chǎn)后14 d，BHBA濃度急劇升高，峰值達到1.961 mmol/L，也能夠說明母牦牛在圍產(chǎn)后期發(fā)生著能量負平衡。另外，血清GLU和TG濃度的降低，NEFA濃度的升高，也說明母牦牛機體內(nèi)發(fā)生了代謝變化。蛋白質(zhì)是動物機體供能的最后來源。脂肪過度消耗后，機體會通過減弱脂肪分解而加強蛋白質(zhì)分解代謝來維持生存[22]。本研究中，試驗?zāi)戈笈．a(chǎn)后體內(nèi)血清TP、ALB、GLO濃度升高，說明產(chǎn)后試驗?zāi)戈笈ｓw內(nèi)的糖類與脂肪為其供能不足，蛋白質(zhì)也參與了供能過程。

3.2 圍產(chǎn)期酮體對生殖激素分泌的影響

為了探究母牦牛圍產(chǎn)期酮體生成后對其生殖激素分泌的影響，本研究還對圍產(chǎn)期母牦牛主要生殖激素指標和發(fā)情情況進行了監(jiān)測，并對BHBA濃度與生殖激素指標進行了相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗?zāi)戈笈Ｔ诋a(chǎn)后E2和LH分泌異常，并未出現(xiàn)發(fā)情的分泌模式，這可能是試驗牦牛未表現(xiàn)發(fā)情的原因。另外，BHBA濃度分別與E2、P4和LH濃度存在相關(guān)性，說明血液BHBA濃度的改變直接或間接影響生殖激素的分泌。雖然BHBA濃度與P4濃度呈顯著正相關(guān)，但P4產(chǎn)后的分泌模式并未表現(xiàn)異常，這可能是由于能量缺乏會造成孕酮分泌量的下降而產(chǎn)生的相關(guān)性[23]。LH的主要作用是促進卵泡生長與成熟，并誘導(dǎo)排卵[24]，但當機體發(fā)生能量負平衡時，體內(nèi)蓄積的BHBA會抑制LH的脈沖頻率，而產(chǎn)后早期脈沖式LH的分泌對于排卵前卵泡的生長、E2的分泌以及優(yōu)勢卵泡的排卵是非常重要的[25-26]。E2主要是促進雌性動物器官成熟及第二性征出現(xiàn)，并維持發(fā)情周期的變化和生殖活動[27]。研究發(fā)現(xiàn)，嚴重的能量負平衡會通過降低卵泡E2含量而降低卵泡的功能，使得卵泡的排卵滯后[26,28]。在對生殖激素和發(fā)情表現(xiàn)持續(xù)跟蹤監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，母牦牛的生殖激素仍分泌異常，且直至產(chǎn)后第49天母牦牛仍沒有發(fā)情表現(xiàn)。有研究表明，牦牛的受胎率和營養(yǎng)水平是呈正相關(guān)的[29]。這可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)補充不足引起了能量負平衡，進而影響牦牛生殖激素的分泌模式，使牦牛在分娩后首次排卵時間間隔延長，休情期后不發(fā)情，導(dǎo)致繁殖性能低下[30-31]。這也可能是營養(yǎng)供給不足影響母牦牛繁殖力低下的一個主要原因，但具體發(fā)生機制需要進一步驗證。

4 結(jié) 論

本研究首次對青海地區(qū)圍產(chǎn)期母牦牛血清酮體及相關(guān)指標進行檢測，通過數(shù)據(jù)分析得出圍產(chǎn)期母牦牛血清酮體濃度的變化規(guī)律，并發(fā)現(xiàn)母牦牛分娩造成其機體能量的大量流失，導(dǎo)致機體脂肪過度動員產(chǎn)生了能量負平衡。能量負平衡的發(fā)生能夠通過影響生殖激素的分泌模式，進而導(dǎo)致母牦牛繁殖率低下。