金宇航 麻 柱 高 鐸 單 強(qiáng) 張亞靜 楚康康 孫 鵬*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193； 2. 北京奶牛中心，奶牛遺傳育種與繁殖北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102101)

犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育和健康狀況對(duì)其成年后泌乳性能的發(fā)揮具有深遠(yuǎn)影響。因此，增進(jìn)犢牛健康、降低犢牛疾病發(fā)生率及提高犢牛生長(zhǎng)性能對(duì)于提高奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。當(dāng)前奶牛養(yǎng)殖中，新生犢牛腹瀉仍然是導(dǎo)致犢牛死亡的主要原因之一，通常是由病毒、細(xì)菌或寄生蟲引起的傳染病[1-3]。在犢牛階段，特別是新生及斷奶前后，犢牛腹瀉的流行性、發(fā)生率及病死率都極高，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。

鋅是動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一，廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)和大部分細(xì)胞器中，機(jī)體內(nèi)超過300種酶發(fā)揮作用均需要鋅的參與[5]。此外，機(jī)體許多生物進(jìn)程都對(duì)鋅具有依賴性，如鋅可維持細(xì)胞膜穩(wěn)定、參與基因表達(dá)和作為細(xì)胞信號(hào)[6]。研究表明，鋅可以改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，提高免疫力，有效緩解腹瀉[7]。給斷奶仔豬飼糧中添加高劑量氧化鋅可促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)，提高仔豬免疫力，有效緩解斷奶后腹瀉[8]。然而，動(dòng)物飼喂過量的鋅添加劑，可能會(huì)隨著動(dòng)物排泄而進(jìn)入環(huán)境中造成污染。因此，我國(guó)目前已明令禁止使用高鋅。最新修訂的中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2625號(hào)公告《飼料添加劑安全使用規(guī)范》中明確規(guī)定，犢牛代乳料中鋅含量不得超過180 mg/kg。前期研究發(fā)現(xiàn)，給新生至2周齡犢牛補(bǔ)充低劑量鋅可有效緩解腹瀉，提高平均日增重(average daily gain，ADG)[9-10]；同時(shí)，補(bǔ)鋅可以提高犢牛腸道內(nèi)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)能力，降低腸道通透性，保護(hù)腸道屏障功能[10-12]。另有研究表明，鋅可以增加犢牛胸腺、脾臟等免疫器官重量，參與補(bǔ)體反應(yīng)，提高B淋巴細(xì)胞產(chǎn)免疫球蛋白的能力，提高犢牛免疫功能[10，13]。此外，鋅在機(jī)體內(nèi)還有一定的抑菌作用[14-15]。

蛋白鋅是以大豆分離蛋白和無機(jī)鋅為反應(yīng)原料制備的一種具有較強(qiáng)螯合強(qiáng)度的新型飼料添加劑。與傳統(tǒng)無機(jī)或有機(jī)鋅相比，蛋白鋅具有適中的螯合強(qiáng)度和更高的生物學(xué)效價(jià)，從而可有效減少鋅排放到環(huán)境造成污染[16]。以往關(guān)于鋅對(duì)動(dòng)物影響的研究多集中于傳統(tǒng)無機(jī)鋅和有機(jī)鋅，有關(guān)蛋白鋅對(duì)犢牛方面作用的報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)旨在研究蛋白鋅和氧化鋅對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥ＩL(zhǎng)性能、腹瀉情況、抗氧化性能、免疫功能以及血漿中微量元素含量的影響，為蛋白鋅在犢牛早期飼養(yǎng)中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

氧化鋅，純度為96.64%。蛋白鋅，純度為15.30%，以大豆分離蛋白和無機(jī)鋅制備，螯合強(qiáng)度為327。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)于2019年12月至2020年3月在北京奶牛中心延慶基地良種場(chǎng)進(jìn)行。選取60頭出生健康、體重相近的新生荷斯坦?fàn)倥＃瑺倥２墒车呐Ｄ虨楸本┠膛Ｖ行难討c基地良種場(chǎng)自產(chǎn)牛奶，開食料為北京首農(nóng)畜牧科技發(fā)展有限公司飼料分公司生產(chǎn)的顆粒狀犢牛開食料。開食料及牛奶的營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 開食料及牛奶的營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選取出生日期、體重[(41.35±0.63) kg]一致的健康荷斯坦?fàn)倥?0頭，隨機(jī)分成5個(gè)組，每組12頭牛，其中公犢牛3頭，母犢牛9頭。對(duì)照組(CON組)飼喂牛奶，低劑量蛋白鋅組(L-ZnP組)、中劑量蛋白鋅組(M-ZnP組)和高劑量蛋白鋅組(H-ZnP組)在牛奶中分別添加261.44、522.88、784.31 mg/d蛋白鋅(鋅含量相當(dāng)于40、80、120 mg/d)，氧化鋅組(ZnO組)在牛奶中添加232.11 mg/d氧化鋅(鋅含量相當(dāng)于180 mg/d)。根據(jù)犢牛生長(zhǎng)狀況，于4～7日齡從產(chǎn)房轉(zhuǎn)入犢牛島單獨(dú)飼養(yǎng)，并開始飼喂開食料。飼喂開食料前每天喂奶3次(06:00、14:00、18:00)，每次1.5 L；飼喂開食料后每天喂奶2次(06:00、18:00)，每次4 L。犢牛自由飲水，自由采食開食料，每日記錄采食情況。試驗(yàn)期14 d。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 牛奶和開食料

每周采集牛奶和開食料樣品，-20 ℃保存。采用乳成分分析儀(MilkoScanTMFT6000)測(cè)定牛奶密度及乳蛋白、乳脂肪、乳糖、總固形物(total solids，TS)、非脂乳固體含量(solids non-fat，SNF)含量。采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測(cè)定牛奶和開食料中的鋅含量(GB 5009.268—2016)。測(cè)定開食料中干物質(zhì)[AOAC(2005)，方法930.15]、粗蛋白質(zhì)[AOAC(2000)，方法976.05]、粗脂肪[AOAC(2003)，方法4.5.05]、粗灰分(GB/T 6438—1992)含量。開食料中中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量參照Van Soest等[17]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 生長(zhǎng)性能和糞便指數(shù)

犢牛出生及14日齡晨飼前空腹稱重，計(jì)算平均日增重。記錄每日牛奶和開食料采食量，計(jì)算平均日采食量(average daily intake，ADFI)和料重比(feed to gain ratio，F(xiàn)/G)。

試驗(yàn)過程中，每天早、晚2次觀察犢牛腹瀉情況，觀察時(shí)對(duì)犢牛的糞便進(jìn)行評(píng)分，并計(jì)算糞便指數(shù)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：糞便正常、圓柱形記0分；輕微稀軟、有形記,1分；腹瀉，糞便黏稠、不成形、水分含量高記,2分；嚴(yán)重腹瀉，糞便呈液態(tài)、不成形、水樣稀糞記,3分。糞便指數(shù)計(jì)算公式如下：

糞便指數(shù)=糞便評(píng)分之和/犢?？傤^數(shù)。

1.4.3 血液樣品的采集與指標(biāo)檢測(cè)

在犢牛14日齡晨飼前進(jìn)行頸靜脈采血，每頭犢牛分別用血清管和血漿管各采集血液樣品約10 mL，室溫靜置10 min，3 000×g、4 ℃離心15 min后，制備血清和血漿，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血清中免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA；產(chǎn)品編號(hào)：JYM0099Bo)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG；產(chǎn)品編號(hào)：JYM0009Bo)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM；產(chǎn)品編號(hào)：JYM0031Bo)含量采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法，試劑盒購(gòu)于武漢基因美科技有限公司，并嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行測(cè)定。血清中丙二醛(malondialdehyde，MDA；產(chǎn)品編號(hào)：A003-1)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD；產(chǎn)品編號(hào)：A001-3-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px；產(chǎn)品編號(hào)：A005-1-2)活性采用放射免疫法測(cè)定，試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，并嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行測(cè)定。樣品吸光度使用Y040多功能酶標(biāo)儀(Tecan infinite 200 Pro，Tecan公司，奧地利)測(cè)定。

血漿中銅、鐵、鋅、鈣、鎂、磷含量采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES 9000，Shimadzu公司，日本)測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.4軟件MIXED模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)模型中包含試驗(yàn)牛的隨機(jī)因素和試驗(yàn)處理的固定因素。采用Tukey’s法進(jìn)行多重比較，分別比較處理效應(yīng)、蛋白鋅劑量效應(yīng)以及鋅源效應(yīng)(M-ZnP組vs. ZnO組)。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥ＩL(zhǎng)性能及腹瀉情況的影響

由表2可知，各組之間開食料平均日采食量、平均日采食量及料重比均無顯著差異(P>0.05)。與CON組相比，M-ZnP組、H-ZnP組和ZnO組的平均日增重顯著升高(P<0.05)。與CON組相比，L-ZnP組、M-ZnP組、H-ZnP組和ZnO組的糞便指數(shù)顯著降低(P<0.05)。隨著蛋白鋅添加量的增加，糞便指數(shù)呈顯著線性、二次下降(P<0.05)。

表2 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥ＩL(zhǎng)性能和腹瀉情況的影響

2.2 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥Ｑ迕庖咧笜?biāo)的影響

由表3可知，各組之間血清IgA、IgM含量無顯著差異(P>0.05)。與CON組相比，M-ZnP組、H-ZnP組和ZnO組的血清IgG含量顯著升高(P<0.05)。隨著蛋白鋅添加量的增加，血清IgG含量呈顯著線性升高(P<0.05)。

表3 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥Ｑ迕庖咧笜?biāo)的影響

2.3 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥Ｑ蹇寡趸笜?biāo)的影響

由表4可知，各組之間血清MDA含量、SOD活性無顯著差異(P>0.05)。與CON組相比，M-ZnP組、H-ZnP組和ZnO組的血清GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。隨著蛋白鋅添加量的增加，血清GSH-Px活性呈顯著線性升高(P<0.05)，血清MDA含量呈顯著線性下降(P<0.05)。

表4 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥Ｑ蹇寡趸笜?biāo)的影響

2.4 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥Ｑ獫{微量元素含量的影響

由表5可知，各組之間血漿鈣、銅、鐵、酶、磷含量無顯著差異(P>0.05)。與CON組相比，M-ZnP組、H-ZnP組和ZnO組的血漿鋅含量顯著升高(P<0.05)。隨著蛋白鋅添加量的增加，血漿鋅含量呈顯著線性升高(P<0.05)。此外，與ZnO組相比，M-ZnP組的血漿銅、磷含量均顯著降低(P<0.05)。

表5 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥Ｑ獫{微量元素含量的影響

3 討 論

3.1 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥ＩL(zhǎng)性能的影響

犢牛平均日采食量、平均日增重是評(píng)價(jià)生長(zhǎng)性能的重要指標(biāo)。蛋白鋅是接近于動(dòng)物體內(nèi)天然形態(tài)的微量元素補(bǔ)充劑，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生化穩(wěn)定性，生物利用率高，抗干擾性強(qiáng)，毒性小，具有良好的促生長(zhǎng)作用[18]。以往研究表明，滿1歲的肉牛每日補(bǔ)充飼喂1.0 g蛋白鋅可顯著提高平均日增重[19]。與飼喂基礎(chǔ)飼糧的對(duì)照組相比，給斷奶仔豬飼喂300或450 mg/kg蛋白鋅可顯著提高生長(zhǎng)性能，且與飼喂飼糧中含有2 000 mg/kg氧化鋅的斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能相似[20]。與無機(jī)鋅相比，有機(jī)鋅更有利于增加犢牛體重，其原因可能與有機(jī)鋅具有更高的生物利用率有關(guān)[10-13，21]。在本試驗(yàn)中，給新生犢牛飼喂中、高劑量蛋白鋅和氧化鋅均可顯著提高犢牛平均日增重，且氧化鋅與蛋白鋅對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能的影響無顯著差異。

3.2 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥８篂a的影響

腹瀉是新生犢牛易發(fā)且高發(fā)的疾病，對(duì)犢牛的健康生長(zhǎng)及成年后生產(chǎn)性能和繁殖性能都有長(zhǎng)遠(yuǎn)的影響，關(guān)系著牧場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。預(yù)防犢牛腹瀉是犢牛生產(chǎn)管理的重中之重。以往研究表明，與無機(jī)鋅相比，飼喂有機(jī)鋅可使?fàn)倥８篂a的風(fēng)險(xiǎn)降低14.7%[22]。本團(tuán)隊(duì)前期研究也表明，給新生犢牛飼喂相同含量的鋅，有機(jī)鋅源較無機(jī)鋅源更能有效緩解腹瀉[9-13]。鑒于2017年新修訂的《飼料添加劑安全使用規(guī)范》中限定了以氧化鋅形式添加入犢牛代乳料中的鋅含量不得高于180 mg/kg，本試驗(yàn)比較適宜劑量蛋白鋅是否具備與上限劑量氧化鋅相似或更優(yōu)的作用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CON組相比，L-ZnP組、M-ZnP組、H-ZnP組和ZnO組的糞便指數(shù)顯著降低，說明不同劑量蛋白鋅和氧化鋅均能改善犢牛腹瀉情況。蛋白鋅可有效緩解犢牛腹瀉，且在本試驗(yàn)條件下，達(dá)到相同效果所需要的蛋白鋅劑量遠(yuǎn)低于氧化鋅劑量。

3.3 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥Ｑ迕庖咧笜?biāo)的影響

IgG、IgM、IgA是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)，其含量多少與犢牛的免疫力密切相關(guān)。其中，IgM在機(jī)體免疫和感染中最先出現(xiàn)；IgA由B淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生，是外分泌液中的主要抗體[23]，也是動(dòng)物機(jī)體含量最多的免疫球蛋白[24]。IgG為體液免疫的主要抗體，主要存在于血清中，具有抗細(xì)菌、抗病毒及中和毒素等免疫作用[25]。前期研究發(fā)現(xiàn)，氧化鋅有利于提高犢牛血清IgG含量，提高犢牛免疫功能[10，13]。且給1～14日齡犢牛每日飼喂不同低劑量氧化鋅后，血清中IgG、IgA及IgM含量呈線性增加[14]。通過補(bǔ)鋅可以有效促進(jìn)新生犢牛的免疫應(yīng)答，進(jìn)而緩解犢牛腹瀉。本試驗(yàn)中，添加不同劑量蛋白鋅和氧化鋅均提高了犢牛血清IgG含量，說明蛋白鋅亦有利于提高犢牛免疫功能。

3.4 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥Ｑ蹇寡趸笜?biāo)的影響

動(dòng)物機(jī)體自由基產(chǎn)生與清除通常處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體受到自身或外來因素刺激時(shí)，動(dòng)態(tài)平衡被破壞，引發(fā)氧化應(yīng)激，會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，誘導(dǎo)生物膜上的多不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA。所以，MDA含量直接反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度[26]。機(jī)體存在脂質(zhì)過氧化自由基產(chǎn)物，同樣存在著清除自由基的酶促系統(tǒng)，主要的抗氧化酶有SOD和GSH-Px等[27]。Wei等[9]研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼糧中氧化鋅含量的增加，犢牛血清SOD活性線性升高，而血清MDA含量線性下降。同時(shí)，飼糧添加有機(jī)鋅可有效提高血清SOD和GSH-Px活性，且同等鋅含量時(shí)添加有機(jī)鋅效果優(yōu)于無機(jī)鋅[28-30]。本研究結(jié)果同樣表明，與CON組相比，M-ZnP組、H-ZnP組和ZnO組的血清GSH-Px活性顯著升高，且隨著蛋白鋅添加量的增加，犢牛血清GSH-Px活性呈顯著線性升高，血清MDA含量呈顯著線性下降，說明蛋白鋅可有效提高新生犢牛的抗氧化能力。

3.5 不同鋅源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥Ｑ獫{微量元素含量的影響

飼糧經(jīng)腸道吸收，其中部分微量元素首先吸收進(jìn)入血液，因此血漿微量元素的含量可反映飼糧中鋅的吸收情況。有機(jī)微量元素的吸收率是無機(jī)微量元素的1.8～4.0倍，無機(jī)微量元素在動(dòng)物機(jī)體吸收過程中需要借助輔酶與氨基酸或其他物質(zhì)形成螯合物或絡(luò)合物，而有機(jī)微量元素可直接被腸道吸收，同時(shí)也可吸附到氨基酸、肽或其他化合物上后被吸收[31]。研究表明，血漿鋅含量隨飼糧中鋅含量的改變而波動(dòng)[32]。奶牛飼糧中添加90.15或130.15 mg/kg鋅較對(duì)照組(50.15 mg/kg鋅)相比，血漿鋅含量顯著增加[33]。與以往研究相似，本試驗(yàn)結(jié)果表明，M-ZnP組、H-ZnP組和ZnO組的血漿鋅含量顯著高于CON組和L-ZnP組，且隨著蛋白鋅添加量的增加，血漿鋅含量呈顯著線性升高。值得注意的是，H-ZnP組的血漿鋅含量在數(shù)值上高于ZnO組，在一定程度上表明蛋白鋅的利用率高于氧化鋅，可能更適宜機(jī)體吸收。

微量元素在動(dòng)物組織器官中含量很少，但對(duì)維持動(dòng)物正常的生理功能、參與機(jī)體正常的新陳代謝、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和健康有重要的作用。但單一微量元素添加量過高，可能與飼糧或體內(nèi)其他微量元素之間形成拮抗作用，造成營(yíng)養(yǎng)吸收的不足[34-35]。目前，已知鈣、磷、銅等與鋅之間存在拮抗作用，其中1種微量元素含量的增加或減少會(huì)引起其余微量元素含量的波動(dòng)[36]。研究表明，腸道中金屬硫蛋白的合成隨飼糧鋅含量的增加而增加，因此當(dāng)動(dòng)物采食鋅含量較高的飼糧時(shí)，腸道中金屬硫蛋白含量增加，較多的金屬硫蛋白與銅結(jié)合，并隨腸道上皮細(xì)胞表皮的脫落而從糞中排出，可能引起機(jī)體對(duì)銅的吸收有所降低。然而只有當(dāng)飼糧中鋅含量處于較高水平才會(huì)產(chǎn)生對(duì)銅吸收的抑制，在奶牛飼糧中補(bǔ)鋅2 000 mg/kg，血漿銅含量降低，而補(bǔ)鋅1 000 mg/kg不會(huì)出現(xiàn)血漿銅含量下降的現(xiàn)象[37]。在本研究結(jié)果中，與ZnO組相比，M-ZnP組的血漿銅、磷含量均顯著降低，說明鋅與銅、磷在機(jī)體中的吸收可能存在競(jìng)爭(zhēng)作用，但其波動(dòng)均處于機(jī)體需要的正常范圍[38]，具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① 蛋白鋅可增加犢牛平均日增重，并有助于提高犢?？寡趸δ芗懊庖吖δ?，改善犢牛腹瀉情況。

② 中劑量蛋白鋅即可顯著提高犢牛血漿鋅含量，且其添加效果與氧化鋅相當(dāng)，說明蛋白鋅具有較高的生物利用率。

③ 在本試驗(yàn)條件下，綜合考慮試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際生產(chǎn)的情況，蛋白鋅添加量以522.88 mg/d(鋅含量相當(dāng)于80 mg/d)為宜。