楊占濤 孔凡林* 王吉東 姚 琨 韓 強 王 良 李亞君 劉 輝 李勝利**

(1.中國農業(yè)大學動物科學技術學院，動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京100193；2.康瑞(山東) 農業(yè)發(fā)展有限公司，濰坊261000；3.馥蒂同創(chuàng)(北京)科技有限公司，北京100085； 4.加拿大拉曼公司北京代表處，北京100102)

適宜的環(huán)境條件是保障奶牛生產性能的關鍵性條件。研究表明，荷斯坦奶牛在5～25 ℃時生產性能最佳，溫度過高會引起奶牛熱應激，進而降低奶牛的產奶性能。在夏季高溫高濕的環(huán)境下，荷斯坦奶牛無法通過自主散熱來降低機體的體溫，極易產生熱應激[1-2]。因此，很多新型飼料添加劑被研發(fā)出來用以緩解奶牛熱應激。甜菜堿(betaine)又名三甲基甘氨酸，廣泛積累于耐鹽或干旱條件作物中[3-4]，最早是從甜菜制糖過程中分離出來的天然物質，目前已能人工合成[5]。甜菜堿在生物體內可以作為甲基供體，可以通過肝臟合成大量肉堿增強脂肪酸轉運，從而促進脂肪酸的β氧化。同時，甜菜堿還是滲透壓調節(jié)劑，可降低鈉鉀泵的運用，從而降低能量消耗，表現(xiàn)為降低產熱。研究表明，夏季高溫季節(jié)時奶牛飼糧中添加甜菜堿顯著降低熱休克蛋白70(HSP70)mRNA的表達量，從而使奶牛血液中HSP70含量顯著降低，因而緩解了奶牛的夏季熱應激[6]。而Peterson等[7]研究顯示，在奶牛飼糧中添加100 g/d的甜菜堿顯著提高了產奶量。

煙酰胺(nicotinamide)是一種B族維生素，在動物體內作為能量代謝的輔酶組成成分，參與碳水化合物和蛋白質的代謝，調控脂類的合成[8]。奶牛瘤胃在正常情況下可以通過體內色氨酸等物質合成煙酰胺，無需在飼糧中額外添加，但隨著飼糧中精料比例的增加、飼料加工過程對飼糧中煙酰胺和色氨酸破壞等因素，可能導致奶牛煙酸缺乏，如果不及時給予補充，就會影響其產奶量，甚至會發(fā)生酮病[9-10]。煙酸是煙酰胺的前體物質，在小腸中轉化為煙酰胺從而發(fā)揮作用。有研究顯示，在熱應激奶牛的飼糧中添加煙酸使奶牛的血管舒張，增加HSP70 mRNA的表達量，從而導致體溫降低，緩解熱應激[11-12]。孫先枝等[13]研究顯示，在熱應激奶牛飼糧中添加8 g/d的煙酰胺顯著降低了奶牛血清中的非酯化脂肪酸(NEFA)、β-羥基丁酸(BHBA)等含量，對熱應激環(huán)境下奶牛維持電解質平衡有積極作用。王金新等[14]給高產奶牛和中產奶牛補飼煙酰胺舔磚，結果顯示，與對照組相比，試驗組產奶量分別提高了14.32%和7.29%。

綜上所述，甜菜堿和煙酰胺對緩解奶牛熱應激和提高奶牛生產性能都有一定的作用，它們均可以調控脂肪的代謝，降低奶牛血液中NEFA含量，從而保持機體能量的平衡。但兩者的代謝途徑有所不同，甜菜堿是作為甲基供體通過促進脂肪酸的氧化來調控[6]，而煙酰胺則是通過促進脂質的合成來調控[15]，但是關于兩者的組合效應目前尚未見報道。因此，本試驗通過在夏季熱應激奶牛飼糧中添加甜菜堿與煙酰胺復合制劑，旨在探究其對熱應激奶牛生產性能、乳品質及血清生化指標的影響，為其在奶牛生產中的應用提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗使用的甜菜堿與煙酰胺復合制劑產品購于山東某農業(yè)發(fā)展有限公司，其主要成分為甜菜堿和煙酰胺，其中甜菜堿含量≥70%，煙酰胺含量≤10%，過瘤胃率≥80%。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗選取體況良好及泌乳天數(shù)[(180±26) d]、胎次[(2.3±0.6)胎]、產奶量[(36.6±5.5) kg]相近的荷斯坦奶牛45頭，隨機分為3組，每組15個重復，每個重復1頭牛。對照組(CON組)飼喂基礎飼糧，低劑量組(LD組)在基礎飼糧的基礎上添加30 g/d的甜菜堿與煙酰胺復合制劑，高劑量組(HD組)在基礎飼糧的基礎上添加60 g/d的甜菜堿與煙酰胺復合制劑。預試期5 d，正試期30 d。

試驗于2020年7月中旬至2020年8月中旬在中國農業(yè)大學奶牛營養(yǎng)創(chuàng)新團隊試驗基地(金銀島基地)進行。甜菜堿與煙酰胺復合制劑于每天07:00、14:00、19:00按照牧場每日早、中、晚投料比例(4∶3∶3)均勻地撒在基礎飼糧中。其他飼養(yǎng)管理同養(yǎng)殖場內管理一致?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(鮮重基礎)

續(xù)表1項目 Items含量 Content酸性洗滌纖維ADF17.80淀粉 Starch25.95粗脂肪 EE4.67

1.3 樣品采集與測定指標

1.3.1 牛舍溫濕度指數(shù)的測定與統(tǒng)計

試驗期間，在每天08:00、14:00和20:00分別測定牛舍內前、中、后距離地面1.5 m處，共6個固定點的溫度和相對濕度，并計算每天的溫濕度指數(shù)，計算公式[16]為：

THI=(1.8×T+32)-(0.55-0.005 5×RH)(1.8×T-26)。

式中：THI為溫濕度指數(shù)；T為溫度(℃)；RH為相對濕度(%)。

1.3.2 干物質采食量(DMI)、產奶量以及乳品質測定

試驗期間，每天通過全自動全混合日糧(TMR)混料車進行混料，投料時記錄每天早、中、晚的投料量，在第2天06:30之前，分別清理3組的剩料量并稱重，計算3組試驗牛的采食量，并計算干物質采食量。記錄每天每頭牛的產奶量，計算各組第1～15天、第16～30天及第1～30天的產奶量。

在試驗期的第1天、第15天、第30天分別在06:30、13:30、20:30采集3組試驗牛奶樣，并按4:3:3比例混勻在50 mL的離心管中，加入防腐劑，4 ℃保存，次日送至北京奶牛中心，使用乳成分體細胞數(shù)聯(lián)機測定儀(YQ1-57)進行測定。依據(jù)NY/T 2659—2014方法檢測乳脂率、乳蛋白率和乳糖率，依據(jù)ZD-70-2015方法檢測乳中尿素氮(UN)含量，依據(jù)NY/T 800—2004方法檢測乳中體細胞數(shù)(×103個/mL)。4%乳脂校正乳(4%FCM)產量計算公式為：

4%FCM(kg)=M×(0.4+0.15×F)。

式中：M為產奶量(kg)；F為乳脂率(%)。

1.3.3 血清生化指標的測定

在試驗的第1天、第15天、第30天，從每組隨機選取9頭牛尾根靜脈采血10 mL，在4 ℃、3 000 r/min的條件下離心15 min后取出血清，-20 ℃保存待測。血清樣品送至北京萊博泰瑞科技發(fā)展公司進行測定。胰島素(INS)含量使用BFM-96型放射免疫計數(shù)器(眾成機電技術有限公司)運用放射免疫分析法測定；血清葡萄糖(GLU)、UN、總膽紅素(T-BIL)、NEFA、BHBA、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CRE)含量以及谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性使用GF-D200型半自動生化分析儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)、722型分光光度計(山東高密彩虹分析儀器有限公司)，并運用比色法進行測定；HSP70含量采用試劑盒法(試劑盒購自北京萊博泰瑞科技發(fā)展有限公司)，使用美國Thermo Multiskan Ascent酶標儀進行測定。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗所得數(shù)據(jù)先通過Excel 2019進行初步整理后，用SAS 9.4軟件的單因素方差分析程序進行統(tǒng)計分析，并采用Turkey’s法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 牛舍溫濕度指數(shù)

試驗期間牛舍溫濕度指數(shù)變化如圖1所示。整個試驗期間的牛舍溫濕度指數(shù)基本高于70，表示試驗期間奶牛處于熱應激條件下。

圖1 牛舍溫濕度指數(shù)

2.2 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛干物質采食量和產奶量的影響

由表2可知，第16～30天，LH和HD組的干物質采食量顯著高于CON組(P<0.05)；第1～30天，HD組的干物質采食量顯著高于CON組(P<0.05)。第1～15天、第16～30天和第1～30天，LH和HD組的產奶量均顯著高于CON組(P<0.05)。第15天，LH和HD組的4%乳脂校正乳產量顯著高于CON組(P<0.05)。

表2 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛干物質采食量以及產奶量的影響

2.3 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛乳品質的影響

由表3可知，第15天，LH和HD組的乳脂率和乳蛋白率顯著高于CON組(P<0.05)；第30天，LD組的乳中UN含量顯著低于CON組(P<0.05)。各組乳糖率、乳中體細胞數(shù)在各時間點均差異不顯著(P>0.05)。

表3 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛乳品質的影響

續(xù)表3項目Items時間Time組別 GroupsCONLDHD均值標準誤SEMP值P-value尿素氮含量UN content/(mg/dL)第1天 Day 111.7911.8912.090.4570.96第15天 Day 1512.4912.0111.430.4580.65第30天 Day 309.75a6.69b8.55ab0.381<0.01體細胞數(shù)Somatic cell count/(×103個/mL)第1天 Day 158.4531.4363.916.8990.10第15天 Day 1559.5753.3337.927.7480.49第30天 Day 3080.0970.3362.098.0650.66

2.4 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛血清生化指標的影響

由表4可知，第15天，HD組的血清GLU含量顯著低于CON組(P<0.05)；第30天，LD和HD組的血清GLU含量顯著低于CON組(P<0.05)。第15天，LD和HD組的血清UN含量顯著低于CON組(P<0.05)。各組血清INS、NEFA、BHBA、HSP70、TP、ALB含量在各時間點均差異不顯著(P>0.05)。

表4 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛血清生化指標的影響

2.5 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛血清肝臟代謝指標的影響

由表5可知，第30天，LD和HD組的血清ALP活性顯著低于CON組(P<0.05)。第30天，HD組的血清CRE含量顯著低于CON組(P<0.05)。各組血清ALT、AST活性及T-BIL含量在各時間點均差異不顯著(P>0.05)。

表5 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛血清肝臟代謝指標的影響

3 討 論

3.1 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛干物質采食量及產奶量的影響

奶牛的干物質采食量受很多因素的影響，包括飼料適口性、外界環(huán)境、奶牛瘤胃充盈度、食糜外流速度以及奶牛健康狀況等[17-18]?，F(xiàn)一般將溫濕度指數(shù)=72作為判斷奶牛熱應激狀態(tài)的閾值[19]，并且每當溫濕度指數(shù)增加1個單位，產奶量就降低0.2 kg[20]。有研究表明，甜菜堿有一定的誘食作用，能夠促進奶牛的采食量。張麗等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在夏季熱應奶牛飼糧中添加15和20 g/d包膜甜菜堿，能夠顯著提高奶牛產奶量和采食量；李建國等[22]在奶牛飼糧中添加6和12 g/d的煙酸后發(fā)現(xiàn)，添加煙酸的試驗組產奶量顯著高于未添加煙酸的對照組。在本試驗中，在奶牛飼糧中分別添加30和60 g/d的甜菜堿與煙酰胺復合制劑后，奶牛干物質采食量和產奶量升高，說明飼糧中添加甜菜堿與煙酰胺復合制劑可以提高奶牛的生產性能。

3.2 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛乳品質的影響

乳成分是衡量牛奶質量的重要指標，其受高溫的影響尤為明顯。在本試驗中，第1天的乳蛋白率和乳脂率均較低，且乳脂率低于乳蛋白率，這可能是由于熱應激導致乳脂下降比例更高。有報道指出，當奶牛發(fā)生熱應激時，溫濕度指數(shù)每升高1個單位，乳脂和乳蛋白含量分別下降12和9 g[23]，這表明熱應激對乳脂的影響相對乳蛋白更大，這也是造成本試驗前期出現(xiàn)異常狀況的原因。樊曉京等[24]在奶牛飼糧中添加不同劑量的過瘤胃甜菜堿后，乳蛋白率和乳糖率有所升高，但差異不顯著；楊耐德等[25]在奶牛飼糧中添加不同劑量的煙酸，發(fā)現(xiàn)對乳蛋白率、乳糖率和乳脂率均無顯著影響。而本研究中，第15天的乳脂率和乳蛋白率均顯著提高，這可能是甜菜堿與煙酰胺復合制劑對乳品質的提高有著組合效果。乳脂率升高可能是因為飼糧中添加甜菜堿與煙酰胺復合制劑顯著提高了奶牛瘤胃中的丁酸含量以及乙酸/丙酸[26]，乙酸和丁酸在瘤胃中主要用來合成乳脂，因此牛奶中的乳脂率有所升高。甜菜堿與煙酰胺復合制劑中的甜菜堿作為生物體內優(yōu)良的甲基供體，與蛋氨酸的作用類似，因此在飼糧中添加甜菜堿與煙酰胺復合制劑可通過減少蛋氨酸轉甲基作用而引導蛋氨酸用于體蛋白或乳蛋白合成，這可能是本試驗中乳蛋白率升高的原因。

乳中UN含量在奶牛實際生產中有重要意義，通過乳中UN含量可以來評定奶牛飼糧中蛋白質利用率以及蛋白質與能量的配比關系[27]。有研究表明，血清UN含量與飼料氮利用率成反比[28]，在熱應激條件下，奶牛采食量下降，導致部分必需氨基酸攝入不足，就會導致部分蛋白質分解為氨基酸，使血清UN含量增加，從而引起乳中UN增加。本試驗結果顯示，第30天LD組的乳中UN含量顯著低于CON組，這說明飼糧添加甜菜堿與煙酰胺復合制劑有助于緩解奶牛熱應激。乳中的體細胞數(shù)是反映奶牛健康的直觀指標，主要來源于血液中的白細胞以及部分乳腺組織上皮細胞。奶牛受到熱應激時，乳房炎的患病率會增加，乳中的體細胞數(shù)也會隨之增加[29]。連紅[30]在熱應激奶牛的飼糧中添加甜菜堿后發(fā)現(xiàn)，試驗期間各組的乳中體細胞數(shù)均有下降。本試驗中，飼糧中添加甜菜堿與煙酰胺復合制劑后，第15天和第30天LH和HD組的乳中體細胞數(shù)與CON組相比都有不同程度地下降。綜上所述，在熱應激狀態(tài)下奶牛的飼糧中添加甜菜堿與煙酰胺復合制劑可提高乳脂率和乳蛋白率，并且顯著降低乳中UN含量，體細胞數(shù)也有一定程度地下降，對乳品質有著明顯的提高作用。

3.3 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛血清生化指標的影響

血清生化指標是判斷機體生理功能的重要參數(shù)，它能反映機體的代謝和健康[31]。血清GLU含量可以反映機體對糖的吸收和代謝，在INS和胰高血糖素的調節(jié)下，GLU的分解和合成處于動態(tài)平衡，GLU還是乳糖合成的前體物質，是乳腺上皮細胞合成乳蛋白和乳脂的底物[32-33]。血清TP、ALB含量可以反映動物機體蛋白質的吸收與合成狀況，而血清UN含量則可以反映蛋白質代謝狀況[34]。黃麗瑾[35]研究指出，奶牛正常的血清GLU含量為2.78～4.10 mmol/L。有研究顯示，熱應激狀態(tài)下機體敏感神經興奮，腎上腺皮質分泌功能增強，導致腎上腺素濃度升高，引起肝糖原分解并抑制INS的反應，從而使血清GLU含量升高[36]。在本試驗的第15天、第30天，CON組血清GLU含量已經超過正常范圍，這可能是熱應激導致的結果，但第30天LD和HD組的血清GLU含量顯著降低，這可能是由于甜菜堿與煙酰胺復合制劑中的煙酰胺促進了機體的脂質合成，從而引起機體能量消耗的增加。此外，第15天LD和HD組的血清UN含量顯著低于CON組，其原因可能與乳中UN含量降低的原因一致；而各組血清TP和ALB含量無顯著差異，說明甜菜堿與煙酰胺復合制劑對奶牛機體健康無不良影響。

血清NEFA和BHBA含量可以用來衡量體內能量平衡和能量動用狀況[37]。有研究表明，奶牛在圍產期由于能量負平衡引起了脂肪的動員，隨著脂肪組織和肝糖原消耗的增加，血清NEFA含量顯著增加[38]。本試驗中，第30天LD和HD組的血清BHBA含量有所降低，表明飼糧添加甜菜堿與煙酰胺復合制劑可減少脂肪組織和肝糖原的消耗。HSP70是熱休克蛋白家族中含量最豐富并且最為重要的熱休克蛋白，具有維持細胞蛋白自穩(wěn)，提高細胞對熱應激原的耐受性的功能，使細胞維持正常的生理功能[6]。有研究表明，HSP70基因在熱應激時會被激活，RNA聚合酶在轉錄調控因子的調解下迅速激活HSP70基因的啟動子，大量轉錄HSP70 mRNA進而合成HSP70，引起HSP70表達水平升高[39]。在本研究中，與CON組相比，第15天和第30天LD和HD組的血清HSP70含量有所降低，表明甜菜堿與煙酰胺復合制劑對奶牛熱應激有一定的緩解作用。

3.4 甜菜堿與煙酰胺復合制劑對熱應激奶牛血清肝臟代謝指標的影響

CRE是肌酸磷酸酯在肌肉和蛋白質代謝中的分解產物[14]，是反映機體蛋白質分解和肝臟氮素循環(huán)情況的指標，CRE含量的增加代表機體內蛋白質分解代謝活動增加[40]。有研究顯示，在熱應激條件下，奶牛血清CRE含量會升高[41]。本試驗結果顯示，第30天HD組的血清CRE含量顯著低于CON組，說明甜菜堿與煙酰胺復合制劑具有緩解熱應激的作用。ALP作為肝臟損傷的一個重要評估指標，在肝膽系統(tǒng)出現(xiàn)病變、膽汁淤積時，病變周圍的肝細胞過度釋放或者膽道梗阻導致其無法排入腸道而分泌入血，血清ALP活性就會升高[42]。AST和ALT作為肝臟代謝的重要指標，可有效反映反芻動物能量代謝轉運情況，當機體肝臟損傷時會顯著提高奶牛血清AST和ALT活性。T-BIL作為肝功能的重要指標，可分為直接膽紅素和間接膽紅素，兩者中任何一個含量升高都表明肝臟損傷。本試驗結果顯示，各組血清ALT、AST活性及T-BIL含量在各時間點均差異不顯著，第30天LD和HD組的血清ALP活性顯著低于CON組，說明飼糧添加甜菜堿與煙酰胺復合制劑不會導致奶牛肝臟的損傷。

4 結 論

① 飼糧中添加甜菜堿與煙酰胺復合制劑可提高熱應激奶牛的干物質采食量、產奶量和4%乳脂校正乳產量，改善乳品質及部分血清生化指標，有助于緩解奶牛熱應激。

② 本試驗條件下，為緩解奶牛熱應激，飼糧中甜菜堿與煙酰胺復合制劑的適宜添加量為30 g/d。