黃翠翠 周若鈺 沈媛媛 張瑞強(qiáng) 楊彩梅

(浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院·動物醫(yī)學(xué)院，浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 動物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程實(shí)驗(yàn)室，臨安311300)

隨著經(jīng)濟(jì)社會的快速發(fā)展和人民生活水平的日益提高，畜產(chǎn)品的安全與品質(zhì)受到關(guān)注[1]。畜牧業(yè)中抗生素的濫用，使得抗生素的弊端日益突出，如產(chǎn)生耐藥性、造成環(huán)境污染、引起畜產(chǎn)品抗生素殘留等[2]。我國自2020年7月1日起，飼糧中禁止添加除中草藥以外的促生長類藥物飼料添加劑[3]，因此，綠色、安全的抗生素替代物成為研究的重點(diǎn)。

肌肉的氧化應(yīng)激狀態(tài)是影響肌肉品質(zhì)的重要因素。研究表明，當(dāng)活性氧(ROS)自由基和活性氮(RNS)自由基的水平高于機(jī)體自身可分解水平時(shí)，機(jī)體氧化還原狀態(tài)失衡，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，其產(chǎn)生的自由基會對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA構(gòu)成損傷，導(dǎo)致肌肉品質(zhì)降低[4]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化損傷作用，從而改善畜產(chǎn)品品質(zhì)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可以改善動物的生長性能、飼料利用率和抗氧化功能[6]。關(guān)于丁酸梭菌對肉雞生長和免疫功能的影響已有一些報(bào)道，但其對胸肌肉品質(zhì)及抗氧化信號通路相關(guān)基因的調(diào)控作用研究較少。因此，本試驗(yàn)旨在研究丁酸梭菌對肉雞屠宰性能、肌肉品質(zhì)、抗氧化功能和Nrf2通路相關(guān)基因表達(dá)的影響，為肉雞肌肉品質(zhì)的改善和丁酸梭菌在飼料中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取360只健康、體重均勻的1日齡愛拔益加(AA)雄性肉仔雞，隨機(jī)分為3組，分別為對照組、抗生素組和丁酸梭菌組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞。對照組飼喂無抗生素基礎(chǔ)飼糧，抗生素組飼喂在無抗生素基礎(chǔ)飼糧中添加75 mg/kg金霉素(市購)的飼糧，丁酸梭菌組飼喂在無抗生素基礎(chǔ)飼糧中添加500 mg/kg丁酸梭菌(由浙江某生物科技股份有限公司提供，活菌數(shù)為1×109CFU/g)的飼糧。基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1994)營養(yǎng)需要配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1，飼糧形式為粉狀。試驗(yàn)期42 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items1～21日齡 1 to 21 days of age22～42日齡 22 to 42 days of age蘇氨酸 Thr0.860.71色氨酸 Trp0.230.20鈣 Ca0.820.73總磷 TP0.650.57

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在浙江惠嘉生物科技股份有限公司試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)雞飼養(yǎng)于同一雞舍內(nèi)，每個(gè)重復(fù)1籠，自由采食和飲水，24 h光照，以重復(fù)為單位記錄飼糧投放量。免疫接種及疾病預(yù)防、消毒按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)第42天，以重復(fù)為單位空腹稱重。隨后，每個(gè)組中各選取生長狀況相近的8只試驗(yàn)雞(每個(gè)重復(fù)1只)空腹12 h后屠宰采樣。屠宰前對每只試驗(yàn)雞進(jìn)行分別稱重，記錄活重和全凈膛重，采用游標(biāo)卡尺測量胸肌的肌間脂肪寬度(胸骨側(cè)突部位)和皮下脂肪厚度(從尾根部切線向上沿第一切線剝離2側(cè)皮膚，測量剝離皮膚的部位)并記錄。采集肉雞的左側(cè)胸肌稱重后用于肉品質(zhì)檢測，采集右側(cè)胸肌樣品用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存，用于后期常規(guī)化學(xué)成分和抗氧化功能檢測。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 屠宰性能

屠宰率(%)=(屠體重/宰前體重)×100； 全凈膛率(%)=(全凈膛重/宰前體重)×100； 胸肌率(%)=(胸肌重/全凈膛重)×100； 腹脂率(%)=(腹脂重/全凈膛重)×100。

1.4.2 胸肌肉品質(zhì)和常規(guī)化學(xué)成分測定

根據(jù)Liu等[7]描述的方法分別，對肉雞胸肌肉色[亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)]、滴水損失、蒸煮損失以及宰后45 min和24 h的pH進(jìn)行測定。肌肉肉色使用色差儀(CX0857,ColorFlex EZ,HunterLab)測定，肌肉pH使用裝載肌肉專用電極的pH計(jì)(HI99121,Hanna Instruments,Inc.)測定。胸肌的常規(guī)化學(xué)成分即水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量的測定參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[8-11]進(jìn)行，測定使用的主要儀器包括脂肪測定儀(SOX406，海能儀器股份有限公司)、自動定氮儀(華燁KDN-103A，上海纖檢儀器有限公司)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-8，上海錦屏儀器儀表有限公司)和陶瓷纖維馬弗爐(SX2-4-10NP，廣州越特科學(xué)儀器有限公司)等。

1.4.3 胸肌抗氧化功能測定

剪取0.15～0.20 g胸肌組織樣品于2 mL勻漿管中，并加入9倍體積預(yù)冷的生理鹽水與適量滅菌勻漿珠，利用勻漿儀(DS1000，湖北新縱科病毒疾病工程技術(shù)有限公司)進(jìn)行勻漿，隨后4 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液于-80 ℃冰箱保存待用。按照檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書依次檢測樣品的總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC，F(xiàn)e2+還原法)和總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD，羥胺法)、過氧化氫酶(catalase，CAT，鉬酸銨法)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx，酶促比色法)活性以及丙二醛(malondialdehyde，MDA，硫代巴比妥酸法)含量。參考Ibrahim等[12]描述的方法，提取肉雞胸肌的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，利用熒光定量試劑盒測定抗氧化相關(guān)基因——Nrf2、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)、GPx1、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)、CAT和血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO1)的mRNA相對表達(dá)量，目的基因引物序列見表2。

表2 目的基因引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行初步整理，利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 丁酸梭菌對肉雞屠宰性能的影響

由表3可知，與對照組相比，丁酸梭菌組肉雞末重、屠宰率和全凈膛率顯著提高(P<0.05)，抗生素組肉雞屠宰率、全凈膛率和肌間脂肪寬度顯著提高(P<0.05)?？股亟M和丁酸梭菌組間肉雞末重、屠宰率、全凈膛率、胸肌率和肌間脂肪寬度無顯著差異(P>0.05)，各組間肉雞腹脂率和皮下脂肪厚度均無顯著差異(P>0.05)。

表3 丁酸梭菌對肉雞屠宰性能的影響

2.2 丁酸梭菌對肉雞胸肌肉品質(zhì)的影響

由表4可知，與對照組相比，丁酸梭菌組肉雞胸肌屠宰后24 h的a*值和pH顯著提高(P<0.05)，胸肌屠宰后24 h的L*值和蒸煮損失顯著降低(P<0.05)。丁酸梭菌組肉雞胸肌蒸煮損失顯著低于抗生素組(P<0.05)。

表4 丁酸梭菌對肉雞胸肌肉品質(zhì)影響

2.3 丁酸梭菌對肉雞胸肌常規(guī)化學(xué)成分的影響

由表5可知，與對照組相比，丁酸梭菌組肉雞胸肌粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量顯著提高(P<0.05)，抗生素組肉雞胸肌粗蛋白質(zhì)含量顯著提高(P<0.05)。各組間肉雞胸肌水分、有機(jī)物和粗灰分含量均無顯著差異(P>0.05)。

表5 丁酸梭菌對肉雞胸肌常規(guī)化學(xué)成分的影響

2.4 丁酸梭菌對肉雞胸肌抗氧化功能的影響

由表6可知，與對照組相比，丁酸梭菌肉雞胸肌T-SOD和GPx活性和T-AOC顯著提高(P<0.05)，胸肌MDA含量顯著降低(P<0.05)；抗生素組肉雞胸肌T-SOD活性顯著提高(P<0.05)，胸肌MDA含量顯著降低(P<0.05)。各組間肉雞胸肌CAT活性無顯著差異(P>0.05)。

表6 丁酸梭菌對肉雞胸肌抗氧化功能的影響

2.5 丁酸梭菌對肉雞胸肌抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表7可知，與對照組相比，丁酸梭菌組肉雞胸肌Nrf2、GPx1、SOD1和HO1的mRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，Keap1的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；抗生素組肉雞胸肌Nrf2和HO1的mRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。丁酸梭菌組肉雞胸肌Keap1的mRNA相對表達(dá)量顯著低于抗生素組(P<0.05)。各組間肉雞胸肌CAT和SOD2的mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

表7 丁酸梭菌對肉雞胸肌抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 丁酸梭菌對肉雞屠宰性能的影響

研究表明，給仔豬飼喂添加1%丁酸梭菌的飼糧能顯著提高斷奶仔豬的平均日增重，當(dāng)丁酸梭菌添加量提高到3%時(shí)，料重比顯著降低[13]。另有研究表明，飼糧添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合益生菌添加劑可提高育肥豬的生長性能[14]。趙旭[15]研究表明，丁酸梭菌可通過調(diào)節(jié)肉雞胰島素、甲狀腺素、生長激素、胰高血糖素、瘦素和游離三碘甲狀腺原氨酸水平調(diào)控肉雞脂肪代謝。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加500 mg/kg丁酸梭菌能夠顯著提高肉雞的末重、屠宰率、全凈膛率和肌間脂肪寬度，這與前人研究結(jié)果一致。這可能是丁酸梭菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)促進(jìn)了雙歧桿菌、乳酸菌和糞桿菌等腸道有益菌群的增殖，從而促進(jìn)動物機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝吸收，提高營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而改善動物的生長和屠宰性能[16]。本試驗(yàn)中，抗生素組和丁酸梭菌組之間肉雞末重、屠宰率、全凈膛率、胸肌率、腹脂率、肌間脂肪寬度和皮下脂肪厚度均無顯著差異，提示丁酸梭菌作為抗生素替代品用于提高肉雞屠宰性能具有良好的應(yīng)用潛力。

3.2 丁酸梭菌對肉雞胸肌肉品質(zhì)的影響

肉品質(zhì)作為一個(gè)綜合性狀，其特性被概括為感官品質(zhì)、加工品質(zhì)、營養(yǎng)價(jià)值和衛(wèi)生質(zhì)量4個(gè)方面，能直接反映肉品質(zhì)的測定指標(biāo)主要包括色澤、pH、滴水損失、蒸煮損失及嫩度等[17-18]。在肌肉色澤測定中，一般L*值越小，表明肌肉的顏色越淺，肌肉不發(fā)白，肉質(zhì)越好；a*值越高，表示肌肉顏色更好；b*值越低，表示肌肉顏色越好[19]。pH對肌肉的顏色、系水力、風(fēng)味、嫩度和保質(zhì)期均有影響，是肉品質(zhì)性狀的一個(gè)重要指標(biāo)[20]。肌肉系水力一般是指肌肉的保水能力，通常用滴水損失和蒸煮損失來進(jìn)行評估。滴水損失是指肌肉僅在重力作用下?lián)p失的液體重，蒸煮損失則是指肌肉在蒸煮過程中水分損失的百分比，通常認(rèn)為，肌肉的滴水損失和蒸煮損失越低，系水力越高[7]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧添加丁酸梭菌顯著降低了肉雞胸肌蒸煮損失和24 h的L*值，顯著提高了胸肌24 h的a*值和pH，提示丁酸梭菌可有效改善肉雞胸肌肉品質(zhì)。同時(shí)，與抗生素組相比，丁酸梭菌組肉雞胸肌蒸煮損失顯著降低，提示丁酸梭菌在調(diào)節(jié)肉雞肌肉保水性能方面優(yōu)于抗生素。

3.3 丁酸梭菌對肉雞胸肌常規(guī)化學(xué)成分的影響

研究表明，腸道菌群可以通過調(diào)控與脂肪代謝相關(guān)酶的mRNA表達(dá)量和對血液生化指標(biāo)、腹脂率、肝脂率的影響來調(diào)控機(jī)體脂肪代謝[21]。Huang等[22]研究表明，丁酸梭菌可調(diào)節(jié)腸道微生物菌群組成，促進(jìn)有益微生物菌群生長。因此，丁酸梭菌可能通過調(diào)控肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)以間接調(diào)節(jié)肉雞肌肉脂肪代謝。Zhao等[21]研究表明，飼糧添加丁酸梭菌可增強(qiáng)脂肪生成，顯著提高肉雞肌內(nèi)脂肪的含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加丁酸梭菌可顯著提高42日齡肉雞胸肌粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量，這可能是由于丁酸梭菌的代謝產(chǎn)物丁酸對肉雞腸道微生物生態(tài)環(huán)境的形成具有促進(jìn)作用，而健康的腸道微生物環(huán)境有利于動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和脂肪沉積[23]。此外，肌紅蛋白含量是影響肌肉a*值的重要因素之一，二者呈正相關(guān)關(guān)系，a*值越高表明肌肉中粗蛋白質(zhì)含量越高[24-25]，這與本試驗(yàn)中肉色結(jié)果相符，說明丁酸梭菌可能通過提高肉雞胸肌肌紅蛋白含量改善肉品質(zhì)。

3.4 丁酸梭菌對肉雞胸肌抗氧化功能的影響

Nrf2作為一種含堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛表達(dá)于機(jī)體的各個(gè)組織器官中，是細(xì)胞解毒反應(yīng)和抗氧化的主要調(diào)控因子[5]。Keap1是一種富含半胱氨酸的細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白結(jié)合蛋白，正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1偶聯(lián)呈抑制狀態(tài)，當(dāng)遭受氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2發(fā)生去磷酸化并與Keap1解偶聯(lián)，使其活性激活，參與抗氧化反應(yīng)[26]。同時(shí)，Nrf2對機(jī)體超氧化物歧化酶、CAT、GPx和HO1具有調(diào)控作用[27-28]。Nrf2信號通路激活，通路上相關(guān)抗氧化基因表達(dá)量提高，刺激機(jī)體對相關(guān)抗氧化酶蛋白的轉(zhuǎn)錄，其中，T-SOD和CAT具有清除超氧自由基和過氧化物以及減少羥基自由基形成的功能[29]。T-AOC是反映機(jī)體總抗氧化能力高低的重要指標(biāo)，MDA含量提高提示機(jī)體脂質(zhì)氧化程度增加[30]。前人研究表明，丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸等物質(zhì)可通過降低ROS代謝物和提高抗氧化酶活性參與機(jī)體的抗氧化活動[31-32]。研究報(bào)道，丁酸鈉可以緩解肉雞由皮質(zhì)醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，提高肉雞胸肌肉CAT活性并降低MDA含量[32]。相關(guān)報(bào)道亦指出，丁酸可改善腸黏膜的抗氧化功能，而丁酸梭菌是一種重要的產(chǎn)丁酸菌，飼糧添加丁酸梭菌可顯著提高豬腸道內(nèi)容物中丁酸含量[6]。本試驗(yàn)中，飼糧添加500 mg/kg丁酸梭菌可以顯著提高肉雞胸肌抗氧化相關(guān)基因Nrf2、GPx1、SOD1和HO1的mRNA相對表達(dá)量，顯著降低胸肌Keap1的mRNA相對表達(dá)量，顯著提高胸肌T-SOD和GPx活性以及T-AOC，顯著降低胸肌MDA含量。丁酸梭菌對肉雞抗氧化功能的改善作用一部分可能是部分代謝產(chǎn)物能夠激活機(jī)體細(xì)胞中的Nrf2信號通路，進(jìn)而刺激相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高相關(guān)抗氧化酶蛋白的轉(zhuǎn)錄；另一部分源于其代謝產(chǎn)物丁酸鹽本身具有抗氧化的作用，能夠直接參與機(jī)體氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)。本試驗(yàn)中，飼喂添加抗生素飼糧的肉雞僅表現(xiàn)出胸肌Nrf2和HO1的mRNA相對表達(dá)量和胸肌T-SOD活性的提高以及胸肌MDA含量的降低，提示丁酸梭菌緩解肉雞氧化應(yīng)激的能力在一定程度上優(yōu)于抗生素。

4 結(jié) 論

飼糧添加丁酸梭菌可提高肉雞末重，改善屠宰性能、胸肌肉品質(zhì)以及粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量，激活Nrf2信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)肌肉抗氧化功能，表明丁酸梭菌可作為抗生素替代物應(yīng)用于肉雞飼糧。