單春喬 劉秋晨 李 娟 劉 恩 陸繼爽 劉 艷,*

(1.大連三儀生物工程研究所，大連116036；2.江蘇三儀科研質(zhì)量控制中心，邳州221300)

家禽是全球范圍內(nèi)廣泛生產(chǎn)加工的肉用動物。過去，使用抗生素促進(jìn)家禽生長和控制腸道疾病是一種常態(tài)。但是，在禁抗政策大環(huán)境下，綠色環(huán)保的抗生素替代制劑成為了研究熱點，并取得了一些成功，抗生素替代制劑具有作為生長促進(jìn)劑的功能，并具有調(diào)節(jié)腸道菌群的有益作用。其中，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是重要的生長因子家族成員，具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運，促進(jìn)細(xì)胞分化、生長、遷移、增殖、免疫，促進(jìn)傷口和骨骼愈合等生物學(xué)功能。EGF對細(xì)胞過程的刺激作用是通過與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)結(jié)合以及EGF與EGFR相互作用而誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)而產(chǎn)生的[1]。有研究表明，EGF具有耐酸、耐蛋白酶消化和耐熱的良好性質(zhì)，因而可以長時間作用于腸道，提高腸細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力[2]。EGF可通過鈉離子通道蛋白及中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白等的調(diào)節(jié)作用促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[3]。研究發(fā)現(xiàn)，EGF能誘導(dǎo)多種動物的減數(shù)分裂恢復(fù)，包括大鼠[4]、人和小鼠[5]、狗[6]、羊[7]、馬[8]和豬[9]。EGF的刺激作用是豬卵母細(xì)胞成熟的重要因素，EGF對卵母細(xì)胞的刺激作用不僅影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且影響高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的相互作用，而這種作用是由轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的[10]。已有研究表明，斷奶仔豬灌服表達(dá)EGF的重組釀酒酵母菌發(fā)酵液可以顯著提高各段小腸絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度及其蛋白質(zhì)、DNA與RNA的表達(dá)，降低腸上皮細(xì)胞的通透性[11]。Ge等[12]認(rèn)為EGF可能是雞生殖細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子，并可能調(diào)節(jié)胚胎性腺的生殖細(xì)胞增殖。綜上所述，研究通過EGF緩解和改善畜牧生產(chǎn)過程中的不利影響一直都是畜牧業(yè)備受關(guān)注的熱點問題。然而，目前國內(nèi)外有關(guān)EGF的報道都集中在哺乳動物方面，而有關(guān)EGF在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用研究鮮有報道。因此，本試驗旨在研究EGF對不同日齡肉雞十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)、消化酶活性以及EGFR表達(dá)的影響，以期為EGF在肉雞養(yǎng)殖中進(jìn)一步推廣和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試驗設(shè)計

EGF為可溶性粉劑。鹽酸金霉素購于美國Sigma公司。

選擇72只1日齡健康的愛拔益加(AA)肉雞，隨機分成4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)6只。對照組(CK組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素組(K組)在基礎(chǔ)飼糧中添加250 mg/kg鹽酸金霉素，EGF組(E組)在基礎(chǔ)飼糧中添加500 mg/kg EGF，EGF+抗生素組(E+K組)在基礎(chǔ)飼糧中添加500 mg/kg EGF+250 mg/kg鹽酸金霉素。試驗期為42 d。

1.2 基礎(chǔ)飼糧和飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1994)和《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表》(2018年第29版)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。肉雞飼養(yǎng)于鐵絲籠中，整個飼養(yǎng)過程中自由采食和飲水。試驗第1周室溫32 ℃，光照24 h；之后室溫每周降低2 ℃，直至24 ℃，同時光照23 h。所有肉雞在7和13日齡接種新城疫滅活疫苗，20日齡接種傳染性法氏囊病活疫苗。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

分別在肉雞21、28、35、42日齡時，各組每個重復(fù)隨機挑選1只肉雞進(jìn)行屠宰(屠宰前不禁食)，采取頸動脈放血致死，結(jié)扎并采集十二指腸中上部組織樣品2 cm2，并用磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，濾紙吸干，放入加有4%多聚甲醛的離心管中，4 ℃保存，用于觀察十二指腸的形態(tài)結(jié)果及原位雜交；另外，取十二指腸內(nèi)容物(約10 g)并用4層紗布過濾，置于10 mL離心管中，立即放入液氮中，之后于-80 ℃冰箱中凍存，用于消化酶活性測定。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 十二指腸消化酶活性測定

采用雙抗體夾心法分別測定肉雞十二指腸內(nèi)容物樣品中堿性蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶活性，檢測方法按照試劑盒說明書操作，試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4.2 十二指腸EGFR原位雜交

采用熒光原位雜交技術(shù)(詳細(xì)方法參見文獻(xiàn)[13])，將雙側(cè)地高辛標(biāo)記的已知順序的核酸探針與組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位。EGFR探針信息如下：5′-DIG-GCCGCAGGTAAAGACCGATGCCTAGACCAA-DIG-3′。

1.4.3 十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)

將4%甲醛溶液固定的十二指腸的腸段包埋于液體石蠟中，凝固后以5 μm的厚度切片，采用蘇木精-伊紅(HE)染色法進(jìn)行染色并封片。在顯微鏡下隨機選取10個視野進(jìn)行拍照，分別量取十二指腸的絨毛高度和隱窩深度，并計算絨毛高度/隱窩深度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用SPSS 24.0、CaseViewer和Image-pro plus數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，作圖軟件使用Graphpad prism 8.0，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析(one-way ANOVA)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 EGF對肉雞十二指腸消化酶活性的影響

2.1.1 EGF對肉雞十二指腸堿性蛋白酶活性的影響

由表2可見，21日齡時，K組十二指腸堿性蛋白酶活性顯著低于其他各組(P<0.05)，E+K組十二指腸堿性蛋白酶活性稍高于E組(P>0.05)；28、35、42日齡時，各組十二指腸堿性蛋白酶活性無顯著差異(P>0.05)，但E組十二指腸堿性蛋白酶活性均為最高。

表2 EGF對肉雞十二指腸堿性蛋白酶活性的影響

2.1.2 EGF對肉雞十二指腸脂肪酶活性的影響

由表3可見，21、28、35、42日齡時，各組十二指腸脂肪酶活性無顯著差異(P>0.05)，但E組十二指腸脂肪酶活性均為最高。

表3 EGF對肉雞十二指腸脂肪酶活性的影響

2.1.3 EGF對肉雞十二指腸α-淀粉酶活性的影響

由表4可見，21日齡時，各組十二指腸α-淀粉酶活性無顯著差異(P>0.05)；28日齡時，E+K組α-淀粉酶活性顯著低于CK組和E組(P<0.05)；35日齡時，E組十二指腸α-淀粉酶活性顯著高于CK組和E+K組(P<0.05)；42日齡時，E組十二指腸α-淀粉酶活性極顯著高于K組和E+K組(P<0.01)。

表4 EGF對肉雞十二指腸α-淀粉酶活性的影響

2.2 十二指腸EGFR原位雜交檢測

圖1為21日齡肉雞十二指腸EGFR原位雜交檢測結(jié)果，紅色熒光顯示EGFR陽性，說明目的基因在該位置得到表達(dá)。由表5可見，E組十二指腸EGFR基因平均光密度值顯著高于CK組(P<0.05)，其他各組平均光密度值與CK組無顯著差異(P>0.05)。

圖1 21日齡肉雞十二指腸EGFR原位雜交檢測結(jié)果

圖2為42日齡肉雞十二指腸EGFR原位雜交檢測結(jié)果，紅色熒光顯示EGFR陽性，說明目的基因在該位置得到表達(dá)。由表5可見，E組和K組十二指腸EGFR基因平均光密度值極顯著高于CK組和E+K組(P<0.01)，E組與K組之間十二指腸EGFR基因平均光密度值無顯著差異(P>0.05)。

圖2 42日齡肉雞十二指腸EGFR原位雜交檢測結(jié)果

表5 十二指腸EGFR基因平均光密度值

2.3 EGF對肉雞十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表6可見，21日齡時，K組和E組十二指腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度顯著高于CK組(P<0.05)，各組十二指腸隱窩深度無顯著差異(P>0.05)。28、35和42日齡時，各組十二指腸絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度無顯著差異(P>0.05)。除28日齡E+K組絨毛高度/隱窩深度高于E組外，其余日齡E組絨毛高度/隱窩深度均為最高。

表6 EGF對肉雞十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

3.1 EGF對肉雞十二指腸消化酶活性的影響

消化酶活性是評價家畜生理消化機能的重要指標(biāo)之一，具有種類和年齡特異性、敏感性及短潛伏期等特點，動物對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的能力主要取決于其消化道內(nèi)消化酶活性的高低，因此通常被認(rèn)為是能夠反映個體營養(yǎng)狀況的可靠指標(biāo)[14-15]。研究表明，與飼喂基礎(chǔ)飼糧相比，添加EGF可顯著提高斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸的淀粉酶活性，顯著提高空腸和回腸的脂肪酶活性；空腸段乳糖酶和蔗糖酶活性顯著上升，各酶活性均與自然哺乳組無統(tǒng)計學(xué)差異[16]。堿性蛋白酶參與脂肪吸收和管腔致病細(xì)菌脂多糖的解毒，被認(rèn)為是一種腸細(xì)胞分化標(biāo)志酶[17]。堿性蛋白酶、肌酸激酶、乳酸脫氫酶(LDH)和蔗糖酶等刷狀緣酶被用作絨毛成熟的細(xì)胞標(biāo)記物，其活性也可作為小腸損傷的標(biāo)記物[18]。同樣的試驗結(jié)果也表明，斷奶仔豬口服EGF可提高空腸乳糖酶、蔗糖和堿性磷酸酶活性，改善生長性能。消化酶活性的提高可能促進(jìn)了斷奶仔豬胃腸道的發(fā)育和免疫功能。家禽的胰腺可以分泌羧基肽酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶等，其中胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶是家禽腸道內(nèi)十分重要的消化酶，其活性的高低影響消化、吸收以及利用營養(yǎng)物質(zhì)的效率[19]。本研究結(jié)果表明，EGF能夠改善十二指腸堿性蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶活性，這表明EGF能夠在動物的腸道中促進(jìn)酶原轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生消化酶，EGF與消化酶一起促進(jìn)小腸吸收養(yǎng)分，進(jìn)而提高肉雞對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的能力，從而促進(jìn)肉雞生長。這可能是由于EGF抑制了絨毛細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致絨毛邊緣酶活性升高。EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激腸上皮細(xì)胞增殖，還可能通過影響促凋亡和抗凋亡B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)基因家族成員的表達(dá)來降低腸上皮細(xì)胞凋亡率的增加[20]。先前的報道也表明，EGF可能調(diào)控尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(Cdx2)在小腸刷狀緣的增殖和遷移，在這些仔豬中，堿性蛋白酶、肌酸激酶、乳酸脫氫酶和蔗糖酶等消化酶mRNA表達(dá)的增加與其活性增加的趨勢是一致的[21]。

3.2 十二指腸EGFR原位雜交檢測

原位雜交是一種雜交類型，它使用標(biāo)記的互補DNA或RNA鏈將特定的DNA或RNA序列定位在固定在載玻片上的組織的染色體或切片上。原位雜交被公認(rèn)為有較高的可靠性、靈敏度和特異性，要求較低、成本低，目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的病理檢查。石蠟切片地高辛熒光原位雜交(TSA)可大量快速制備探針，而且獲得的探針純度高、特異性強，與放射性標(biāo)記相比，還具有安全和方便等優(yōu)點[22]。本試驗創(chuàng)新應(yīng)用石蠟切片地高辛熒光原位雜交法檢測EGFR在腸道內(nèi)的表達(dá)情況。EGF作為一種功能性蛋白質(zhì)，只有當(dāng)其與體內(nèi)的EGFR結(jié)合激活相應(yīng)信號通路時才能夠真正發(fā)揮作用。因此EGFR的多少對EGF起著限制性作用。雖然在畜禽方面EGF的相關(guān)研究較為匱乏，但在人醫(yī)上的研究相對較多。有研究表明，EGF能夠誘導(dǎo)EGFR表達(dá)量的升高，進(jìn)而促進(jìn)EGF發(fā)揮生理功效[23-24]。本試驗結(jié)果表明，21、42日齡E組二指腸EGFR基因平均光密度值高于CK組，從圖1和圖2可以更加直觀地看出E組目的基因在十二指腸段被大量檢測到。由此表明，飼糧添加EGF可以提高肉雞十二指腸EGFR的表達(dá)，與前人的研究結(jié)果一致。

3.3 EGF對肉雞十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

腸道最重要的生理功能是充當(dāng)屏障并促進(jìn)吸收[25]，小腸是營養(yǎng)吸收的重要部位之一[26]。腸吸收細(xì)胞起源于隱窩的底部，是未成熟的增殖細(xì)胞，隨著它們向絨毛頂端遷移而分化，最后從絨毛頂端擠出[25]。腸道絨毛高度和隱窩深度是重要的形態(tài)學(xué)參數(shù)，被認(rèn)為是反映腸功能的最佳指標(biāo)。絨毛高度增加誘導(dǎo)隱窩上皮細(xì)胞增殖，其高度越高，隱窩深度越淺；絨毛高度/隱窩深度越高表明成熟腸上皮細(xì)胞數(shù)量越多，成熟度越高，消化酶的合成和分泌加快，并能夠更好地吸收有效營養(yǎng)，增強腸道功能[27-28]。本試驗結(jié)果表明，21日齡時，E組的十二指腸絨毛高度/隱窩深度顯著高于CK組，這表明EGF能夠顯著影響生長前期肉禽小腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)，使小腸的絨毛高度增加，絨毛高度/隱窩深度變大，從而增強肉雞小腸吸收的能力，為小腸吸收營養(yǎng)物質(zhì)奠定了生理基礎(chǔ)。研究表明，EGF可在早產(chǎn)條件下參與增強全身和腸道免疫系統(tǒng)的成熟[29]。同樣有研究表明，EGF是主要的腸營養(yǎng)因子，可促進(jìn)腸黏膜的生長并增加腸道的適應(yīng)性[30]。因此，飼糧中添加EGF可以增強腸道功能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。近年來，隨著對EGF深入的研究，EGF作為飼料添加劑在肉雞養(yǎng)殖中具有十分廣闊的應(yīng)用場景。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加500 mg/kg EGF能改善肉雞十二指腸堿性蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶活性。

② 飼糧中添加500 mg/kg EGF能提高肉雞十二指腸EGFR的表達(dá)。

③ 飼糧中添加500 mg/kg EGF能增加肉雞十二指腸絨毛高度/隱窩深度，促進(jìn)腸道發(fā)育。