張 陽 呂慧源 徐盛玉 方正鋒 馮 斌 車煉強 林 燕 卓 勇 李 健 江雪梅 趙希侖 吳 德*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，成都611130；2.北京生泰爾生物科技有限公司，北京102600)

在我國，由于生產(chǎn)者對動物福利，特別是對生長育肥豬動物福利的重視程度不夠，導(dǎo)致其在簡陋的飼養(yǎng)環(huán)境、粗放的飼養(yǎng)管理、隨意的用藥與免疫的影響下遭受著多種應(yīng)激[1-2]，這一方面降低其生產(chǎn)性能[3]，另一方面降低其免疫防御和調(diào)節(jié)能力，影響動物健康[4]。為了提高其生長性能、促進(jìn)其健康，在生長育肥豬飼糧中添加復(fù)合益生菌制劑以及黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)等動物保健類飼料添加劑成為飼料抗生素禁用后的研究熱點。有研究指出，益生菌可促進(jìn)中草藥的吸收利用[5-8]，中草藥可促進(jìn)益生菌的增殖代謝[9-10]，這奠定了復(fù)合益生菌與APS混合使用的理論基礎(chǔ)。在國內(nèi)，李樹鵬[11]首次開展將APS與益生菌結(jié)合用于家養(yǎng)動物生產(chǎn)的研究，并發(fā)現(xiàn)APS和益生菌組成的合生元顯著提高了雛雞的生長性能，但并不比單一添加效果好；APS和益生菌在體內(nèi)外均具有抑制有害菌的效果，APS在體外試驗中對乳酸菌、芽孢桿菌也具有抑制效果；合生元對有害菌的抑制效果比單一添加更為顯著。劉明生等[12]通過研究證實了APS與益生菌組成的合生元在雞上的應(yīng)用效果。呂鑫[13]和李亞杰[14]在雞上的研究則驗證了APS和益生菌組成的合生元在生產(chǎn)性能、免疫等方面較單一添加的優(yōu)勢。岑路等[15]報道，索比亞益生菌具有顯著的防治口蹄疫和提高口蹄疫疫苗保護(hù)的作用，同時還可促進(jìn)仔豬的生長，且添加APS有明顯的協(xié)同作用。學(xué)者們在以雞為主的家養(yǎng)動物上的研究證實了復(fù)合益生菌與APS混合使用時具有較好的應(yīng)用效果，但目前在生長育肥豬上少有相關(guān)研究，且二者互作效應(yīng)尚未得到證實。弄清二者在動物上的互作效應(yīng)，是合理使用的前提。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加復(fù)合益生菌對生長后期的生長育肥豬平均日采食量和料重比有所提高，并降低糞便微生物中厚壁菌門與擬桿菌門的比值和糞中短鏈脂肪酸含量；飼糧添加APS顯著降低生長育肥豬糞便微生物多樣性；復(fù)合益生菌和APS對生長育肥豬糞便微生物中乳桿菌屬和毛螺菌科XPB1014群屬相對豐度的互作效應(yīng)表現(xiàn)為拮抗作用[16]。復(fù)合益生菌與APS對于生長育肥豬的生長性能未見互作效應(yīng)，在糞便微生物上的互作效應(yīng)也不具有協(xié)同作用，那么二者對于免疫和抗氧化功能的影響又是如何？本研究將著重考察復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬免疫和抗氧化功能的影響，為復(fù)合益生菌和APS的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

復(fù)合益生菌制劑購于某公司，有效成分為枯草芽孢桿菌、嗜乳酸桿菌和屎腸球菌，活菌數(shù)>5×108CFU/g。APS來源于某公司，有效成分及含量為：黃芪多糖200 mg/g，黃芩苷22 mg/g，綠原酸2.2 mg/g。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用2×2雙因素試驗設(shè)計，選取80頭健康狀況、體重[(33.5±0.8) kg]相近的“杜×長×大”生長豬，隨機分為4組(每組5個重復(fù)，每個重復(fù)4頭豬)，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)、基礎(chǔ)飼糧+5×108CFU/kg復(fù)合益生菌(復(fù)合益生菌組)、基礎(chǔ)飼糧+0.1%APS(APS組)、基礎(chǔ)飼糧+5×108CFU/kg復(fù)合益生菌+0.1%APS(復(fù)合益生菌+APS組)。試驗期為84 d。

1.3 基礎(chǔ)飼糧

試驗用基礎(chǔ)飼糧為參照NRC(2012)25～110 kg營養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼料，其組成及營養(yǎng)水平同文獻(xiàn)[16]。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所動物試驗農(nóng)場進(jìn)行。圈舍消毒后轉(zhuǎn)入試驗豬只，分組分重復(fù)關(guān)好，同一重復(fù)豬只關(guān)在同一個圈中。每天飼喂3次(08：00、14：00和20：00)，使豬只全期自由采食，充足飲水，給予豬只適宜的生長環(huán)境，豬舍定期消毒。

1.5 樣品采集

于試驗第29天、第57天和第85天清晨每個重復(fù)隨機選取1頭健康的豬，空腹采血5 mL于普通采血管中，采血2 mL于含肝素鈉的抗凝管中。普通采血管中血樣靜置2 h后于3 000 r/min離心10 min，取血清分裝于1.5 mL離心管中，于-20 ℃保存待測；含肝素鈉的抗凝采血管中血樣送檢作T淋巴細(xì)胞亞群分析。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 免疫指標(biāo)

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，結(jié)合酶標(biāo)儀測定第29天、第57天和第85天血清樣品中溶菌酶(lysozyme，LZM)的活性。

試驗第29天、第57天和第85天清晨采血后，立即將裝于肝素鈉抗凝管中的血樣送至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所實驗室進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+和CD8+)分析。

采用江蘇晶美科技有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，結(jié)合酶標(biāo)儀測定血清中白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的含量。

1.6.2 抗氧化指標(biāo)

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，結(jié)合酶標(biāo)儀測定血清中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的活性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，采用SAS 9.2中的MIXED模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析，包括復(fù)合益生菌效應(yīng)、APS效應(yīng)及二者互作效應(yīng)。正態(tài)性和方差同質(zhì)性分別通過Shapiro-Wilk檢驗和Levene檢驗進(jìn)行評估。如果2個因素之間不存在互作效應(yīng)，進(jìn)行主效應(yīng)分析；如果2個因素之間存在互作效應(yīng)則進(jìn)行簡單主效應(yīng)分析。結(jié)果以平均值(mean)和集合標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)的形式表示。以P<0.01作為極顯著性差異，P<0.05作為顯著性差異，0.05≤P<0.10作為趨勢性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬血清LZM活性的影響

由表1可知，飼糧添加復(fù)合益生菌顯著提高第57天和第85天生長育肥豬血清LZM活性(P<0.05)，有提高第29天血清LZM活性的趨勢(P=0.068)；飼糧添加APS有提高第29天血清LZM活性的趨勢(P=0.090)；復(fù)合益生菌與APS對血清LZM活性不存在互作效應(yīng)(P>0.05)。

表1 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬血清LZM活性的影響

2.2 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

由表2可知，復(fù)合益生菌與APS對第29天和第57天生長育肥豬外周血CD4+T淋巴細(xì)胞/CD4+T淋巴細(xì)胞(CD4+/CD8+)值、第29天CD3+T淋巴細(xì)胞比例以及第57天CD4+T淋巴細(xì)胞比例存在互作效應(yīng)(P<0.01)，對第29天CD4+T淋巴細(xì)胞比例存在互作趨勢(P=0.075)。第29天，與對照組相比，APS組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞比例、CD3+T淋巴細(xì)胞比例以及CD4+/CD8+值顯著降低(P<0.05)；與復(fù)合益生菌組相比，復(fù)合益生菌+APS組外周血CD3+T淋巴細(xì)胞比例、CD4+T淋巴細(xì)胞比例以及CD4+/CD8+值無顯著差異(P>0.05)。第57天，與對照組相比，APS組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞比例和CD4+/CD8+值極顯著提高(P<0.01)；與復(fù)合益生菌組相比，復(fù)合益生菌+APS組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞比例和CD4+/CD8+值無顯著差異(P>0.05)。由此可以看出，APS通過影響CD4+T淋巴細(xì)胞比例調(diào)節(jié)CD4+/CD8+值維持在一定范圍，而復(fù)合益生菌的添加對APS的調(diào)節(jié)存在一定的抑制作用。

表2 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

2.3 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬血清細(xì)胞因子含量的影響

由表3可知，飼糧添加復(fù)合益生菌極顯著提高第85天生長育肥豬血清TNF-α含量(P<0.01)，顯著提高第85天血清IFN-γ含量(P<0.05)；飼糧添加APS有提高第85天血清IFN-γ(P=0.067)和IL-2含量(P=0.093)的趨勢。復(fù)合益生菌與APS對第85天血清IL-6含量存在互作趨勢(P=0.055)，與對照組相比，APS組第85天血清IL-6含量有降低的趨勢(P=0.055)；與復(fù)合益生菌組相比，復(fù)合益生菌+APS組第85天血清IL-6含量無顯著差異(P>0.05)。

表3 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬血清細(xì)胞因子含量的影響

2.4 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，復(fù)合益生菌與APS對第57天生長育肥豬血清GSH-Px活性存在互作效應(yīng)(P<0.05)。與對照組相比，復(fù)合益生菌組第57天血清GSH-Px活性極顯著提高(P<0.01)；與APS組相比，復(fù)合益生菌+APS組第57天血清GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)。

表4 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬血清ALT和AST活性的影響

由表5可知，飼糧添加復(fù)合益生菌極顯著提高第85天生長育肥豬血清AST活性(P<0.01)。復(fù)合益生菌與APS對第29天血清ALT活性存在互作效應(yīng)(P<0.05)，與對照組相比，復(fù)合益生菌組第29天血清ALT活性顯著提高(P<0.05)；與APS組相比，復(fù)合益生菌+APS組第29天血清ALT活性則無顯著差異(P>0.05)。

表5 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬血清ALT和AST活性的影響

3 討 論

3.1 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬免疫功能的影響

3.1.1 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬非特異性免疫的影響

LZM是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，具有溶菌和增強免疫力等作用，血清中LZM活性的提高可增強豬只抗腸道大腸桿菌和輪狀病毒的能力，對豬只健康生長具有重要意義[17]。朱博[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.2%解淀粉芽孢桿菌有提高仔豬血清LZM活性和免疫球蛋白G含量的趨勢，分別比空白對照組提高了24.14%和16.12%，比陽性對照組提高了43.99%和13.77%。趙素華等[19]在雛雞上的研究發(fā)現(xiàn)，中高劑量的APS口服液顯著提高了21日齡雛雞血清LZM活性，增強了雛雞的非特異性免疫力。本研究結(jié)果顯示，飼糧添加復(fù)合益生菌對3個時間點生長育肥豬血清LZM活性均有提高的作用或趨勢；飼糧添加APS對第29天血清LZM活性也有提高的趨勢；復(fù)合益生菌與APS對血清LZM活性不存在互作效應(yīng)。本試驗單獨添加的結(jié)果與前人研究一致，說明飼糧添加復(fù)合益生菌和APS均可提高生長育肥豬的免疫防御能力；而復(fù)合益生菌與APS混合添加對生長育肥豬血清LZM活性未發(fā)現(xiàn)互作效應(yīng)的原因暫時不得而知，有待進(jìn)一步研究。

3.1.2 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬細(xì)胞免疫的影響

外周血T淋巴細(xì)胞亞群分CD4+輔助/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞和CD8+抑制性/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞。CD4+T淋巴細(xì)胞可協(xié)助B淋巴細(xì)胞分泌抗體和調(diào)節(jié)其他T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，CD8+T淋巴細(xì)胞常表現(xiàn)細(xì)胞毒活性，是主要的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞[20-21]。CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞能夠相互作用來維持機體內(nèi)的免疫平衡，腫瘤、艾滋病等免疫抑制型疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病會引起CD4+/CD8+平衡打亂，導(dǎo)致機體免疫反應(yīng)紊亂[22-23]。豬外周血淋巴細(xì)胞的組成和比例與其他動物有所不同，CD8+T淋巴細(xì)胞比例大于CD4+T淋巴細(xì)胞，在分析了多篇文獻(xiàn)[24-28]后，筆者認(rèn)為豬正常CD4+/CD8+值為0.6～1.0；但也有少量文獻(xiàn)報道，豬正常CD4+/CD8+值為1～2[29-30]，這可能與測定方法和試驗豬只間的差異有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，APS通過影響CD4+T淋巴細(xì)胞比例調(diào)節(jié)CD4+/CD8+值維持在一定范圍，從而起到對機體細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用，而復(fù)合益生菌的添加對APS的調(diào)節(jié)存在一定的抑制作用。

3.1.3 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬細(xì)胞因子的影響

IL-2能增強T淋巴細(xì)胞的殺傷活性，并可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、腫瘤壞死因子和集落刺激因子等細(xì)胞因子[31]；IL-6作為一種促炎因子，通常與TNF-α一起產(chǎn)生，并在病毒感染中扮演重要角色[32-33]；IFN-γ由活化的T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等生物學(xué)作用[34]；TNF-α作為促炎因子，既可以參與機體炎癥反應(yīng)，又可通過促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖分化，產(chǎn)生腫瘤的特異性抗體，發(fā)揮體液免疫協(xié)助抗腫瘤的作用[35]。本研究中，飼糧添加復(fù)合益生菌顯著提高第85天生長育肥豬血清中TNF-α和IFN-γ的含量；飼糧添加APS有提高第85天血清IFN-γ和IL-2含量的趨勢；復(fù)合益生菌與APS對第85天血清IL-6含量存在互作趨勢，單獨添加APS時，血清IL-6含量有降低趨勢。以上結(jié)果表明，飼糧添加復(fù)合益生菌可以提高生長育肥豬血清中促炎因子的含量，從而實現(xiàn)免疫增強的調(diào)節(jié)作用，這與前人的研究結(jié)果[36-37]一致；飼糧添加APS可降低促炎因子、提高相關(guān)抗炎因子IL-2的含量，從而在細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)中發(fā)揮抗炎作用，與前人研究取得一致結(jié)果[38-39]；復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)存在一定的拮抗作用。

3.2 復(fù)合益生菌與APS對生長育肥豬抗氧化功能的影響

抗氧化酶系統(tǒng)具有清除活性氧自由基的功能，是維持動物健康的重要防線。SOD能催化動物機體內(nèi)的自由基歧化反應(yīng)，使得自由基與膜蛋白和膜脂質(zhì)物質(zhì)發(fā)生二次反應(yīng)而破壞細(xì)胞的穩(wěn)定性；GSH-Px是一種重要的抗氧化酶類物質(zhì)，可與SOD協(xié)同作用大幅度降低機體活性氧自由基的產(chǎn)生；MDA是脂質(zhì)過氧化反映的穩(wěn)定產(chǎn)物，具有很強的生物毒性，能破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞腫脹、壞死[40]，MDA含量越高說明體內(nèi)過氧化反映越強烈，細(xì)胞受到的氧化損傷越強。呼紅梅等[41]報道，綠原菌和自制的益生菌(芽孢桿菌、酵母菌)使商品豬血清中抗氧化酶的活性顯著提高，明顯改善了商品豬的抗氧化功能。國外的相關(guān)研究也證實，益生菌可提高抗氧化酶的活性，降低活性氧自由基代謝物進(jìn)而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激[42]。自由基大量累積時，會導(dǎo)致細(xì)胞炎癥、脂肪浸潤，畜禽體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激會導(dǎo)致肝臟損傷，引起肝炎、脂肪肝等多種肝臟疾病[43]。ALT和AST是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)氨酶，通常將二者在血液中的含量變化作為判斷肝臟和心臟健康狀況的依據(jù)[44-45]。韓乾杰[46]研究表明，APS和人參多糖能夠顯著緩解脂多糖刺激引起的仔豬肝臟ALT、AST活性和促炎因子含量的升高，并提高機體的抗氧化功能，對肝臟起到保護(hù)增益的作用。孟祥宇[47]和白雅綺[48]的研究均表明，復(fù)合益生菌制劑對豬血清ALT和AST活性無顯著影響。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)合益生菌與APS對第57天生長育肥豬血清GSH-Px活性存在互作效應(yīng)，復(fù)合益生菌單獨添加時，血清GSH-Px活性顯著提高。但反映肝臟功能的指標(biāo)顯示，飼糧添加復(fù)合益生菌極顯著提高第85天血清AST活性；復(fù)合益生菌與APS對第29天血清ALT活性存在互作效應(yīng)，復(fù)合益生菌單獨添加時，血清ALT活性顯著提高。飼糧添加復(fù)合益生菌使第85天血清AST活性以及第29天血清AST活性提高的原因我們不得而知，但可以看出，APS對血清ALT和GSH-Px活性的升高存在一定程度上的抑制，表明APS對于生長育肥豬抗氧化功能的調(diào)節(jié)也存在一定的維穩(wěn)作用，而復(fù)合益生菌對于生長育肥豬抗氧化功能的影響則存在不穩(wěn)定性，既可能提高其抗氧化功能，也可能會有所降低，其原因可能是復(fù)合益生菌中益生菌定植效果不穩(wěn)定以及菌群調(diào)節(jié)影響因素過多導(dǎo)致。益生菌在生產(chǎn)、加工、貯存和運輸?shù)冗^程中易受外界因素的影響而失活[49]，而活菌劑進(jìn)入畜禽體內(nèi)后，還可能因易受胃中低pH和高膽鹽環(huán)境影響而失活，真正到達(dá)腸道的菌群數(shù)量較少且定植能力不穩(wěn)定[50]。

4 結(jié) 論

① 飼糧添加復(fù)合益生菌可提高生長育肥豬的免疫功能，并在細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)中發(fā)揮免疫增強作用，但對于抗氧化功能的影響則不穩(wěn)定。

② 飼糧添加APS對生長育肥豬的免疫功能具有一定的提高作用，在細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)中主要發(fā)揮抗炎作用，在細(xì)胞免疫中主要發(fā)揮免疫自穩(wěn)作用，并促進(jìn)其氧化平衡狀態(tài)的保持。

③ 復(fù)合益生菌與APS在生長育肥豬細(xì)胞免疫、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)、抗氧化等方面均存在一定互作效應(yīng)，復(fù)合益生菌的添加容易引起血液指標(biāo)大幅度的變化，而APS對于這種大幅度的變化具有抑制作用。